Name: 培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ 合成細菌コンソーシアムとin vitro消化モデルを用いた腸宿主微生物インターフェイスの評価法。病原菌の細胞侵入性とプロバイオティクス製剤の生存性を評価し、食品・製薬・毒性学産業への応用可能性を示します。

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作者は感謝してマルタ カラタユ アロヨ (FWO ポスドク ・ フェローシップ 12N2815N) フランダース研究財団から財政支援を認めます。エマ ・ ヘルナンデス サナブリアはフランダースの技術革新と起業家精神 (Agentschap フォール Innovatie ドア Wetenschap en テク、IWT) でサポートされている研究員。

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口腔マイクロバイは、最近いくつか著者20,21によって報告された人間の健康の重要な要素です。前の調査結果は、大量の細菌を含む唾液の摂取が免疫のプライミングのためメインのサイトの 1 つである小腸の微生物の生態系に影響を与えることができますをお勧めします。ホスト上の微生物のコンポーネントの影響を解明して腸の上皮と粘液分泌細胞によって表されるホスト インターフェイスで静的な上部消化管消化モデルの組み合わせです。
In vitroモデルは、機構研究を実施し、背景知識を減らすため、意図を達成するための研究を行う研究生体内でより効率的より良いターゲットの基本的なツールです。このため、純度、生存率、および合成微生物コミュニティを確立する前に無菌共生栽培の最適な成長を確保する重要です。生存率と分析にバイアスを避けるために、細胞培養への暴露前に細菌群集組成の評価をお勧めします。破損した細菌の数が多い可能性があります接着を妨げるし、さらに細胞モデル...

人間は、細菌細胞の1と同じ数であると同居します。したがって、それは人間のマイクロバイの包括的な理解を得ることが重要重要なは。こうして様々 な細菌やそれらの別の場所でバイオ フィルムを含むいくつかの小さい生息地に分かれていることで口腔内はユニークな環境です。オープンなエコシステムをされて、口の中にいくつかの種は、一時的な訪問者にあります。ただし、特定の微生物を誕生とフォーム編成バイオ2後はすぐに植民地化します。これらは上記の歯肉溝、歯肉縁下の隙間、舌、粘膜表面と歯科補綴、充填3歯の表面で発見されます。細菌はフロックと歯管の内腔の浮遊性細胞壊死の歯髄組織と混合または流体相の中断として存在できます。
アクティブな連続的な宿主細胞と常駐微生物叢4間クロストークがあります。内および種の細菌間で通信し、他の細菌がこれらの主な植民にアタッチしながら、自然の植民の小さい割合だけが組織に付着することが。例えば、微生物間のセル セルの結合、口腔バイオ フィルム、二次植民に統合し、相互作用する微生物電池4の複雑なネットワークの構築にとって重要です。約唾サンプルの細菌の集合体の 70% は正体不明のバクテロイデス門、 Veillonella sp. Prevotellaの sp連鎖球菌sp.についての sp によって形成されます。F. nucleatumは、ポケット内のバイオ フィルムと歯周炎5に関与しているp、t. へとTannerella レンギョウ、後半の植民と集計中間植民です。さらに、連鎖球菌可鍛鋳鉄 s. 血統とs. gordonii歯3を植民地化ことを好む中粘膜と歯科の生息地を占めています。したがって、s. 血統にある下の切歯と犬歯、上部前歯6に放線菌 naeslundiiが見つかったとき。
さらに、先住民マイクロバイは2人の健康を維持する上で役割を果たしています。免疫教育、病原体の膨張を防止する常駐微生物叢が参加しています。この植民地化の抵抗は、サーフェスにアタッチするのに適応しより効率的な成長のための利用可能な栄養素の代謝でのネイティブの細菌をより良い可能性があるために発生します。プロバイオティクス菌株は消化管の通過を生き残るため、アクティブのまま、消化管の上部の場所から飲み込んだ土着菌の永続性が完全に記載されていません。したがって、シミュレートされた胃腸管内輸送条件に人工コミュニティ、口腔生態系の代表を受けます。細菌の細胞の生存率は、腸上皮に似たマルチコンパートメント モデルを使用して評価されました。現在腸シミュレータは、内腔の微生物コミュニティ7の解析の観点から適切な再現性を提供しています。ただし、細菌の付着やホスト微生物間相互作用別に対処、微生物と細胞を組み合わせて、8に挑戦します。対照的に、腸内のインターフェイスで報告されるイベントの成功植民地化の潜在的な機械論的説明を提供するフレームワークを提案する.確かに、このモデル ホスト表面上の微生物の影響を評価する、共同で腸の静的モデルを使用できます。

<table><tbody><tr><td>STRAINS<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Aggregatibacter actinomycetemcomitans </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 43718</td><td></td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 10953</td><td></td></tr><tr><td>Porphyromonas gingivalis </td><td>American Type Cultureコレクション</td><td>ATCC 33277</td><td></td></tr><tr><td>Prevotella intermedia </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25611</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mutans </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25175</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus sobrinus </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 33478</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycesviscosus </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15987<</td><td></td></tr><tr><td>em>Streptococcus salivarius&nbsp;TOVE-R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mitis </em</td><td>>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 49456</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus sanguinis </td><td>BCCM/LMG Bacteria Collection</td><td>LMG 14657</td><td></td></tr><tr><td>Veillonella parvula </td><td>Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td>DSM 2007</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus gordonii </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 49818</td><td></td></tr><tr><td>CELL LINES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 cells</td><td>European Collection of Authenticated Cell Cultures</td><td>86010202</td><td></td></tr><tr><td>HT29-MTX cells</td><td>European Collection of Authenticated Cell Cultures</td><td>12040401</td><td></td></tr><tr><td>試薬および消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脳心臓注入(BHI)ブロス</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天</td>2 <td>Oxoid</td><td>CM0055</td><td>血液寒天培地</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma</td><td>M9429</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>5% 滅菌除細動馬血液</td><td>E&O Laboratories</td> <td>Ltd,P030</td><td></td></tr><tr><td>InnuPREP PCRpure Kit</td><td>Analytik Jena</td><td>845-KS-5010250</td><td>PCR purification kit</td></tr><tr><td>Big Dye</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337454</td><td>Dye for sequencing</td></tr><tr><td>ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337456</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp;グリーン I</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>T25 培養フラスコ コーティングされていない、細胞培養処理済み、通気済み、滅菌済み</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0.4%、液体、滅菌ろ過済み</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 細胞培養培地、GlutaMAX および Pyruvate</td><td>Life テクノロジー</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell ポリエステル膜細胞培養インサート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3450-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Mucin from ブタ胃 II型&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>不活化ウシ胎児血清</td><td>Greiner Bio One</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100 for molecular biology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムを含まないDPBS、マグネシウム</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr><tr><td>Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 & micro;m</td><td>Corning Costar Corp</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Serva Electrophoresis</td><td>28539010</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 計数室 Carl</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 ホモジナイザー</td><td>MoBio</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>フラッシュシステム</td><td>カスタムメイド</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>InnOva 4080 インキュベーター シェーカー</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィック</td><td>8261-30-1007</td><td>2.10</td></tr><tr><td>Memmert CO2 インキュベーター</td><td>Memmert GmbH & Co.</td><td>ICO150med</td><td></td></tr><tr><td>ミリセルERS (電気抵抗システム)</td><td>EMD Millipore, Merck KGaA</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system</td><td>Millipore, Merck KGaA-Shaker</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(ROCKER 3D basic)</td><td>IKA</td><td>4000000</td><td>6.10用シェーカー</td></tr></tbody></table>

培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

ホストと細菌叢との間の相互作用を長い間認識されており、記載されています。口の中は、常駐細菌が発生し、外因性の細菌によって植民地化を防ぐことができます、消化管の他のセクションに似ています。確かに、600 種以上の細菌が口腔内にあるし、単一の個人はいつでも異なる 100 前後を運ぶことができます。口腔内細菌は、居住者の微生物のコミュニティおよび支持の成長そして存続の内で統合になって口腔生態系における様々 なニッチを遵守する能力を有する.しかし、腸内細菌のバランスを乱すに嚥下時に腸に細菌の流れが提案されています。実際には、 pの経口投与は回腸内細菌叢の細菌の組成をシフトしました。生存とシミュレートされた胃腸管内輸送条件を受ける口腔内細菌の生存率を明らかにするのに自然な口腔生態系の簡略表示として合成コミュニティを使用しました。14 種は選択体外唾液、胃、および腸の消化プロセスを受けるおよび腸粘膜上皮をシミュレートするカコ 2 と MTX HT29 細胞を含む細胞のマルチコンパートメント モデルを提示しました。このモデルは、腸肝循環に関与する細胞に飲み込んだ細菌の影響を解明するため提供しています。合成のコミュニティを使用して、制御性と再現性のことができます。したがって、この方法論は、病原体の生存率と関連付けられている炎症変化、プロバイオティック混合物の植民地化の能力を評価するために合わせることができる、最終的には、潜在的な細菌に広範囲 presystemic の循環に影響を与えます。

このプロトコルは、生存とシミュレートされた胃腸管内輸送条件を受ける口腔内細菌の生存率の解明に適したモデルの生成に します。個々 の緊張からそのままなセルのカウントは約 108細胞 mL-1前合成のコミュニティでは、コミュニティ (確立中に実行可能なセルの 90% 以上含まれている多種間の縮図の作成図 1Aおよび1 b)。細菌の生存率ライブ/死者の定量化に基づく、各消化手順 (図 2) 後減少します。これは、生理的条件下で発生する、小腸消化液中に含まれる胆汁酸塩の胃の通過中に酸性の pH の結果をすることができます。In vitroとin vivoの両方消化消化を通過中に生存環境の変動に依存するかもしれません (例えば、 対供給絶食条件)、あるいは細菌保護プロセス (胞子形成...

腸宿主微生物間相互作用は、合成経口コミュニティ、体外消化消化、および小腸上皮のモデルを組み合わせる手法を使用して評価されました。病原体と複数種バイオ フィルム細胞浸潤を評価したり、プロバイオティクス製剤の生存性をテストするために合わせることができる方法を提案します。

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

このモデルは、上部消化管の宿主の微小方向を設定する次のステップです。それは機械論的な研究の質問に対処することを可能にし、それは食品、製薬、および栄養補助食品業界、そしてまた毒物学のための多くの機会を提供します。この技術の主な利点は、胃腸系のモデルと、複雑な微生物コミュニティを含む宿主のマイクロインターフェースを組み合わせたことです。それは非常に適用可能であり、非常に柔軟性もあります。この方法論は、他の細胞タイプを使用して、病原体の生存率とその後の情報を評価するために採用できます。また、この変化は、プロバイオティクス混合物のコロニー形成能力、そして最終的には細菌が全身循環に及ぼす潜在的な影響を助けるためにも使用できます。まず、培地をオートクレーブし、次にヘメン1ミリリットルあたり5マイクログラム、メナジオン1ミリリットルあたり1マイクログラムを追加します。9ミリリットルのメディウムをハンゲートチューブに分注し、ゴム栓とアルミキャップでチューブを閉じます。次に、90%の窒素と10%の二酸化炭素の混合物でチューブを洗い流します。シリンジを使用して1ミリリットルの嫌気性培地を取り出し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。各細菌種の単一のコロニーを選択し、それらを培地に再懸濁します。次に、コロニーを嫌気性修飾BHIに移し、摂氏37度で48時間インキュベートします。インキュベーション後、ろ過滅菌PBSを使用して、培養物を1ミリリットルあたり10〜5細胞に希釈します。次に、サイバーグリーンのヨウ化プロピジウム染色剤を用いたフローサイトメトリーを使用して、細胞数を測定します。マイクロバイオームコミュニティの構成と生存率を評価することは、私たちの実験におけるバイアスを避けるために不可欠です。細胞培養液をフラスコから取り出し、カルシウムまたはマグネシウムを含まない5ミリリットルのPBSを使用して細胞を一度洗浄します。細胞に2ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えます。フラスコを静かに動かして溶液を分散させます。次に、1.5ミリリットルのトリプシン溶液を取り除き、フラスコを摂氏37度で10分間インキュベートします。細胞が剥離したかどうかを顕微鏡で確認した後、5ミリリットルの補充細胞培養培地をフラスコに加えてトリプシンを不活性化し、ピペットで上下させて均質な単一細胞懸濁液を得ます。直ちに、細胞懸濁液の50マイクロリットルアリコートを無菌0.4%トリパンブルー溶液と無菌0.4%トリパンブルー溶液を混合し、KCO2細胞の体積対体積比で1:5の体積対HT29MTX。ピペッティングで混合し、懸濁液を計数チャンバーにロードしてから、顕微鏡下で細胞を計数します。テキストプロトコルに従ってKCO2およびHT29MTX細胞懸濁液を調製した後、懸濁液を均質化し、対応する量のKCO2お

assessing-viability-synthetic-bacterial-consortium-on-vitro-gut-host

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可...

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

出典: アロヨ、M. C.、 他 In vitro 腸内宿主-微生物界面における合成細菌コンソーシアムの存続可能性の評価。 J. Vis. Exp.

合成口腔細菌群集を消化の模擬段階に曝露する

出典:カラタユド・アロヨ、M.ら。In vitro 腸内宿主-微生物界面における合成細菌コンソーシアムの存続可能性の評価。J. Vis. Exp.(2018年)。このビデオでは、細菌の生存可能性を研究するためのin...

細菌の癒着と内部化を評価するためのin vitro腸モデル

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

このビデオでは、マウスの腸組織断片と特定の腸内細菌との相互作用を研究するためのex vivo腸内臓器培養システムのセットアップ方法について説明します。このデバイスは、2対の入出力ポートで構成されており、1つ目は腸組織の内腔を接続して特定の細菌懸濁液を供給し、もう1つはデバイスのウェルに培地を継続的に供給してex...

宿主と微生物叢の相互作用を研究するためのex vivo腸管臓器培養システム

私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。...

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

ここでは、胃腸管の生理的条件をシミュレートするバイオリアクターの一連を使用して体外のコロン,の腸内細菌を培養するためのプロトコルを提案する.

体外養殖人間の腸内細菌を研究する技術を適用する高度な

このプロトコルは、ヒトのフェカル微生物叢のインビトロバッチ培養発酵システムを説明し、イヌリン(よく知られているプレバイオティクスと最も広く研究された微生物モジュレーターの1つ)を使用して、特定の効果を推定する上でこのシステムの使用を実証する。fecal微生物叢組成および代謝活動に対する介入。...

ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル

ここで説明する内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用をインビトロバッチ発酵システムを用いて調べるプロトコルである。...

インビトロバス発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内細菌叢との相互作用の解析

本稿では、新しい腸器官培養システムを用いて、 生体 実験を行うホストとマイクロバイオームの相互作用を分析する独自の方法を紹介する。...

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

このプロトコルは、嫌気性条件下での複雑な糞便群集の連続フロー培養に利用されるミニバイオリアクターアレイの組み立てを詳述しています。また、さらなる分析のために、反応器の組み立て、接種、およびサンプリングの方法についても説明します。...

複雑な糞便群集の連続培養のためのバイオリアクターアセンブリ

学ぶ 合成細菌コンソーシアムとin vitro消化モデルを用いた腸宿主微生物インターフェイスの評価法。病原菌の細胞侵入性とプロバイオティクス製剤の生存性を評価し、食品・製薬・毒性学産業への応用可能性を示します。

培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

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