培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

このモデルは、上部消化管の宿主の微小方向を設定する次のステップです。それは機械論的な研究の質問に対処することを可能にし、それは食品、製薬、および栄養補助食品業界、そしてまた毒物学のための多くの機会を提供します。この技術の主な利点は、胃腸系のモデルと、複雑な微生物コミュニティを含む宿主のマイクロインターフェースを組み合わせたことです。

それは非常に適用可能であり、非常に柔軟性もあります。この方法論は、他の細胞タイプを使用して、病原体の生存率とその後の情報を評価するために採用できます。また、この変化は、プロバイオティクス混合物のコロニー形成能力、そして最終的には細菌が全身循環に及ぼす潜在的な影響を助けるためにも使用できます。

まず、培地をオートクレーブし、次にヘメン1ミリリットルあたり5マイクログラム、メナジオン1ミリリットルあたり1マイクログラムを追加します。9ミリリットルのメディウムをハンゲートチューブに分注し、ゴム栓とアルミキャップでチューブを閉じます。次に、90%の窒素と10%の二酸化炭素の混合物でチューブを洗い流します。

シリンジを使用して1ミリリットルの嫌気性培地を取り出し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。各細菌種の単一のコロニーを選択し、それらを培地に再懸濁します。次に、コロニーを嫌気性修飾BHIに移し、摂氏37度で48時間インキュベートします。

インキュベーション後、ろ過滅菌PBSを使用して、培養物を1ミリリットルあたり10〜5細胞に希釈します。次に、サイバーグリーンのヨウ化プロピジウム染色剤を用いたフローサイトメトリーを使用して、細胞数を測定します。マイクロバイオームコミュニティの構成と生存率を評価することは、私たちの実験におけるバイアスを避けるために不可欠です。

細胞培養液をフラスコから取り出し、カルシウムまたはマグネシウムを含まない5ミリリットルのPBSを使用して細胞を一度洗浄します。細胞に2ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えます。フラスコを静かに動かして溶液を分散させます。

次に、1.5ミリリットルのトリプシン溶液を取り除き、フラスコを摂氏37度で10分間インキュベートします。細胞が剥離したかどうかを顕微鏡で確認した後、5ミリリットルの補充細胞培養培地をフラスコに加えてトリプシンを不活性化し、ピペットで上下させて均質な単一細胞懸濁液を得ます。直ちに、細胞懸濁液の50マイクロリットルアリコートを無菌0.4%トリパンブルー溶液と無菌0.4%トリパンブルー溶液を混合し、KCO2細胞の体積対体積比で1:5の体積対HT29MTX。

ピペッティングで混合し、懸濁液を計数チャンバーにロードしてから、顕微鏡下で細胞を計数します。テキストプロトコルに従ってKCO2およびHT29MTX細胞懸濁液を調製した後、懸濁液を均質化し、対応する量のKCO2およびHT29MTX細胞を、補充した細胞培養培地を充填した予備充填滅菌容器に加えます。事前にインキュベートした培地を、事前に調製したチャンバーの頂端側から吸引します。

ピペッティングで細胞懸濁液を穏やかに混合し、1.5ミリリットルをチャンバーインサートの頂端コンパートメントに移し、細胞懸濁液を1〜3ウェルごとに混合して、一定の均質化を確保します。プレートを前後にゆっくりと動かし、次に右から左に動かして、ウェル内の細胞を均等に広げます。プレートをインキュベーターに移し、プレートの動きを繰り返します。

細胞の座り込みは、ウェル内に均一に広がるように、細胞懸濁液を一定に均質化して行う必要があります。ASAを開始する前に上皮バリアの完全性を測定するには、測定を開始する前にティア機器が完全に充電されていることを確認してください。Tier 機器を電源から外し、プラスチック製のオートクレーブ バッグで覆います。

バッグに穴を開けて、電極をメーターの入力ポートに導入します。次に、ティア機器をフローキャビネットに移す前に、バッグに70%エタノールをスプレーします。電極を消毒するには、電極チップを70%エタノールに15分間浸します。

チップを15秒間風乾させてから、細胞培養培地を使用して電極をすすぎます。セルをフローキャビネット内で室温に戻します。メーターが充電器から切断されていることを確認してから、モードスイッチをオームに設定し、電源スイッチをオンにします。

短い方の先端をインサートに、長い方の先端をウェルから取り出した状態で電極を浸漬することにより、細胞抵抗を測定します。電極をプレートインサートに対して90度の角度に保ちます。経口消化をシミュレートするには、50ミリリットルの滅菌チューブに3ミリリットルの細菌群集を移し、3ミリリットルのシミュレートされた唾液またはSSFと混合します。

ヒト唾液9A型から1ミリリットルあたり75単位、ブタ胃型2から1リットルあたり2グラムのムチンを追加します。混合物を摂氏37度、100RPMで2分間インキュベートします。DNA抽出およびフローサイトメトリー定量のために2ミリリットルのサンプルを採取します。

胃の消化をシミュレートするには、3ミリリットルの細菌に4ミリリットルのシミュレートされた胃液またはSGFを追加します。必要に応じて、1モルHClを使用してpHを3に調整します。サンプルを摂氏37度、100RPMで2分間インキュベートします。

次に、2ミリリットルのサンプルを収集します。小腸消化の場合は、4ミリリットルの模擬腸液またはSIFを細菌に加えます。必要に応じて、水酸化ナトリウムを使用してpHを調整します。

次に、サンプルを摂氏37度、100RPMで2分間インキュベートします。そして、2ミリリットルのサンプルを収集します。テキストプロトコルに従って小腸消化の細胞密度を洗浄し、調整した後、トランズウェルシステムから頂端培地を取り出し、1.5ミリリットルの細菌懸濁液を追加します。

一般的な細胞培養条件下でシステムを2時間共培養します。インキュベーション後、ビデオの前半で示したように、層の値を測定して上皮バリアの完全性を評価します。0.5ミリリットルの10ミリモルn-アセチルシステインとHPSSを添加して、HT29MTXによって生成された粘液を可溶化し、付着した細菌を回収します。

プレートを摂氏37度で攪拌しながら1時間インキュベートします。NAC HPSSを微量遠心チューブで回収し、1ミリリットルのDPBSを使用して細胞を2回洗浄します。単層の上に0.5ミリリットルの0.5%トリトン-x100を加え、ピペッティングにより細胞を破壊します。

その後、液体を渦の中で1分間すばやく回収します。洗剤で細菌細胞が損傷するのを防ぐためには、速度が重要です。テキストプロトコルに従ってサンプルを分析します。

ここで報告されているように、個々の系統の無傷細胞の数は、合成コミュニティが作られる前は1ミリリットルあたり約10〜8分の1の細胞でしたが、コミュニティの確立時には、多種の小宇宙には90%以上の生存細胞が含まれていました。生死者の定量に基づくと、細菌の生存率は、胃通過中の酸性pHと小腸消化液に含まれるバイオ塩の結果として、各消化ステップ後に低下します。胃や小腸の消化という過酷な条件では、細菌が生存可能に切り替わることがありますが、増殖も分裂もしない生きた細菌である培養細胞ではそうではありません。

この図に示すように、粘膜界面から回収された生細胞は、フローサイトメトリープロットでは青色で示されています。しかし、これらの粘液サンプルをめっき処理した場合、成長は観察されませんでした。細菌がより高い生存率を示す割合は、プレートカウントによって明らかになる細胞の破片です。

コロニーの数はさまざまですが、代謝活性のある細菌の存在は、希釈されていないサンプルに見られます。この開発後、この技術は、ニュートリゲノミクスやファーマコマイクロバイオミクスの分野の研究者が、宿主をマイクロコズミックに研究するために利用することができます。このプロトコルに従って、トランスクリプトームや代謝分析などの他の手法を実行して、コロニー形成プロセスのメカニズムを適宜理解することができます。

このビデオを見た後、宿主細胞と他のマイクロバイオームとの間のクロストークを含む消化過程を代表する複雑なin vitroモデルを確立する方法について十分に理解しているはずです。病原菌を扱うことは非常に危険であり、バイオセーフティーの予防策を考慮することが重要であることを忘れないでください。