Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング
2018年6月2日
本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。
この方法は、内分泌学分野だけでなく、内分泌信号に対する脳の応答をレビューする研究など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、他の組織から分離された脳に対する内分泌信号の直接的な影響を調べることができることです。この手順を開始するには、鉗子を使用してプラスチック製の培養皿の下部中央を引っ掻き、解剖後に幼虫の脳の腹側神経節を簡単に取り付けるためのへこみを作成します。
つまようじで、へこみの両側に瞬間接着剤を少し滴下し、接着剤にタングステンロッドを取り付けます。次に、パテのような再利用可能な接着剤の小片を使用して、へこみを囲む円形の壁を作ります。幼虫の脳を解剖するには、産卵後90〜120時間で幼虫を集め、蒸留水で少なくとも3回洗って付着した食物の残骸を取り除きます。
次に、氷のように冷たいPBSで満たされた正方形の1インチ半の時計ガラスに幼虫を置きます。一対の鉗子を使用して、幼虫の中央部分をそっとつかみます。別の鉗子を使用して、口のフックをそっとつかんで引っ張り、脳を含む幼虫の前部を体の他の部分から分離します。
次に、鉗子で前部の先端を持ち、幼虫を裏返します。想像椎間板、脂肪体、リング腺など、脳に付着している無関係な組織を取り除きます。脳を口の部分からそっと分離します。
その後、イメージングチャンバー内で事前に準備した接着リングの内側に200マイクロリットルのPBSを塗布します。PBSで解剖した脳をパスツールピペットに優しく吸引し、イメージングチャンバーに移します。イメージングチャンバーで、腹側神経節から伸びる筋線維をつかみ、タングステンワイヤーの下のへこみに脳をそっと挿入します。
次に、タングステンワイヤーを少し引き上げて、脳をイメージングの正しい位置に配置します。カルシウム蛍光画像を取得するには、脳外植片を含むイメージングチャンバーを顕微鏡下に置きます。対物レンズをPBSに触れるまで下げ、明視野照明の下で脳を配置して焦点を合わせます。
蛍光灯に切り替えて、GCaMP成功標識細胞の焦点を調整します。250 ms/フレームで、水冷モードで512 x 512ピクセルの解像度で集録を開始します。次に、露光時間を調整して、CCDカメラのダイナミックレンジ内の蛍光値を取得しますが、16ビット画像で任意の単位1000を超えないようにします。
イメージングパラメータを決定したら、ペプチド投与の1分間前に画像を撮影して、ベースラインシグナル強度を検出します。続いて、調製したペプチド溶液100マイクロリットルを幼虫浴にピペッティングすることにより、試験ペプチドを直接適用します。GCaMP 成功の放出を数分間記録します。
データ解析を行うには、解析ソフトウェアを開き、ペプチド適用前の最初のフレームを参照画像として使用します。次に、[Plugins]、[TurboReg] の順に選択します。シリアル・イメージ・ファイルをソースとして選択し、参照イメージをターゲットとして選択します。
次に、Rigid BodyとAccurateで、それぞれ処理方法と品質を確認します。続いて、「バッチ」をクリックして画像処理を開始します。画像トレイの [分析]、[ツール]、[ROI マネージャー] を使用して、複数の関心領域を選択します。
次に、ROIマネージャーウィンドウで[詳細]、[マルチ測定]、[OK]をクリックして、ピクセル強度を測定します。この実験では、野生型脳にはCCHa2、グレリン、ノシセプチンを、CCHa2受容体変異体脳にはCCHa2を曝露しました。インスリン産生細胞のGCaMP6シグナルを共焦点顕微鏡で250 ms/frameで検出しました。
各時点におけるROI強度とベースライン信号強度の変化の比率をプロットしました。ROIは、同じ焦点面で検出された細胞体に設定されたものです。実線は5〜10サンプルの平均を示し、点線は平均の標準誤差の上限と下限を示します。
影付きの領域は、実験の信号の変動を示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に準備されていれば、1時間で行うことができます。この手順を試みるときは、脳サンプルの損傷を避けるために、脳サンプルを迅速に準備することを覚えておくことが重要です。
この手順は、受容体特異性などの追加の質問に答えるために、遺伝学と組み合わせることができます。このプロトコールで使用されるシステムは、調製が容易で再利用可能です。したがって、このプロトコルは、スクリーニングなどに役立ちます。
その開発後、この技術は、内分泌学および神経科学の分野の研究者がショウジョウバエの脳機能を制御するホルモンネットワークを探求する道を開きました。
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概要
本研究では、内分泌シグナルに対するニューロンの反応を探索することを目的とした、Drosophila脳のex vivoカルシウムイメージングのプロトコルを提示します。この手法により、特定のニューロンを活性化させる天然または合成化合物の試験が可能となり、内分泌学と神経科学の接点に関する知見が得られます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 内分泌学
- ショウジョウバエの神経生物学
背景
- 本研究では、内分泌シグナルが脳に及ぼす直接的な影響を調査します。
- ホルモンネットワークを理解するためのモデルとして、Drosophilaを利用します。
- 特定のペプチドがニューロンの活性化にどのように影響するかを重点的に扱います。
- 受容体の特異性に関するさらなる研究の基礎を確立しました。
研究の目的
- 内分泌シグナルに対する脳の反応を評価するためのプロトコルを開発すること。
- 研究者が、他の組織とは別にニューロンの活動を解析できるようにすること。
- ニューロン機能に影響を与える可能性のある化合物のスクリーニングを容易にすること。
使用した手法
- 本手法では、カルシウムインジケーターを用いたショウジョウバエ幼虫脳の解剖およびイメージングを行います。
- 産卵後約 90-120 時間で幼虫を回収し、イメージングの準備をします。
- カルシウム蛍光イメージングのパラメータを設定し、ニューロン活動の詳細な観察を可能にします。
- テストペプチドを適用することで、脳の応答信号の経時的な測定が可能になります。
主な結果
- GCaMP6信号のイメージングに成功したことで、さまざまなペプチドに応答した神経細胞の活性化が明らかになりました。
- 統計解析では、ペプチド投与後の神経応答を評価するために、ベースラインの信号強度を組み込んでいます。
- これらの知見は、脳機能のホルモン制御を探索する上で、本手法が有用であることを裏付けています。
結論
- 本研究では、ショウジョウバエにおける神経活動への内分泌系の影響を調査するための有用なプロトコルを提示します。
- これにより、神経科学研究における受容体の特異性やホルモンネットワークの探索が可能になります。
- その意義は、脳機能および反応の根底にある可塑性とメカニズムの理解にまで及びます。
よくある質問
産業界における重要性
ショウジョウバエの脳外植体を用いたex vivoカルシウムイメージングにより、内分泌シグナルに対する神経応答を直接的に可視化することが可能となり、初期探索段階におけるメカニズムのリスク低減を支援します。このアプローチは、ペプチドホルモンの脳特異的な影響を分離させ、ターゲットの検証やパスウェイの解析において予測的な信頼性を提供します。本手法の適応性と定量的なアウトプットは、神経内分泌研究パイプラインにおける再利用可能な機能として位置付けられます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 神経組織におけるホルモンと受容体の相互作用を直接的に解析できる。
- 末梢の混絡要因から脳の反応を分離することで、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- カルシウムシグナルの定量測定により、メカニズムレベルでのリスク低減を促進する。
- 神経内分泌ターゲットの推進に向けた予測的な信頼性を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 化合物またはペプチドスクリーニング用に、バリデーション済みの脳外植片システムを構築します。
- アッセイの標準化に向け、再現性のある定量的な蛍光読み取り値を提供します。
- 神経活性に影響を与える水溶性分子の、スケールアップ可能なスクリーニングを可能にします。
- 異なるペプチドや遺伝的背景にわたり、プラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー探索のため、疾患に関連する神経内分泌経路に適合させています。
- ホルモンと脳の相互作用に関する発見から前臨床バリデーションまで、一貫性を維持します。
- 神経活性化メカニズムの直接的な証拠を提示することで、開発推進における意思決定のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このex vivoイメージング法は、神経回路における内分泌シグナル伝達の仮説駆動型検証を可能にすることで、初期探索からリード化合物の同定までを繋ぎます。
- 探索生物学：ペプチドホルモンが脳活動に及ぼす影響に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある定量的な出力を備え、アッセイにそのまま利用可能な外植片システムを提供します。
- 分析：条件間の堅牢な統計比較を可能にする時間分解蛍光データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患モデルに関連する神経内分泌バイオマーカーとの整合性を促進します。
- 企業的な再利用：他の臓器や種にも適応可能であり、プログラムを横断した有用性を高めます。
運用および組織への影響
- 科学的価値：神経内分泌ターゲットのバリデーションにおける予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値：再現性と拡張性を確保するため、イメージングおよび解析のワークフローを標準化する。
- 戦略的価値：脳への直接的な反応を明確にすることで、go/no-go判断に根拠を与え、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：神経内分泌ターゲットおよびパスウェイのリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 精密な解剖およびイメージングのためには、Drosophilaの遺伝学と神経解剖学に関する専門知識が必要です。
- 回転ディスク共焦点顕微鏡および定量的画像解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- イメージングパラメータとデータ解析プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- チャンバーを改造することで、他の器官や動物モデルにも適応可能です。
- 信頼性の高い結果を得るためには、サンプルの調製速度と組織の完全性が極めて重要です。
