Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。

この方法は、内分泌学分野だけでなく、内分泌信号に対する脳の応答をレビューする研究など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、他の組織から分離された脳に対する内分泌信号の直接的な影響を調べることができることです。この手順を開始するには、鉗子を使用してプラスチック製の培養皿の下部中央を引っ掻き、解剖後に幼虫の脳の腹側神経節を簡単に取り付けるためのへこみを作成します。

つまようじで、へこみの両側に瞬間接着剤を少し滴下し、接着剤にタングステンロッドを取り付けます。次に、パテのような再利用可能な接着剤の小片を使用して、へこみを囲む円形の壁を作ります。幼虫の脳を解剖するには、産卵後90〜120時間で幼虫を集め、蒸留水で少なくとも3回洗って付着した食物の残骸を取り除きます。

次に、氷のように冷たいPBSで満たされた正方形の1インチ半の時計ガラスに幼虫を置きます。一対の鉗子を使用して、幼虫の中央部分をそっとつかみます。別の鉗子を使用して、口のフックをそっとつかんで引っ張り、脳を含む幼虫の前部を体の他の部分から分離します。

次に、鉗子で前部の先端を持ち、幼虫を裏返します。想像椎間板、脂肪体、リング腺など、脳に付着している無関係な組織を取り除きます。脳を口の部分からそっと分離します。

その後、イメージングチャンバー内で事前に準備した接着リングの内側に200マイクロリットルのPBSを塗布します。PBSで解剖した脳をパスツールピペットに優しく吸引し、イメージングチャンバーに移します。イメージングチャンバーで、腹側神経節から伸びる筋線維をつかみ、タングステンワイヤーの下のへこみに脳をそっと挿入します。

次に、タングステンワイヤーを少し引き上げて、脳をイメージングの正しい位置に配置します。カルシウム蛍光画像を取得するには、脳外植片を含むイメージングチャンバーを顕微鏡下に置きます。対物レンズをPBSに触れるまで下げ、明視野照明の下で脳を配置して焦点を合わせます。

蛍光灯に切り替えて、GCaMP成功標識細胞の焦点を調整します。250 ms/フレームで、水冷モードで512 x 512ピクセルの解像度で集録を開始します。次に、露光時間を調整して、CCDカメラのダイナミックレンジ内の蛍光値を取得しますが、16ビット画像で任意の単位1000を超えないようにします。

イメージングパラメータを決定したら、ペプチド投与の1分間前に画像を撮影して、ベースラインシグナル強度を検出します。続いて、調製したペプチド溶液100マイクロリットルを幼虫浴にピペッティングすることにより、試験ペプチドを直接適用します。GCaMP 成功の放出を数分間記録します。

データ解析を行うには、解析ソフトウェアを開き、ペプチド適用前の最初のフレームを参照画像として使用します。次に、[Plugins]、[TurboReg] の順に選択します。シリアル・イメージ・ファイルをソースとして選択し、参照イメージをターゲットとして選択します。

次に、Rigid BodyとAccurateで、それぞれ処理方法と品質を確認します。続いて、「バッチ」をクリックして画像処理を開始します。画像トレイの [分析]、[ツール]、[ROI マネージャー] を使用して、複数の関心領域を選択します。

次に、ROIマネージャーウィンドウで[詳細]、[マルチ測定]、[OK]をクリックして、ピクセル強度を測定します。この実験では、野生型脳にはCCHa2、グレリン、ノシセプチンを、CCHa2受容体変異体脳にはCCHa2を曝露しました。インスリン産生細胞のGCaMP6シグナルを共焦点顕微鏡で250 ms/frameで検出しました。

各時点におけるROI強度とベースライン信号強度の変化の比率をプロットしました。ROIは、同じ焦点面で検出された細胞体に設定されたものです。実線は5〜10サンプルの平均を示し、点線は平均の標準誤差の上限と下限を示します。

影付きの領域は、実験の信号の変動を示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に準備されていれば、1時間で行うことができます。この手順を試みるときは、脳サンプルの損傷を避けるために、脳サンプルを迅速に準備することを覚えておくことが重要です。

この手順は、受容体特異性などの追加の質問に答えるために、遺伝学と組み合わせることができます。このプロトコールで使用されるシステムは、調製が容易で再利用可能です。したがって、このプロトコルは、スクリーニングなどに役立ちます。

その開発後、この技術は、内分泌学および神経科学の分野の研究者がショウジョウバエの脳機能を制御するホルモンネットワークを探求する道を開きました。