Name: マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶマイクロ液滴手法によるポリアクリルアミド微粒子の作製と一本鎖DNA産物のPCR増幅法。分離工程不要で効率的に単鎖DNAを生成し、疾病診断や治療への応用が可能です。

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本研究は「農業科学 & 技術開発 (プロジェクト号の共同研究プログラムをと題するプロジェクトでサポートされているPJ0011642)「農村開発行政、韓国政府によって資金を供給。この研究は、基本的な科学研究科学省 ICT ・将来計画、韓国資金国立研究財団 (NRF) を通じての助成金 (NRF 2017R1A2B4012253) によって支えられたまた部分的。この研究はだった創造・貿易省、産業、エネルギー、韓国共和国によって資金を供給産業の融合教育プログラムの助成金 (N0000717) によってをサポートされました。

1. PDMS マイクロ流体システムの作製
<ol><li>ベース樹脂と触媒 10:1 の体積比で混合して液体の PDMS プレポリマーの 20 mL を準備します。微小流体ネットワークの上の部分のシリコン ・ ウエハに準備された SU 8 金型に液体 PDMS の 10 mL を注ぐ。底の平たい部分の金型構造を持たないシリコンウェハ上液体 PDMS の同じ量を注ぐ。 注: 微小流体ネットワークは CAD プログラムの設計、典型的なフォトリソグラフィ プロセス (見なさい補足数字) を使用してマスターを作製するためにフォトマスクに変換されます。このマスターは、シリコン基板11のネガ型フォトレジスト SU 8 型で構成されます。</li>
	<li>ホット プレートと 75 ° C、30 分間の治療で液体の PDMS プレポリマーでコーティングされた 2 つのシリコンウェハーを配置します。<ol>
<li>手動で SU 8 型から硬化した PDMS 層をはがします。マクロの流体サンプル ミクロン スケールの流路に接続するレプリケートされた微小流体ネットワークの油ポートに穴パンチング ツール ラウンド 1.5 mm 径に合わせます。手動で貫通穴をパンチします。</li>
		<li>3 回の 2 つのソリューションと出口ポートの形成プロセスを抜き、これを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上と下 PDMS レイヤー サンプルごとに数秒の手持ちコロナ treater12を使用しての両方の親水性表面処理を行います。<ol>
<li>PDMS-PDMS 接合プロセスのホット プレートを使用して 30 分の 2 つのプラズマ処理による PDMS 層と 90 ° C で熱をスタックします。接着・漏れ試験試作したデバイスのため 3 つの入口ポートにシリンジ ポンプを使って加圧水を供給します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ポリアクリルアミド オリゴ微粒子の生産
<ol><li>ビーズ混合物の表 1で詳しく説明を準備します。</li>
	<li>渦と簡単に遠心分離機標準 ssDNA acrydite ラベル プローブ (Ap, 100 μ M) と acrylamide:bis (19:1) 原液。</li>
	<li>ソリューションを準備私ソリューション、ssDNA (acrydite プローブ) の 10 μ L、5 x TBE のバッファー (1.1 M トリス; 900 mM ホウ酸; 25 mM EDTA) の 10 μ L、5 μ L 水の bis 40% アクリルアミドの 25 μ L を混合することによって。ソリューション II を過硫酸アンモニウム 20% の 50 μ l を準備します。</li>
	<li>準備 2 注射器は個別に私とソリューション II、液でいっぱいやマイクロ流体プラットフォームにソリューション フローを導入するポンプにそれらをマウントします。0.4% と混合鉱物油を準備、微粒子の表面凝固 TEMED。 注: TEMED は遊離基の安定剤としてよく知られています。フリーラジカルは、アクリルアミドの重合を触発するために過硫酸アンモニウム (AP) と高分子の形成の率を加速できます。</li>
	<li>4 ml の連続的な流れを生成する鉱物油の瓶を埋めます。</li>
	<li>マイクロ流体貯蔵所としてガラスの瓶のキャップの 2 つのポートに 2 つの管を挿入: 空気圧縮機とマイクロ チャネル ネットワークへ圧油を供給するため流体ポートからガラス瓶の中に圧縮空気を適用するための空気圧ポートガラスのボトルから。ガラス瓶とマイクロ流体デバイスに油ポートの間のチューブを接続します。<ol>
<li>マイクロ流体デバイス内の 2 つのソリューションのポートにシリンジ ポンプから 2 つのソリューションを供給するためにチューブを接続します。ビーカーに生成された微小球を転送するために出口にチューブを挿入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.4 - 0.7 mL/h の調整圧縮空気圧レギュレータ (82 116 kPa) を使用して圧縮機にシリンジ ポンプの流量を設定します。ホット プレートのガラス ビーカーで磁気スターラー バーの回転速度 (500 rpm) を設定します。シリンジ ポンプを動作し、電磁弁13のオン/オフのコントロールを使用してガラス瓶の中に外部コンプレッサーによる圧縮空気を供給します。</li>
	<li>デジタル顕微鏡を用いたフロー中心の幾何学における微粒子の形成およびガラス ビーカーで生成された微粒子の凝固を観察します。 注: ソリューションおよび鉱物油流の圧の流量に依存する、微粒子のサイズと生産の速度(表 2).
</li>
</ol>3. ポリアクリルアミド オリゴ マイクロスフィアの実行カウントします。
<ol><li>検定定量化のためガラス検定にポリアクリルアミド オリゴ マイクロスフィアと場所水溶液の小さな量 (約 100 μ L) を取るし、ゆっくり数える商工会議所の井戸を微粒子懸濁液を埋めます。 注: 詳細については、http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer を参照してください。</li>
	<li>顕微鏡と手集計カウンターを使用すると、16 の正方形の 1 つのセットは、マイクロスフィアを数えること。検定を商工会議所の次のセットに移動し、16 コーナーのすべての 4 つのセットはカウントまでカウントを実行します。</li>
	<li>平均微粒子数を決定、オリジナル ビーズ懸濁液中の微粒子数を計算します。</li>
	<li>微小球の 100 μ L を 1.5 mL 遠心チューブに転送します。穏やかな (400 x g) 遠心分離、ピペットで上澄みを削除します。</li>
</ol>4. ポリアクリルアミド Oligomicrosphere の表面に DNA ハイブリダイゼーションを行う
注: 同じ DNA プローブ 5'-NH2-5'-acrytide の変更ではなくグループは私のソリューションに追加されますが、並行して Ap を含む微小球のテストします。DNA の交配の結果は図 2のとおりです。Cy3 標識の相補的なオリゴヌクレオチド プローブ (cAp) ソリューションは、暗い部屋に置くべき。
<ol><li>Cy3 キャップ 1xTE バッファーの 100 μ L を使用してを再懸濁します (TE バッファー: 10 mM トリスと 1 μ m の EDTA、pH 8.0) 最終濃度 100 μ M を達成するために。たとえば、TE バッファーとアルミ箔で覆われている微量遠心チューブへの転送の 100 mL のキャップの 1 pmol を再懸濁します。 注: 鎖シーケンスは、表 3を参照してください。</li>
	<li>Ap 共微粒子を含む滅菌 1.5 mL 遠心チューブに Cy3 キャップの 100 μ M を追加します。</li>
	<li>チューブを数回タップをミックスし、1 h、暗所に室温で孵化させなさい。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、ピペッティングを残留バッファーを削除します。</li>
	<li>TE バッファーの 500 μ L で 3 回を洗い流してください。</li>
	<li>遠心チューブをやさしくタッピングによる微小球を再懸濁します。4.4 のステップを繰り返します。</li>
	<li>スライド ガラス (75 mm × 50 mm) とイメージングの前にアルミ箔でカバーに微小球を配置します。</li>
</ol>5 一本鎖 Dna を増幅するため非対称的な PCR
<ol><li>分析する一本鎖 Dna を増幅するためには、非対称の PCR 試薬ミックスを準備します。表 4氷の上で試薬を解凍します。氷の上の Taq のポリメラーゼ酵素 (50 U/μ L) を保持しないが、むしろ必要になるまでの-20 ° C で保存します。</li>
	<li>優しく渦すべて試薬 10 10,000 x g でチューブを簡単に遠心分離機と s。</li>
	<li>説明したようにすべての試薬を組み合わせて表 4.
</li>
	<li>たちにサンプルを置き、次の条件下で非対称的な PCR を開始: 25 サイクル (95 ° C、30 s、52 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s)、85 ° C、5 分、4 ° C で保持</li>
</ol>6. 一本鎖 Dna を増幅するための微小球 PCR
注意: この節では、PCR の反作用の管の一本鎖 Dna を増幅するためのプロトコルを説明します。微小球 PCR の反作用は、50 μ L 反応体積ので行われました。表 5に一本鎖 Dna を増幅するために使用する詳細なシーケンスのとおりです。この場合、微粒子の表面に Ap は、相互に補完するランダム DNA テンプレートをアニールすることができます。これは相補的 dna (アンチセンス dna、図 3) を生産するための非常に重要なステップです。拡張 DNA は、微粒子 pcr のテンプレートとして使用されます。
<ol><li>微小球 PCR 試薬ミックスを準備します。表 6 ; 氷の上で試薬を解凍します。しかし、氷の Taq のポリメラーゼの酵素を保持しません。必要になるまでの-20 ° C で保管してください。</li>
	<li>優しく渦すべて試薬 10 10,000 x g でチューブを簡単に遠心分離機と s。</li>
	<li>顕微鏡による簡易約 〜 25 球を取得します。 注: 1 つの反作用の管球の数は、40 倍の倍率で光学顕微鏡を使用して計算されます。約 25 ~ 微粒子、微粒子に PCR の拡大のため使用されます。詳細な情報は、手順 3 では。</li>
	<li>説明したようにすべての試薬を組み合わせて表 6.
</li>
	<li>たちにサンプルを置き、次の条件下で非対称的な PCR を開始: 25 サイクル (95 ° C、30 s、52 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s)、85 ° C、5 分、4 ° C で保持</li>
	<li>次の増幅ローディングバッファー x 6 の 8 μ L を追加し、各サンプルの 15 μ L を 2% アガロースゲルに読み込みます。次に、1 で 35 分間 100 V で電気泳動を実行 x TAE (pH 8.2 40 mM 1 mM EDTA トリス酢酸トリス-酢酸-EDTA) バッファー。</li>
</ol>7. 共焦点顕微鏡による買収
注: 共焦点の顕微鏡下微小球 DNA プローブの交配の結果が作成されます。ImageJ を用いた画像解析が実行されます。
<ol><li>ホルダーに顕微鏡のステージにハイブリダイズした微粒子を修正します。</li>
	<li>(ヘリウム ネオン レーザー, 543 nm ライン) のレーザーを選択し、レーザー制御でそれをオンにします。</li>
	<li>顕微鏡制御で対物レンズを選択します。</li>
	<li>Cy3 およびチャネルを構成コントロールの目的のフィルターを選択します。</li>
	<li>実験を開始し、サンプルを確認します。表 7は、共焦点顕微鏡の設定をまとめたものです。</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

DsDNA の汚染物質は、ssDNA 増幅における主要な問題です。従来の非対称 PCR 増幅15dsDNA 増幅を最小限に抑えることは難しいままです。また、ssDNA を生成するための技術的な改善は、サンプル スループットの効率を高めるために私たちを有効にしている、ssDNA の分離はまだ不完全な精製収率、高コストのため問題となります。
非対称的な PCR は ssDNA を操作するときに使用される最も挑戦的な方法のひとつです。このメソッドは、等しくない量 (例えば20:1 の比率) ssDNA の大きな量を生成するためにプライマーを適用されます。ただし、ssDNA をもたらすすべての増幅反応を最適化する非常に困難です。したがって、合力4から副産物 (dsDNA) を回避する必要があります。
追加の分離手順なし ssDNA を生成するために acrydite 共重合法に基づく DNA プローブをあてるポリアクリルア...

一本鎖 DNA (ssDNA) は、DNA ハイブリダイゼーション1,2のための特有の性質による分子認識要素 (MRE) として広く考えられています。SsDNA 合成システムの開発は、DNA マイクロ アレイ3oligotherapeutics、診断、および補完的な相互作用4、5の統合分子センシングなどの生物学的につながることができます。
日には、マイクロ ポリマー粒子実証されている正常にマイクロ流体デバイスを用いたします。いくつかのマイクロ流体技術は、マイクロ環境6、7の連続的な流れの非常に均一な微粒子を製造するための強力なように証明されています。
李らの研究では8液滴を用いたマイクロ流体システムを含まない共重合性の oligo 微小球と一本鎖 Dna の増幅のマイクロ合成が報告されました。マイクロ流体プラットフォームは、PDMS (ポリジメチルシロキサン) の 2 つの層から構成されます: 微小球とフラット部分下を生成するためのマイクロ チャネル ネットワークの上部。これら 3 種類の PDMS 流路から成っている: 1) 液滴生成のためのチャネル、2) 2 つの溶液を混ぜるため蛇紋岩のチャネル、3) 微小凝固用逐次重合のチャネル中心の流れ。2 流れを単一 PDMS 路に導入すると、流れが狭いオリフィス構造を強制できます。チャネル形状、流量、粘度など流動挙動のサイズと、微粒子の形態に影響を与えます。したがって、液体主流はマイクロ monospheres9,10に分けることができます。
ここでは、詳細な微小球-PCR のプロトコルは ssDNA の増幅に提供されます。まず、液滴を用いたマイクロ流体デバイスの設計プロセスを説明します。その後、どのポリアクリルアミドの微粒子が補完的な方法でランダム DNA テンプレートの機能ことができる方法を説明します。最後に、一本鎖 Dna を増幅するため微小球 PCR のプロトコルが表示されます。

<table><tbody><tr><td>液体ポリジメチルシロキサン、PDMS</td><td>ダウコーニング株式会社</td><td>Sylgard 184</td><td>チップ</td></tr><tr><td>40% アクリルアミドの成分:bis 溶液 (19:1)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610140</td><td>共重合可能なオリゴマイクロスフェアの成分</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム、APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>アクリルアミドの硬化剤:bis 溶液</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-テトラメチルエチレンジアミン、TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>過硫酸アンモニウムの触媒</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M5904</td><td>表1。解決策III.マイクロスフェア試薬</td></tr><tr><td>Cy3の成分は、相補的オリゴヌクレオチドプローブを標識し、</td><td>Bioneer</td>は表3<td>を合成しました</td><td>。配列情報&nbsp;</td></tr><tr><td>ssDNAアクリダイト標識プローブ</td><td>Bioneer</td>は表1<td>を合成しました</td><td>。解決策 I. マイクロスフィア試薬の成分</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp;T1016</td><td>TE緩衝液、pH緩衝液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>EDS</td><td>の成分、イオン除去(Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>ssDNA増幅</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere</td></tr><tr><td>surface Light Microscope</td><td>ニコンインスツルメン</td>ツ<td>日食 80i</td><td>マイクロスフィアの数を計算する</td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1861096</td><td>ssDNA 増幅</td></tr><tr><td>ハンドヘルド コロナ トリーター</td><td>エレクトロテクニック</td><td>BD-20AC 実験室 コロナ トリーター</td><td>親水性 表面処理</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>液体</td><td>PDMS</td>シリンジポンプ kd サイエンティフィック 78-1100 の硬化用として 1 つの <td>HI-1000</td> 加熱プレート</tr>として<tr><td></td><td></td><td></td><td>溶液Iと溶液IIの均一な流れ</td></tr><tr><td>コンプレッサー</td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>溶液III</td></tr><tr><td>の流量制御 Bright-Line Hemacytometer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>マイクロスフェアの数を計算</td></tr></tbody></table>

マイクロ液滴手法と一本鎖 dna 産物の微粒子に pcr 増幅

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

マイクロ流体の液滴ベースは、コントロールのサイズと得られた微粒子の形態を提供するマイクロ流路における均一微粒子の信頼性の高い生産を有効にします。Acrydite DNA プローブを用いた共微粒子を試作されました。非対称 PCR、exonuclease 消化、ストレプトアビジン コートした磁気ビーズの分離などさまざまな方法を使用して、単一座礁させた DNA を合成できます。ただし、これらのメソッドは効率的に大量の高純度 ssDNA を使用できません。ここでは、ssDNA 可能効率的に増幅および PCR の反作用の管からピペットで単に dsDNA から分離する方法を詳述した微小球 PCR のプロトコルについて述べる。SsDNA の増幅は、DNA マイクロ アレイと DNA SELEX (指数強化による ligands の組織的進化) プロセスのための潜在的な試薬として適用できます。

作製した高分子液滴を用いたマイクロ流体プラットフォームは、2 つの PDMS 層 (図 1 a) から構成されます。マイクロ チャネル ネットワークの 3 種類の微粒子を生成するため使用される: 1) フロー中心の幾何学図 1b2) 私とソリューション II、混合溶液の蛇紋岩チャネル 3) 微粒子の重合チャネルで示すように、凝固。すべてのチャンネルの高さは 60 μ m だった。混合し、重合のチャネル長は 74.35 ミリメートルと 94.45 mm であった。2 流体流れと鉱物油の流れの 1 つのマイクロ チャネルの幅は 100 μ m、200 μ m であった。微粒子形成用オリフィス構造は、50 μ m の長さの 25 μ m 幅だった。ディフューザー構造の角度が 37 ° です。鉱物油の連続的なフローの研究室での空気圧コントロール システムとソリューション フロー (図 1 c) の 2 ...

この作品は、マイクロ流体の液滴ベース プラットフォームの作製とポリアクリルアミド微粒子微粒子に PCR の拡大のためのアプリケーションのメソッドを提供します。微粒子 PCR 法は、DNA 二重鎖を分離することがなく単一座礁させた DNA 産物を得ることが可能になります。

マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

この方法は、マイクロ流体系の組み合わせ技術と、マイクロ流体デバイスや非対称PCR法などの分子バイオテクノロジー分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、高度に均質化された微小球の効率的な生成と、追加の分離ステップなしで一本鎖DNAを生成することです。この技術の意味は、様々な疾患の診断または治療にまで及ぶ。一本鎖DNAの生成はap-ta-mo-sisアッセイの鍵となるため、検出や治療に使用できます。この方法は、MEMSの三次元微小流体系に関する洞察を提供することができますが、病気の検出と治療に使用される他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に新しい個人は、逆方向に流れるから流体を適切に制御するために苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、生成された微小球の流れの焦点を合わせる幾何学および凝固の微小球形成を観察するために重要である。まず、塩基ポリマーと触媒を10対1比で混合して20ミリリットルの液体PDMSプレポリマーを調製する。マイクロ流体ネットワークの上部のシリコンウェーハ上の準備されたSU-8型に液体PDMSの10ミリリットルを注ぎます。底面平らな部分の場合、同じ量の液体PDMSを金型構造なしでシリコンウェーハに注ぎます。液体PDMSプレポリマーでコーティングされた2つのシリコンウエハーを予熱ホットプレートに置き、摂氏75度で30分間硬化します。これに続いて、硬化PDMS層をSU-8モールドから手動で剥離する。直径1.5ミリメートルの丸い穴パンチングツールを、複製されたマイクロ流体ネットワークのオイルポートに合わせて、ミクロンスケールの流路をマクロ流体サンプルと接続します。その後、手動でスルーホールをパンチアウト。パンチングプロセスを3回繰り返した後、ハンドヘルドコロナ治療器を使用して上側と下側のPDMS層の両方で、サンプルあたり数秒間親水性表面処理を行います。PDMS-PDMS間の結合プロセスのためのホットプレートの上に2つのプラズマ処理PDMS層を積み重ね、摂氏90度で30分間熱を出します。ボルテックスと簡単に遠心分離法標準的な一本鎖DNAアクリル標識プローブと19対1のアクリルアミドビスストック溶液。25マイクロリットルの40%アクリルアミドビス溶液、10マイクロリットルの一本鎖DNA、10マイクロリットルの5X TBEバッファー、5マイクロリットルの水を混合して溶液を調製します。20%過硫酸アンモニウムの50マイクロリットルで溶液2を調製します。溶液1と溶液2で個別に充填された2つのシリンジを準備し、それらをシリンジポンプに取り付けて、マイクロ流体プラットフォームにソリューションフローを導入します。微小球の表面凝固のために0.4%TEMEDと混合鉱物油を準備する。ガラス瓶にミネラルオイルを充填した後、マイクロ流体貯留層としてガラス瓶のキャップにある空気圧および流体ポートに2つのチューブを挿入します。マイクロ流体装置のガラス瓶とオイルポートの間にチューブを接続します。マイクロ流体デバイスの 2 つのソリューション ポートにチューブを接続して、シリンジ ポンプから 2 つのソリューションを供給します。次に、生成されたマイクロスフィアをビーカーに移すために、チューブを出口ポートに挿入します。次に、シリンジポンプの流量を1時間あたり0.4~0.7ミリリットルに設定します。レギュレータを使用して、コンプレッサーの圧縮空気圧を調整します。ホットプレートに磁気攪拌バー付きのガラスビーカーを置き、回転速度を設定します。シリンジポンプを操作し、外部コンプレッサで発生した圧縮空気を、電磁弁のオンオフ制御を使用してガラス瓶に供給します。デジタル顕微鏡を用いて、フローを合わせる幾何学的形状における微小球の形成と、生成されたマイクロスフェアの凝固をガラスビーカーで観察します。微小球の形成を観察することは、この研究で微小球および微小流体系を産生する主要なプロセスであるため、最も重要なステップの1つである。これに続いて、マイクロスフェアの100マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。その後、穏やかな遠心分離機とピペットを通して上清を除去します。100マイクロモルの最終濃度を達成するために、1X TEバッファーの100マイクロリットルを使用して、無料のプローブ修飾シアニン-3を再中断します。次に、AP共重合した微小球を含む無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に相補的プローブ修飾シアニン-3の100マイクロモルを加える。チューブを数回タップして、暗闇の中で室温で1時間混ぜ合わせてインキュベートします。インキュベーションに続いて、上清を捨て、ピペット処理を通して残留バッファーを取り除く。その後、500マイクロリットルのTEバッファーで3回リンスします。マイクロスフィアを75 x 50ミリメートルのガラススライドに置き、イメージングの前にアルミホイルで覆います。40倍の光顕微鏡を用いて顕微鏡計数で約25個の微小球を得る。これに続いて、テキストプロトコルに記載されているとおりに、すべての試薬を組み合わせます。サンプルをサーモサイクラーに入れ、適切な条件下で非対称 PCR を開始します。非対称 PCR 後の上清のコレクションは、微小球を持つ単一鎖 DNA を生成する主要なプロセスであるため、最も重要なステップの 1 つです。増幅後、各サンプルに6Xローディングバッファを8マイクロリットル加えます。各サンプルの15マイクロリットルを2%アガロースゲルにロードします。その後、1X TAEバッファーで35分間、100ボルトで電気泳動を行います。ハイブリダイズした微小球をホルダーに入れ、ホルダーを共焦点顕微鏡のステージに取り付けます。レーザーを選択し、レーザーコントロールでオンにします。顕微鏡コントロールで対物レンズを選択します。次に、構成制御でシアニン-3およびチャネルに対して目的のフィルタを選択します。最後に、実験を開始し、サンプルを観察します。作製されたポリマー液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、2つのPDMS層から構成されています。マイクロスフィアチャネルネットワークは、流れ焦点幾何学、溶液1と2を混合するための蛇行チャネル、および微小球凝固のための重合チャネルであるマイクロスフィアの生成に使用されます。マイクロ流体プラットフォームでマイクロスフィアを生成するために、鉱物油の連続流れ用のラボベースの空気圧制御システムと溶液流用の2つのシリンジポンプが使用されました。微小球が5素数のアクリルダイトDNAプローブで正しく機能している場合、これらの蛍光画像に示すように、ハイブリダイゼーション実験中に表面上の蛍光活性のカバレッジをもたらすはずです。共重合が正しく行われない場合、光マイクロスフェア画像は微小球内部に内部汚染を示します。DNAオリゴプローブで微小球の3D表面を操作することははるかに高速なプロセスであり、オンフローマイクロスフィア合成プラットフォームは、一本鎖DNAの増幅と精製のためのツールを提供することができます。最初に共重合された5素数APは、その相補的なテンプレートにアニールした後のDNA重合用の3素級ヒドロキシル末端を提供する。二本鎖DNA汚染物質は、非対称PCR実験で観察された。マイクロスフィアPCRから蓄積された得られた一本鎖DNAを、ゲル電気泳動解析を通じて合成サイズマーカーと比較して実証した。この手順を試みる際には、PCR実験の最適化に一般的に必要なプロトコルと調整に関する事前知識が、この方法で増幅サイクル、アニーリング温度、プローブシーケンスを得るために必要であることを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、診断と治療の分野の研究者が分子バイオテクノロジーとバイオメディシンの2つの領域をつなぐ道を開きました。アクリルアミド溶液を使用することは危険であり、手袋やラボコートを着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

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Research

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Bioengineering

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マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

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