Name: Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶジブロモマレイミドを用いた二硫化物含有ウイルス様粒子の蛍光標識法。Qβバクテリオファージの精製と単一反応による新規官能基導入と蛍光体形成を同時に実現し、細胞内追跡に応用可能な技術です。

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J.J.G. は、彼らのサポートのための国立科学財団 (DMR-1654405) および癌防止研究所のテキサス (CPRIT) (RP170752s) を認めています。

1. 準備
<ol><li>ホストゲノム スープ (LB) 寒天培地を作るし、プレート12を注ぐ。</li>
	<li>
WtQβ コート蛋白質シーケンスを含む pET28 プラスミドを持つ BL21(DE3) を変換します。
	<ol>
<li>雪解けの氷浴で大腸菌BL21(DE3) 有能なセル。微量遠心チューブ内のセルの場所 50 μ L。</li>
		<li>1 つの管にプラスミッドの 2 μ L を追加し、軽くはじきます。氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>熱衝撃を与える 45 セル正確 42 ° C では水浴の s熱衝撃の直後に氷風呂に戻って、チューブを置き、5 分間インキュベートします。</li>
		<li>どんな抗生物質を含まない LB 媒体の 950 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 60 分 200 rpm で文化を振る</li>
		<li>(カナマイシン) と LB 寒天培地プレート上のカルチャの 100 μ L をプレートし、プレート 37 ° C で一晩インキュベート必要なとき白人が植民地を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スーパー最適スープ (すすり泣き) メディアを作る。
	<ol>
<li>オートクレーブ 2 2 L superdry サイクルのエルレンマイヤー フラスコに困惑します。</li>
		<li>無菌環境で重量を量り、トリプトン 20.0 g を追加、5.0 グラム酵母抽出物、無水硫酸マグネシウム、2.469 g 0.584 g 塩化ナトリウムの各フラスコに塩化カリウムの 0.186 g。</li>
		<li>もたらす、ボリューム 1 L を純水と各フラスコとオートクレーブで液体のサイクル。</li>
		<li>すすり泣きメディアはオートクレーブ後部屋の温度に達すると、メディアの各リットルにカナマイシン (100 mg/mL) の 1 つの mL を追加し、4 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) を確認します。
	<ol>
<li>500 mL の純水に塩基性のカリウム 68.045 g を溶解することにより 1 M カリウム塩基性溶液を作る。</li>
		<li>87.09 g カリウム 500 mL の純水に塩基の溶解によって 1 M カリウム二塩基溶液を作る。</li>
		<li>38.5 mL カリウム塩基性溶液と塩基性のカリウムの 61.5 mL を 1 L ボトルに追加します。</li>
		<li>7.00 必要な場合、pH を調整し、1 L のボリュームをもたらす</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) で 5-40% のサッカロースの勾配を作る。
	<ol>
<li>50 mL 遠沈管に 0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) に溶解 (5% ずつ増えていく) 5-40% スクロース ソリューションを準備します。</li>
		<li>3.3 mL の長い針の注射器を使用して 38 mL 丸底ポリカーボネート管の下部に 5% ショ糖溶液を沈殿物し、他の 5 つのチューブのこの手順を繰り返します。</li>
		<li>慎重にチューブの下部に 10% ショ糖溶液の 3.3 mL を入金し、グラデーションを妨げないよう針を慎重に取り外します。その他の 5 つのチューブに繰り返します。 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>スクロース溶液、グラデーションを邪魔しないように注意しながら各管で 40% に 15% から増加の 3.3 mL 層を預金を続けます。</li>
	<li>完了したら、箔グラデーションのトップをカバーし、-80 ° C で保存</li>
</ol>2. Qβ の式
<ol><li>1:1 漂白剤/エタノール ベンチ領域を拭いてください。</li>
	<li>無菌環境で無菌環境ですすり泣きメディアの 3 mL にエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) のシングル コロニーを追加することによって 2 つの 3 mL スターター文化を作る。</li>
	<li>37 ° C と 0% の相対湿度 (rH) ルームで 250 rpm でシェーカーで一晩成長します。</li>
	<li>
すすり泣きメディア スターター文化を接種します。
	<ol>
<li>シェーカーを両方 3 mL スターター文化を取るし、無菌環境で 2 つのスターターの各カルチャを注ぐ 2 L 困惑新鮮なすすり泣きメディアそれぞれの 1 リットルのエルレンマイヤー フラスコ。</li>
		<li>37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカーに接種のメディアを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>外径600 0.9 ~ 1.0 に達するまで 37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカーで細菌を成長します。</li>
	<li>1 M イソプロピル β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) タンパク質の発現を誘導するために P1000 ピペットを使用しての 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカー一晩メディアを残します。</li>
	<li>メディア シェーカーから次の朝、遠心分離機を使用して削除 1000 mL ボトル 20,621 × g で 4 ° C で 1 時間のセルを収穫します。</li>
	<li>
上澄みを廃棄し、細胞ペレットを収集します。
	<ol>
<li>上清を細菌を殺すために漂白剤約 5 mL をフラスコに注ぐ。これは無駄です。</li>
		<li>遠心ボトルの底から細胞ペレットをこすり、50 mL の遠心管にペレットを入れるには、ヘラを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Qβ の精製
<ol><li>〜 20-30 細胞ペレットを再懸濁します mL の 0.1 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.00)。</li>
	<li>再懸濁は、チャンクを持たないかどうかを確認し、製造元のプロトコルに従って microfluidizer プロセッサを使用して細胞を溶解 (材料の表を参照してください)。粒子の収率を高めるために、少なくとも 2 回の細胞を溶解させます。</li>
	<li>遠心分離機のライセート 20,621 x g で 250 mL 遠心ボトルで 4 ° C で 1 時間</li>
	<li>ペレットを破棄し、mL の上澄みの体積を測定します。0.265 によってその値を乗算し、上清に硫酸アンモニウムの量を追加します。</li>
	<li>タンパク質を沈殿させるのに 200 rpm で攪拌プレート上で、少なくとも 1 時間のための 4 ° C でかき混ぜます。</li>
	<li>4 ° C で 1 時間 20,621 x g で 250 ml の遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) の約 10 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>数秒間原油サンプルとミックスにボルテックスの 1:1 クロロホルム/n-ブタノールの平等なボリュームを追加します。</li>
	<li>4 ° C で 30 分間 38 mL 管 20,621 × g で遠心します。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用してトップの水層を回復します。水溶液と有機層の間を形成している層のようなゲルのいずれかを取らないように注意します。</li>
	<li>6 5-40% 既製サッカロースの勾配を解凍し、それぞれの上に抽出液の約 2 mL をロードします。</li>
	<li>無料減速 4 ° C で 16 時間 99,582 × g で遠心。</li>
	<li>各チューブの下の発光ダイオード (LED) の光を当てるし、青色のバンドが表示されます。長い針の注射器を持つこれらの粒子を回復します。</li>
	<li>Ultrapellet 4 ° C で 2.5 h 370,541 x g で粒子</li>
	<li>上澄みを廃棄し、0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) で精製した粒子の透明ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>4. 数量、製品の確認
<ol><li>ブラッドフォードの試金を使用して、製品13を定量化します。</li>
	<li>実行の削減と非還元ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)14製品を確認します。 注: SDS ページを減らす; 外被蛋白質の分子量を確認するため非還元 SDS-PAGE 高次構造を確認することです。</li>
</ol>5. DB 化合物 Qβ の活用
<ol><li>
Qβ のジスルフィドを減らします。
	<ol>
<li>0.0020 g を溶かす tris(2-carboxyethyl) 1 mL の 100 倍原液を純水にホスフィン (TCEP)。 注: は、削減前に新鮮な TCEP を準備します。</li>
		<li>微量遠心チューブに Qβ (5 mg/mL) の 200 μ L を追加します。</li>
		<li>100 x TCEP 原液の 20 μ L を追加することによって従ってください。</li>
		<li>1 時間室温で孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再ブリッジ削減二硫化 dibromomaleimide ポリエチレング リコール (PEG-DB) を使用します。
	<ol>
<li>DMF の 100 μ L で (DB PEG) dibromomaleimide - ポリエチレング リコールの 0.0017 g を溶解します。</li>
		<li>10 mM リン酸ナトリウム溶液 (pH 5.00) 680 μ L を追加します。</li>
		<li>DB ペグのソリューションに Qβ を削減を追加し、365 nm の紫外線ランプの下で混合過程を観察します。明るい黄色蛍光は、混合時の 365 nm ハンドヘルド UV ランプを即座に視覚化できます。</li>
		<li>一晩、ロティサリー室温 (RT) で進む反応をしましょう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心フィルターによって反応混合物を浄化 (COMW = 10 kDa) 3 回 4 ° C で 20 分 3,283 × g で 1 x PBS を使用して</li>
	<li>非還元 SDS-PAGE とネイティブの agarose のゲルの電気泳動によって活用を監視します。 注: 群集はそのままネイティブ agarose のゲル粒子として実行、彼らは、電荷、サイズや形状に基づいて区切られます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ショ糖勾配遠心法に比べて小さい蛋白質の浄化、浄化バクテリオファージ Qβ でユニークなステップです。Qβ はクロロホルム/n-ブタノール抽出手順の後、5 ~ 40% のサッカロースの勾配を使用してをさらに純化されます。遠心分離中に粒子がそのサイズに基づいて分かれています。大きな粒子は小さな粒子のまま低密度地域における高密度領域に旅行します。Qβ はグラデーションのより低い三番目に移動し、小さい蛋白質の不純物は、遠心分離機管の上部に閉じ込められている間そこに残る。Qβ のコロイド懸濁液を示します強いチンダル散乱ショ糖密度勾配、見ることができる青色のバンドとしてから LED の光を当てるときの下に。このバンドは長い注射針を使用して抽出しやすいし。ショ糖の Qβ には、超遠心、ペレット明確なペレットを降伏します。ペレットは、必要なバッファーに再停止またはタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) によって更に精製できます。結果として得られる粒子の純度は、SDS ページで確認できます。
100 x TCEP 原液をたて水で減少の前に準備されるべきので、TCEP はリン酸バッファー...

ナノサイズのウイルスのカプシドを使用してエキサイティングな分野、生物医学研究1,2,3のアプリケーションの範囲を拡大することを目的として浮上しています。Recombinantly 発現ウイルス様粒子 (群集) は構造的に、ウイルスから派生したが、彼らはそれらに非感染性のタンパク質粒子を作る元のウイルスの遺伝物質を欠いています。表面の特徴は、遺伝的プログラムし、各キャプシドはそれ前後のものに同じように表現の場所および原子レベルの精度でアミノ酸の反応性側鎖の数を知ることは不可能です。多くの場合、外装と内装の両方の表面には各種溶媒露出しているアミノ酸残基を動けなかった化反応反応合成、生体分子間に共有結合を形成する反応を官能基化することができますが所有しています。分子4,5。
化反応の反応は、比較的簡単な方法でより多様な機能を持って興味の分子を助けます。治療薬6、蛍光タグ7およびポリマー8,9など、興味の分子は事前合成でき、それらが群集の表面に接続された前に特徴付けられます。生体に特に一般的な VLP と生体材料研究 recombinantly 表現としては 28 nm の正二十面体のカプシド10バクテリオファージ Qβ に基づいて VLP をされています。Qβ に最も一般的な反応のサイトは、最近 dibromomaleimide ライン ハデルトン ベイカー反応による Qβ の毛穴縮小ジスルフィド化合物の成功活用11をお伝えしてきました、大差でリシンです。反応が良いと進む収量および、同様に重要なは、粒子の熱安定性を失うことなくが。同時にこの反応は、細胞にこれらの粒子の摂取量を追跡する使用ことができます活用誘起蛍光法を生成します。この作品は、明るい黄色の蛍光体にハデルトン ベイカー反応による Qβ の表面上にポリエチレング リコール (PEG) の活用を紹介します。彼らが細胞によってとられる、これらの粒子を追跡、ことができます。本プロトコルはその原則溶媒露出ジスルフィドを含む他の多くの群集の 1 つに適用されますが、タンパク質ナノ粒子 Qβ、に基づいて新しい蛍光ペグインターフェロンを生成の研究者を助けます。

<table><tbody><tr><td>LBブロス(ミラー)&nbsp;</td><td>EMDミリポア</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン、Poweder</td><td>研究製品国際</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物、Poweder</td><td>研究製品国際</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>無水硫酸マグネシウム</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(結晶性/認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP366-500</td><td></td></tr>エル<tr><td>ガPURELABフレックス3浄水システム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基</td>性<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP362-1</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム二塩基性無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP2818500イ</td><td></td></tr><tr><td>ソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>ファイバーライト F10-4x1000 LEX ローター&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>096-041053</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>アンモニウム</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>アルファエー</td><td>ザー32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-ブタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Tiローター、スイングバケット、アルミニウム</td><td>ベックマンコールター</td><td>342204:SW 28 Tiローター/ 342217:バケットセット</td><td></td></tr><tr><td>タイプ70 Tiローター、固定角度、チタン、8 x 39 mL、</td><td>ベックマン・コールター</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Hydrochloride</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-ジブロモマレイミド 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>ポリチレングリコール</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビスアクリルアミド</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>Aldrich L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Labnetリボルバーアジャスタブルローテーター&nbsp;</td><td>トーマス・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Sorvallハイパフォーマンスボトル、PC、アルミキャップ付き&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 遠心分離ボトル(キャップ付き)、ポリプロピレン共重合体</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 丸底チューブ、38 mL;PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2 L 狭口三角フラスコ、ヘビーデューティリム</td>付き <td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P マイクロフルイダイザー 材料プロセッサー</td><td>マイクロフルイディクス</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 高速ポリカーボネート丸底遠心分離管</td><td>サーモScientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>ボトル、キャップ アセンブリ付き、ポリカーボネート</td><td>製ベックマン コールター</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>シリンダー、目盛り付き - ポリプロピレン 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E シリーズ 蒸気滅菌器</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine、細胞培養プレート、処理済み、PS、96 ウェル、蓋付き</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 15 mL コニカル遠心分離管</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロセンティフュージ チューブ: 1.5mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 オービタルシェーカー</td><td>VWR サイエンティフ プロダクツ</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>テトラ・ハンドキャスト・システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン、250 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>分光蛍光光度計 NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Long Needle&nbsp;</td><td>ハミルトン&nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>エクセルインターナショナル5〜6 ccシリンジルアーロック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>インテル 計量 PM-100 ラボ クラシック 高精度 ラボ バランス</td><td>インテリジェント ウェイト テクノロジー</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 mL 円錐形遠心分離機 チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;15% ミニプロティアン TGX ゲル、10 ウェル、50 &micro;l</td><td>バイオ・ラッド</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

近年医療ウイルス様粒子 (群集) の生合成、個々 のサイズ、遺伝的プログラミング、生分解性の容易さの材料研究を帰することができると。彼らは化反応反応表面で合成配位子を追加するために、これらの水溶液生まれカプシドに化反応方法論の範囲は比較的限られています。機能性材料研究の方向性を容易にする、非伝統的な化反応の反応を考慮されなければなりません。このプロトコルで記述されている反応は、バクテリオファージ Qβ に基づいて、VLP の露出のジスルフィド結合の溶媒に新しい機能を導入する dibromomaleimides を使用します。さらに、最終製品が蛍光、市販のフィルターのセットを使用して追跡可能な体外プローブの生成の付加的な利点を持っています。

Dibromomaleimide 誘導体は、dibromomaleimide 無水物とアミン15間の縮合反応によって合成できます。また、N-メトキシカルボニル活性化 3, 4-dibromomaleimide を使用して穏やかな合成法16が収量 DB ・ ペッグ (図 1) に methoxypolyethylene リコール (PEG) と反応してここで悪用されました。NMR は、化合物の構造 (図 2) を識別するために使用されました。Qβ VLP は、28 nm 正二十面体タンパク質ナノ粒子、180 と同じ外被蛋白質で構成されています。外被蛋白質は隣接コート蛋白質17β シートと α ヘリックス ドメインを介して非連動の二量体を形成する傾向があります。群集は、様々 な溶媒組成<sup class="xref...

蛍光 dibromomaleimide と Qβ VLP のジスルフィドを匹敵する手順を紹介します。Dibromomaleimide と Qβ との共役反応 dibromomaleimide 機能分子の合成と精製 Qβ 式について述べる。結果として得られる黄色蛍光共役粒子は細胞内蛍光プローブとして使用できます。

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

このバイオコンジュゲーション法の全体的な目的は、ジスルフィド結合を含むウイルス様粒子を蛍光機能化することです。この手法は、機能化可能なアミノ酸残基の数が限られているウイルス様粒子のバイオコンジュゲーション反応における重要な課題の解決に役立ちます。本技術の主な利点は、1回の反応で新しい官能基を導入すると同時に、コンジュゲーションによって誘導されるフルオロフォアを形成できることです。Q-Betaに加えて、この反応はジスルフィド結合を持つあらゆるウイルス様粒子に適用可能であると考えています。Q-Betaバクテリオファージの発現操作を開始する前に、ベンチエリアを漂白剤とエタノールの1:1混合液で拭き上げます。無菌環境下で、SOB培地にE.coli BL21の単一コロニーを添加し、3 mLのスターター培養液を2本作成します。これらの培養液を、温度37 °C、相対湿度0%の室内で、250 rpmで振とうし、一晩培養します。翌日、シェーカーから2本の3 mLスターター培養液を取り出し、無菌環境下で、それぞれのスターター培養液を1 Lの新鮮なSOB培地が入った2 Lのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに分注します。接種後の培地が入った2本のフラスコを、温度37 °C、相対湿度0%の室内のシェーカーに設置し、250 rpmで振とうします。600 nmにおける光学密度（OD 600）が0.9から1.0に達するまで細菌を増殖させます。これには通常、約5時間かかります。培養液が目的のOD 600に達したら、P1000ピペットを用いて、各フラスコに1 M IPTGを1 mL添加し、タンパク質発現を誘導します。フラスコを温室内のシェーカーに設置したまま、一晩放置します。翌朝、シェーカーからフラスコを取り出し、各フラスコの内容物を1Lボトルに移し、4°Cで20,621 ×gにて1時間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離が終わったら、細菌を死滅させるために約5mLの漂白剤を入れたフラスコに上清を注ぎ、廃棄してください。細胞ペレットを回収するため、スパチュラを用いて遠心ボトル底面から細胞ペレットを掻き取り、50-milliliter遠心チューブに移します。Q-Beta精製の手順を開始するために、各細胞ペレットを20から30 millilitersの0.1-molarリン酸カリウム緩衝液（pH 7）で再懸濁します。再懸濁液に塊がないことを確認してください。製造元のプロトコルに従い、マイクロフルイダイザーを用いて細胞を溶解させます。粒子の収率を高めるため、細胞溶解は少なくとも2回行ってください。溶解物を250-milliliter遠心ボトルに移し、4°Cで20,621 ×gにて1時間遠心分離します。上清の容量をmillilitersで測定します。その値に0.265を掛け、得られた量（grams）の硫酸アンモニウムを上清に加えます。撹拌子を加え、撹拌機を用いて4°C、200 rpmで少なくとも1時間撹拌し、タンパク質を沈殿させます。250-milliliterボトルを用い、4°Cで20,621 ×gにて1時間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを約40 millilitersの0.1-molarリン酸カリウム緩衝液（pH 7）で再懸濁します。この粗サンプルに同量の1:1クロロホルム:n-Butanolを加え、ボルテックスミキサーで数秒間混合します。混合液を38-milliliterチューブに移します。4°Cで20,621 ×gにて30分間遠心分離します。ピペットを用いて最上層の水層を回収します。このとき、水層と有機層の間に形成されたゲル状の層を採取しないよう注意してください。次に、あらかじめ作製しておいた65%から40%のショ糖密度勾配溶液を融解します。各勾配に抽出液を約2 mLずつロードします。4°Cで16時間、重力加速度の99,582倍で超遠心分離を行い、減速はフリーに設定します。超遠心分離の完了後、各チューブの下からLEDライトを照射し、青色のバンドが確認できることを確かめます。これらの粒子を回収するために、長い針のシリンジを使用します。その後、粒子を4°Cで2.5時間、重力加速度の370,541倍で超遠心沈殿させます。得られた精製粒子のペレットは透明であるはずです。上清を廃棄し、pH 7の0.1 M リン酸カリウム緩衝液でペレットを再懸濁します。この概略図は、これから実演するコンジュゲーションを示しています。1 mgのQ-Betaに含まれるジスルフィドに対する10当量のTris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）を用い、室温で1時間処理することで、すべてのジスルフィドを還元し、還元型Q-Betaカプシドを生成させます。Q-Betaのジスルフィド還元を行う直前に、新鮮なTCEP溶液を調製してください。0.002 gのTCEPを1 mLの超純水に溶解し、100倍ストック溶液を調製します。5 mg/mLのQ-Betaを200 µL、マイクロ遠心チューブに加えます。次に、100倍TCEPストック溶液を20 µL、そのマイクロ遠心チューブに加えます。室温で1時間インキュベートします。その間に、還元されたジスルフィドの再架橋反応に使用するジブロモマレイミドポリエチレングリコール（DB-PEG）溶液を調製します。0.0017 gのDB-PEGを100 µLのジメチルホルムアミドに溶解させます。そこに10 mMのリン酸ナトリウム溶液（pH 5）を680 µL加えます。次に、還元したQ-BetaをDB-PEG溶液に加え、365 nmのハンドヘルドUVランプで混合過程を観察します。混合すると、直ちに明るい黄色蛍光が視認されるはずです。この反応液をロティセリーに入れ、室温で一晩放置します。翌朝、1X PBSを用い、4°C、3,283 ×gで20分間、遠心フィルターを用いて反応混合物を精製します。最後に、非還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびネイティブアガロースゲル電気泳動により、接合を確認します。Q-BetaへのDB-PEGの抱合は、非還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、UV照射およびクマシーブルー染色によって確認した。すべての蛍光バンドがクマシーブルー染色部位と共局在しており、抱合が成功したことが示された。Q-Beta-PEG抱合体の完全性は、ネイティブアガロースゲル電気泳動および透過型電子顕微鏡によって確認した。上の顕微鏡写真にQ-Beta-maleimide（Q-Beta-M）を、下の顕微鏡写真にQ-Beta-PEGを示します。0.1 molarのリン酸カリウム緩衝液中におけるQ-Beta-MおよびQ-Beta-PEGの蛍光分光分析では、励起極大が400 nanometers付近に、蛍光極大が540 to 550 nanometers付近に認められました。Q-Beta-PEGを無血清DMEM培地中でマウスマクロファージ細胞とインキュベートし、続いて核染色を行ったところ、共局在画像により、黄色蛍光粒子が細胞に取り込まれ、インキュベートから4時間後に追跡可能であることが示されました。対照的に、機能化されていないQ-Betaウイルス様粒子は、無視できる程度の蛍光しか示しません。このプロトコルは、研究者が4日間でQ-Betaを精製し、一晩の再架橋接合反応を行うのに役立ちます。この手順を実施する際は、接合反応がpH 5などの酸性条件下で最適に進行することを忘れないことが重要です。このビデオを視聴することで、Q-Beta VLPを精製し、ジブロモマレイミド化合物を用いてジスルフィド結合を再架橋して蛍光標識VLPを作製する方法を十分に理解できるはずです。この技術の開発により、研究者はバクテリオファージQ-Betaの外表面を二重機能化するために使用できる、新たな機能的ハンドルを得ることができました。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶジブロモマレイミドを用いた二硫化物含有ウイルス様粒子の蛍光標識法。Qβバクテリオファージの精製と単一反応による新規官能基導入と蛍光体形成を同時に実現し、細胞内追跡に応用可能な技術です。

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロンウイルス様粒子を抱合誘導を作る

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