Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

このバイオコンジュゲーション法の全体的な目的は、ジスルフィド結合を含むウイルス様粒子を蛍光機能化することです。この手法は、機能化可能なアミノ酸残基の数が限られているウイルス様粒子のバイオコンジュゲーション反応における重要な課題の解決に役立ちます。本技術の主な利点は、1回の反応で新しい官能基を導入すると同時に、コンジュゲーションによって誘導されるフルオロフォアを形成できることです。Q-Betaに加えて、この反応はジスルフィド結合を持つあらゆるウイルス様粒子に適用可能であると考えています。

Q-Betaバクテリオファージの発現操作を開始する前に、ベンチエリアを漂白剤とエタノールの1:1混合液で拭き上げます。無菌環境下で、SOB培地にE.coli BL21の単一コロニーを添加し、3 mLのスターター培養液を2本作成します。これらの培養液を、温度37 °C、相対湿度0%の室内で、250 rpmで振とうし、一晩培養します。翌日、シェーカーから2本の3 mLスターター培養液を取り出し、無菌環境下で、それぞれのスターター培養液を1 Lの新鮮なSOB培地が入った2 Lのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに分注します。接種後の培地が入った2本のフラスコを、温度37 °C、相対湿度0%の室内のシェーカーに設置し、250 rpmで振とうします。600 nmにおける光学密度（OD 600）が0.9から1.0に達するまで細菌を増殖させます。これには通常、約5時間かかります。培養液が目的のOD 600に達したら、P1000ピペットを用いて、各フラスコに1 M IPTGを1 mL添加し、タンパク質発現を誘導します。フラスコを温室内のシェーカーに設置したまま、一晩放置します。

翌朝、シェーカーからフラスコを取り出し、各フラスコの内容物を1Lボトルに移し、4°Cで20,621 ×gにて1時間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離が終わったら、細菌を死滅させるために約5mLの漂白剤を入れたフラスコに上清を注ぎ、廃棄してください。

細胞ペレットを回収するため、スパチュラを用いて遠心ボトル底面から細胞ペレットを掻き取り、50-milliliter遠心チューブに移します。

Q-Beta精製の手順を開始するために、各細胞ペレットを20から30 millilitersの0.1-molarリン酸カリウム緩衝液（pH 7）で再懸濁します。再懸濁液に塊がないことを確認してください。製造元のプロトコルに従い、マイクロフルイダイザーを用いて細胞を溶解させます。粒子の収率を高めるため、細胞溶解は少なくとも2回行ってください。溶解物を250-milliliter遠心ボトルに移し、4°Cで20,621 ×gにて1時間遠心分離します。上清の容量をmillilitersで測定します。その値に0.265を掛け、得られた量（grams）の硫酸アンモニウムを上清に加えます。撹拌子を加え、撹拌機を用いて4°C、200 rpmで少なくとも1時間撹拌し、タンパク質を沈殿させます。250-milliliterボトルを用い、4°Cで20,621 ×gにて1時間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを約40 millilitersの0.1-molarリン酸カリウム緩衝液（pH 7）で再懸濁します。この粗サンプルに同量の1:1クロロホルム:n-Butanolを加え、ボルテックスミキサーで数秒間混合します。混合液を38-milliliterチューブに移します。4°Cで20,621 ×gにて30分間遠心分離します。ピペットを用いて最上層の水層を回収します。このとき、水層と有機層の間に形成されたゲル状の層を採取しないよう注意してください。

次に、あらかじめ作製しておいた65%から40%のショ糖密度勾配溶液を融解します。各勾配に抽出液を約2 mLずつロードします。

4°Cで16時間、重力加速度の99,582倍で超遠心分離を行い、減速はフリーに設定します。超遠心分離の完了後、各チューブの下からLEDライトを照射し、青色のバンドが確認できることを確かめます。これらの粒子を回収するために、長い針のシリンジを使用します。その後、粒子を4°Cで2.5時間、重力加速度の370,541倍で超遠心沈殿させます。得られた精製粒子のペレットは透明であるはずです。上清を廃棄し、pH 7の0.1 M リン酸カリウム緩衝液でペレットを再懸濁します。

この概略図は、これから実演するコンジュゲーションを示しています。1 mgのQ-Betaに含まれるジスルフィドに対する10当量のTris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）を用い、室温で1時間処理することで、すべてのジスルフィドを還元し、還元型Q-Betaカプシドを生成させます。Q-Betaのジスルフィド還元を行う直前に、新鮮なTCEP溶液を調製してください。

0.002 gのTCEPを1 mLの超純水に溶解し、100倍ストック溶液を調製します。5 mg/mLのQ-Betaを200 µL、マイクロ遠心チューブに加えます。次に、100倍TCEPストック溶液を20 µL、そのマイクロ遠心チューブに加えます。室温で1時間インキュベートします。

その間に、還元されたジスルフィドの再架橋反応に使用するジブロモマレイミドポリエチレングリコール（DB-PEG）溶液を調製します。0.0017 gのDB-PEGを100 µLのジメチルホルムアミドに溶解させます。そこに10 mMのリン酸ナトリウム溶液（pH 5）を680 µL加えます。次に、還元したQ-BetaをDB-PEG溶液に加え、365 nmのハンドヘルドUVランプで混合過程を観察します。混合すると、直ちに明るい黄色蛍光が視認されるはずです。この反応液をロティセリーに入れ、室温で一晩放置します。

翌朝、1X PBSを用い、4°C、3,283 ×gで20分間、遠心フィルターを用いて反応混合物を精製します。最後に、非還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびネイティブアガロースゲル電気泳動により、接合を確認します。

Q-BetaへのDB-PEGの抱合は、非還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、UV照射およびクマシーブルー染色によって確認した。すべての蛍光バンドがクマシーブルー染色部位と共局在しており、抱合が成功したことが示された。Q-Beta-PEG抱合体の完全性は、ネイティブアガロースゲル電気泳動および透過型電子顕微鏡によって確認した。

上の顕微鏡写真にQ-Beta-maleimide（Q-Beta-M）を、下の顕微鏡写真にQ-Beta-PEGを示します。0.1 molarのリン酸カリウム緩衝液中におけるQ-Beta-MおよびQ-Beta-PEGの蛍光分光分析では、励起極大が400 nanometers付近に、蛍光極大が540 to 550 nanometers付近に認められました。Q-Beta-PEGを無血清DMEM培地中でマウスマクロファージ細胞とインキュベートし、続いて核染色を行ったところ、共局在画像により、黄色蛍光粒子が細胞に取り込まれ、インキュベートから4時間後に追跡可能であることが示されました。

対照的に、機能化されていないQ-Betaウイルス様粒子は、無視できる程度の蛍光しか示しません。

このプロトコルは、研究者が4日間でQ-Betaを精製し、一晩の再架橋接合反応を行うのに役立ちます。この手順を実施する際は、接合反応がpH 5などの酸性条件下で最適に進行することを忘れないことが重要です。

このビデオを視聴することで、Q-Beta VLPを精製し、ジブロモマレイミド化合物を用いてジスルフィド結合を再架橋して蛍光標識VLPを作製する方法を十分に理解できるはずです。この技術の開発により、研究者はバクテリオファージQ-Betaの外表面を二重機能化するために使用できる、新たな機能的ハンドルを得ることができました。