Name: 2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶ タンパク質・タンパク質代謝物相互作用の並列解析法。Arabidopsis thaliana培養細胞を用いた親和性浄化と質量分析により、in vivo条件下で相互作用分子を同定する効率的なプロトコルを解説します。

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我々 はプロジェクト、生産的な議論と偉大な監督の彼の介入のため教授ローター Willmitzer がのでご了承いただきたいと思います。プロテオーム MS 測定を助けるため博士ダニエル Veyel に感謝しております。夫人 Änne ミハイル LC-MS 測定で非常に貴重な技術サポートご提供くださったお願い申し上げます。さらに、テクニカル サポートの Weronika Jasińska に支援と元の原稿と仕事で関わり博士モニカー Kosmacz と博士 Ewelina Sokołowska に感謝したいと思います。

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
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<li>Ramírez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson%27s+disease-associated+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).</li>
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<li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li>
<li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
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<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li>
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<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).</li>
<li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUBAcon%3A+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li>
<li>Katajamaa, M., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STITCH+5%3A+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li>
<li>Tanaka, K. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li>
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<li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

提案するプロトコルは、ターゲット蛋白質の PP と午後の複合体の並列識別を許します。最終結果へのクローン作成から実験は 8 〜 12 週間ほどで完了ことができます。完全な AP は、我々 のプロトコルを半ばスループット解析に適したレンダリング 12 に 24 サンプルのセットの約 4-6 時間かかります。
にもかかわらず全体的に簡単です、プロトコルには、いくつかの重要な手順があります。(入力蛋白質のアフィニティ ビーズ i) 十分な量は、代謝物の検出のダイナミック レンジに到達する重要です。したがって、効率的なセル換散ですプロシージャの重要なステップです。悪い蛋白質収量は、材料または次善の換散バッファー/材料比率の不十分な粉砕の結果をすることができます。(使用試薬が MS 向けであること、ii) 注意をすべき。彼らは MS 検出に干渉としては、強い洗剤、グリセリン、または塩の過剰を避けるべき。(iii) アガロース ビーズ過剰乾燥の手順を洗う時にする必要がありますいないと真空マニホールドを使用する場合は、ビーズを破壊する複雑な安定性に影響しないように低速流率を適用することが重要です。
提案するプロトコルをいくつかの重要な可能な修正がある: (i) 構成の CaMV35S プロモーターを使用して、餌の蛋白質の量を最大化します。過剰発現、非常に便利ですが、細胞の恒常性28に深刻な影響を与えることができるし、生理学的関連性の低い相互作用の形成に 。ネイティブのプロモーター、機能喪失バック グラウンドで可能な限りが真の生物学的インターアクターを取得するための優れたと見なされますを使用して付けられた蛋白質の表現。植物細胞培養で通常は表される蛋白質のため工場の背景が関連するインターアクターを識別するために必要な証明するかもしれない。(ii) 膜タンパク質を使用する場合、換散バッファーは MS 互換洗剤を補充する必要があります。(iii) 2 番目の親和性の浄化のステップの導入は真陽性率に偽陽性を改善できるし、EV コントロール29のための必要性を排除します。2 つの独立したプロテアーゼ切断サイト新規タンデム タグは、面倒で時間のかかる作業である前田ら201411追加サイズ排除クロマトグラフィー ステップに魅力的な代替手段を提示します。
AP の最も重大な欠点は、偽陽性の率が高いです。理由はたくさんあります。構成の過剰発現は、すでに言及されました。生理学的関連性の低い相互作用の別のソース分離細胞小器官を扱うを除き蛋白質および別の細胞内コンパートメントからの代謝物質の混合物を含む全体セル lysates の準備です。内局は、true インターアクターのフィルターに使用する必要があります。それにもかかわらず、不明確な結合蛋白質とアガロース樹脂の間起因する偽陽性の大半。はじめに 2 番目の精製ステップの前述のように、問題に最適なソリューションを提供しています、しかし時間とスループットを犠牲にして来る。さらに、プロトコルが長くなるにつれて弱い相互作用が失われることがあります。AP のもう一つの注意点は、包括的な情報を提供しています、インタラクトームについてターゲット蛋白質のにもかかわらず餌タンパク質の直接的および間接的なターゲット間の区別は不可能であります。ターゲットを絞った分子アプローチが相互作用を確認するため必要です。
MS ベース メタボロミクスと相まって AP を用いて酵母12.の蛋白質複合体の研究私たち以前観察13同様に脂質を極性、半極性化合物に結合したまま細胞溶解液から分離されたタンパク質複合体とともに、この仕事は、提案するプロトコルの概念的な基礎を提供しました。私達のプロトコルは 3 つのユニークなポイントによって特徴付けられる: (i) 対照的に、酵母に働く12AP は疎水性がまた親水性のタンパク質だけでなく有機配位子を取得するのに適しているを示します。(ii) 3 つの抽出のプロトコルを用いて、単一の AP を使用して餌タンパク質のタンパク質と代謝産物のインターアクターを勉強できます。(iii) は植物細胞にプロトコールを適用しました。
今後の取り組みは、2 つの独立したプロテアーゼ切断サイトで新規タンデム タグの作成について説明します。我々 はまた植物ホルモンなど低豊富小さい分子にプロトコルの適合性を探索したいと思います。

方法はここで説明近く体内細胞ライセート条件で選択の蛋白質の代謝産物やタンパク質のパートナーの同定を目指す。それは、今日特徴付けられるより多くより多くの代謝物が規制の重要な機能の1であることが推測されています。代謝生物学的スイッチ、活動、機能、および/またはその受容体タンパク質2,3,4のローカリゼーションを変更として使用できます。過去 10 年間で識別 PMI体内のまたは近い-生体内での条件でを有効にするいくつかの画期的な方法が開発5をされています。使用可能なアプローチは、2 つのグループに分類できます。最初のグループは構成蛋白質パートナーをトラップするために知られている代謝物餌で始まる技術です。親和性クロマトグラフィー6、薬物親和性応答ターゲット安定性アッセイ7、化学療法プロテオミクス8、9をプロファイリング熱プロテオームなどの方法。2 番目のグループは、小分子リガンド10,11を識別するために知られていた蛋白質で始まる 1 つのメソッドで構成されています。
MS ベース リピドと相まって AP が酵母12.タンパク質脂質複合体の分析に使用されました。開始点として、著者はエルゴステ ロールの生合成に関与する 21 の酵素を表現する酵母を使用、タンデム親和性の浄化 (蛇口) タグに融合した 103 キナーゼ。酵素の 70% と、キナーゼの 20% は、複雑なタンパク質-脂質相互作用ネットワークに光を流して別の疎水性配位子をバインドする発見されました。
以前は、我々 は、同様に脂質を極性、半極性化合物もに結合したまま細胞ライセート13から分離されたタンパク質複合体を示すことができます。我々 は ap 通信を最適化することを決めたこれらの調査結果に基づいて、メソッドは植物細胞と親水性化合物14の10、11以前公開します。この目的のため、バン リーネら2010 年工場 PPI 研究15で正常に使用によって記述されたタップ ベクトルを使用しました。トランスジェニックは行を取得するために必要な時間を短縮、シロイヌナズナ細胞培養しました。我々 採用ワンステップ メチルtert-ブチル エーテル、(MTBE)/メタノール/水抽出法、単一のタンパク質 (ペレット)、脂質 (有機相)、および親水性代謝産物 (水相)16の評価を許可します。親和性の浄化実験。EV の制御線は、偽陽性、単独でのタグに結合する蛋白質などを除外する導入されました。タグ付け (5) の 3 つのコンセプトの証明としてヌクレオシド二リン酸キナーゼ (NDPK1-NDPK3) シロイヌナズナのゲノムに存在します。その他の所見の中で我々 は NDPK1 がグルタチオンSと対話することを示すことができます-トランスフェラーゼとグルタチオン。したがって我々 は NDPK1 は glutathionylation14に服従することを証明できます。
要するに、提案するプロトコルはタンパク質間およびタンパク質-低分子間相互作用ネットワークの特性評価に重要なツールで、既存方法と比べて大きな進歩を構成します。

<table><tbody><tr><td>ムラシゲとスクーグ 有機物が最小限の基礎塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-ナフチル酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>キネチン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>カール・ロス</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 プロテアーゼ阻害剤</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&nbsp;Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag 抗体 (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/Lys-C ミックス、質量分析グレード</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr>尿<tr><td>素</td><td>Σ-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr>チ<tr><td>オ尿素</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Σ-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr>ヨー<tr><td>ドアセトアミドΣ-Aldrich</td><td></td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td>メタノール<td>138906</td><td></td> <td>Biosolve</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸&nbsp;</td>ギ酸<td>202341</td><td></td> <td>Biosolve</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 プラットフォーム シェーカー</td><td>ハイドル</td>フ <td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン メッシュ (線径 34 & マイクロ;M、厚さ55 & マイクロ;M、オープンエリア14%)</td><td>Prosepa</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>ガラス漏斗、47 mm、300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr>フィルター<tr><td>ボトルトップ500 mL 0,2 & マイクロ;M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>ミキサーミル MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG セファロース 6 ファストフロー</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol "Classic"" フィルターなしの2つの異なるスクリューキャップ</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>フィルター(小)35&マイクロ;M孔径、Mobicol M 1002、M1003、M1050 &M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>可変速チューブローテーター SB 3</td><td>カール・ロス</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>ローテーター用ロータリーディッシュ SB 3</td><td>カール・ロス</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>レスプレップ 24ポートSPEマニホールド</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE カラム 100mg / 1ml</td><td>テクノクロマ</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラー&nbsp;バイアルクラ</td><td>ウス・トロットクロマトグラフィー-Zubeh&ouml;r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC カラム</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 液体クロマトグラフ</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus ハイブリッド四重極-Orbitrap 質量分析計</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC システム&nbsp;</td><td>ウォーターズ&nbsp;</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 カラム、100A、1.8 &micro;M、2.1 mM X 100 mM、1/pkg</td><td>ウォーターズ&nbsp;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>水溶液用ハイパワー超音波洗浄槽</td><td>バンデリン</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

細胞はタンパク質、代謝、核酸などの生体分子間の相互作用によって規制されています。タンパク質間相互作用 (PPI) の調査に目新しさはなく、内因性のタンパク質代謝相互作用 (PMI) を特徴付けることを目指して実験的アプローチはむしろ最近開発を構成します。ここで、PPI と選択、餌と呼ばれるタンパクの PMI の同時解析を可能にするプロトコルを提案する.我々 のプロトコルを最適化しましたシロイヌナズナ細胞文化し、親和性の浄化 (AP) を組み合わせた質量分析法 (MS)-基づくタンパク質と代謝産物の検出。一言で言えば、親和性タグに融合餌蛋白を発現するトランスジェニックのシロイヌナズナ ラインの最初ネイティブ細胞抽出物を取得する服従分離します。抗タグ抗体を使用して、餌の蛋白質のタンパク質と代謝産物のパートナーをプルダウンします。ワンステップ メチルtertを用いたアフィニ ティー精製錯体を抽出-ブチル エーテル (MTBE)/メタノール/水法。ながら代謝を極または疎水性相に分離、ペレットの蛋白質を見つけることができます。代謝産物やタンパク質は、超高性能液体クロマトグラフィー質量分析法 (高精度 MS または高精度・ MS/MS) によって分析しています。空のベクトル (EV) 制御線は、偽陽性を除外する使用されます。プロトコルの主な利点は、近く生理的条件 (細胞ライセート) で並行してターゲット蛋白質のタンパク質と代謝産物のパートナーの同定が可能です。提案手法は簡単です高速で、植物細胞培養以外の生物学的システムに簡単に適応することができます。

元の研究では、3 つのシロイヌナズナNDPK 遺伝子が構成 35S プロモーター14 (図 1) の制御の下で PSB L 細胞懸濁培養における過剰発現。タンデム親和性のタグは餌の蛋白質のカルボキシまたはアミノ ターミナル端に融解する.アフィニ ティー精製錯体は、MTBE/メタノール/水抽出16に服従しました。アフィニティ引っ張ったタンパク質と低分子化合物は、MS (テーブル S2 と S3) を使用して識別されました。
偽陽性を修正するには、空白のサンプルは研究室の消耗品と化学物質から低分子汚染物質を除外する使用されました。さらに、代謝産物やタンパク質親和性タグのいずれかにバインドするだけで樹脂はいた EV 制御線を使用して、占めています。真陽性、2 非対スチューデントの t 検定と Benjamini &amp; ホフベルク虚偽の発見率を取得するには、補正を代謝産物 (表 S4) とタンパク質 (テーブル S5) 大幅 NDPKs AP の濃縮を識別するために適用しました。EV の制御線と比較して実験 (NDPKs と N- と C 末端タグ付き) (FDR &lt; 0.1)。前の仕事で、タンパク質と低分子のインターアクターの線引きに不在/プレゼンス基準を使用我々 に注意してください。
代表的な結果は、ジペプチド、我々 のグループで研究小分子レギュレータの新規クラスの代謝産物データ フォーカスしながら NDPK1、ために与えられます。プロテオーム解析では、NDPK1 の 26 と推定される蛋白質パートナーを明らかにしました。さらにフィルター NDPK1 として同じ細胞レベル下コンパートメントの共局在蛋白質 (細胞質)、13 と推定されるタンパク質インターアクターにリストを絞り込みます。識別された蛋白質の間でされたグルタチオンS-トランスフェラーゼ、2 つ伸長因子、チューブリン、aconitate ニトリルヒドラターゼ。4 つのジペプチド ヴァル ・ ルー、イル Glu ルー-イル、イルを NDPK1 とペー具体的共同溶出するメタボローム解析が明らかに (図 2)。すべての 4 つのジペプチドの N 末端、共有結合特異性を示唆している疎水性残基を共有することに注意してください。
我々 既知のタンパク質とタンパク質代謝物の複合体のために、照会された 13 は蛋白質、ステッチ データベース25 (図 3) に対して 4 つのジペプチドを検出しました。いくつかの観測を作ることができる: (i) NDPK1 以前報告されたインターアクターのどれも。(ii) APX1 オーソログがアルデヒド脱水素酵素家族メンバー ALDH7B4、翻訳開始因子 FBR12 遺伝子 AT2G40290 別の翻訳開始因子としながらやり取りする報告されました。(iii) 特定のジペプチドはない蛋白質パートナーを報告しています。共同溶出ジペプチドが取得した植物蛋白質を関連付けられている以前に報告されたないです。しかし、彼らは他の生物に重要な役割を果たして: ルー-イル、例えば、ひと細胞ライン26神経栄養因子活性化の効果があります。実験では、システムの正確なトポロジを識別できないことに注意してください。たとえば、ジペプチドは NDPK1 と直接対話することがありますが、よく共同浄化された蛋白質のいずれかに関連している可能性があります。
一緒に取られて、私達の結果表示設立の手順、質量分析法と AP を用いたタンパク質間およびタンパク質-低分子インターアクターの同定を容易にし、についての広汎な情報の作成を支援します標的タンパク質のインタラクトーム。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> 図 1。AP MS ワークフローの方式です。(A)植物細胞培養からネイティブ可溶性画分の調製。(B)次の手順の AP。列にサンプルをロードした後 (ポイ) タップ タグ融合タンパク質は、アガロース ビーズに固定化した抗体にバインドします。列の洗浄は、非連結のタンパク質と代謝産物の除去を促進します。AcTEV 胸の谷間を実行した後ポイ タンパク質代謝物の複合体に溶出されます。(C)分離複合体の半定量的な分析に続いてタンパク質と代謝産物の割合。この図の一部は、Luzarowski et al. 201714から再現します。<a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> 図 2。具体的には共同 NDPK1 と溶出性ジペプチド。ヴァル ・ ルー (A)、イル Glu (B)、ルー-イル(C)、およびイル Phe (D) AP の実験で測定した 4 つのジペプチドの平均強度をプロットしました。すべての 4 つのジペプチド EV コントロールと比較して NDPK1 サンプルの重要な濃縮を表示する (アスタリスクは FDR を表す &lt; 0.1)。誤差範囲を表す六つの測定の標準誤差 (N-3 複製と C 末端の 3 タグ付きタンパク質)。<a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> 図 3。前のみを考慮したステッチ データベースに対してクエリを実行共同 NDPK1 と溶出性すべての分子の相互作用ネットワーク実験およびデータベース証拠 (自信 &gt; 0.2).高い信頼は相互作用の高い可能性を示し、堆積のデータに基づいて計算されます。<a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
テーブル S1。MaxQuant は出力テーブル"parameters.txt"です。テーブルには識別と定量化、として使用するデータベースについての情報のためのしきい値が含まれています。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
テーブル S2。MaxQuant からの情報出力テーブル"proteinGroups.txt"。テーブルには、すべての識別された蛋白質のグループの強度とユニークなペプチドとスコアの数などの追加情報の一覧が含まれています。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
テーブル S3。代謝物の分析を含む出力ファイル。テーブルには特定 m/z、RT および強度によって特徴付けられるすべての識別された質量の機能の一覧が含まれます。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
表 S4。ジペプチドは餌として使用された NDPK1、NDPK2 または NDPK3 AP サンプルで発見しました。ジペプチド空白のサンプルで現在がリストから除外されました。各 NDPK の 2 つの独立した行 (タグ付きの N 末端または C 領域のいずれかで) は、3 通で実行されました。学生のt-テスト、 pの補正をさらに-Benjamini を使用しての値 &amp; ホフベルク メソッドを用いて NDPKs の大幅充実した入力/終端] パートナーを決定 (FDR &lt; 0.1)。与えられた ΔRT は参照化合物の質量は、Metlin27モノアイソに関連して Δppm に関連して計算します。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
テーブル S5。共同 NDPK1 で精製したタンパク質。各 NDPK の 2 つの独立した行 (N 末端または C 領域のいずれかのタグ付き) の 3 通で実行されました。学生のt-テスト、 pの補正をさらに-Benjamini を使用しての値 &amp; ホフベルク メソッドを用いて NDPKs の大幅充実した入力/終端] パートナーを決定 (FDR &lt; 0.1)。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

この手法は、基礎研究における重要な課題解決に活用できるだけでなく、必須タンパク質の新規低分子リガンドを解明することで、医学、医薬、バイオテクノロジーの分野にも貢献することができます。この技術の主な利点は、密接な生体内条件で、選択したタンパク質と選択したタンパク質の代謝パートナーの並行分析を可能にすることです。この方法は、事前に選択されたリガンドに制限されることなく、相互作用する分子を釣り上げるのに役立ちます。この方法は植物用に開発されましたが、HeLa細胞、大腸菌、S.Cerevisiaeなどの他のシステムにも適用できます。まず、MSMO培地を調製し、1モルの水酸化カリウムでpHを5.7に調整します。次に、溶液を摂氏121度で15分間オートクレーブします。実験開始直前にサプリメントを培地に加えます。次に、トランスジェニックPSBLシロイヌナズナ細胞培養物を、100ミリリットルのフラスコ内の50ミリリットルのMSMO培地で培養します。次に、フラスコを軌道プラットフォームシェーカーに置き、光の中で130rpm、摂氏20度で細胞を穏やかに攪拌します。7日ごとに、新鮮な培地で細胞を1〜10溶液で継代培養します。次に、円錐形のフラスコにナイロンメッシュを取り付けたガラス漏斗を使用し、真空ポンプに接続して、対数成長段階で細胞を採取します。次に、乾燥させた細胞をアルミホイルで包み、液体窒素で凍結します。事前に冷却されたミキサーミルを使用して、20ヘルツの振動周波数に設定します。収穫して凍結した植物細胞材料を微粉末に2分間均質化します。次に、液体窒素を使用して、サンプルごとに3グラムの粉砕粉末を分注し、解凍を防ぐために事前に冷却した装置を使用します。次に、液体窒素予冷モルタルを使用して、粉砕粉末を3ミリリットルの氷冷溶解バッファーで融解するまで粉砕します。解凍したサンプルをすぐに2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分割します。サンプルを20、817gで摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除きます。サンプルを遠心分離している間、サンプルあたり100マイクロリットルのIgGセファロースビーズを分注してください。1ミリリットルの溶解バッファーを添加し、ボルテックスによりビーズを再懸濁します。フラッシュスピンを2, 000 gで3秒間回転させ、溶解バッファーを廃棄します。最後に、ビーズを400マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。遠心分離後、透明な植物溶解物の3ミリリットルを15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに移します。あらかじめ平衡化したビーズを植物溶解物に加え、回転するホイール上で4°Cで1時間インキュベートします。真空マニホールドの上部にある35マイクロメートルの細孔サイズのフィルターを備えたスピンカラムのルアーロックキャップに接続されたシリンジに混合物を移します。ビーズへの害を避けるために、真空ポンプを穏やかな圧力でオンにして、ライセートをユニットに通します。結合していないライセートは、マニホールドの基部にある廃棄物ステーションに排出され、ビーズに結合したタンパク質複合体はフィルター上に残ります。シリンジを細胞溶解液から空にしたら、10ミリリットルの洗浄バッファーを加えてビーズを洗浄します。次に、ミリリットルの溶出バッファーを添加して、2回目の洗浄ステップを実行します。次に、シリンジとルアーロックキャップを取り外します。カラムの底蓋を閉じ、50ユニットのタバコエッチングウイルスであるプロテアーゼを含む溶出緩衝液400μLをビーズに加えます。カラムをテーブルシェーカーに置き、摂氏16度で30分間、1, 000rpmに設定します。次に、さらに50ユニットのプロテアーゼをカラムに加え、前のステップと同様に混合物をシェーカー上でインキュベートします。次に、ボトムキャップを取り外し、カラムを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに交換します。20, 817 gで1分間遠心分離し、溶出液を収集し、タンパク質および代謝物の抽出を進めます。抽出を開始するには、溶出液に3〜1対1のMTBEメタノール水溶媒1ミリリットルを加えます。チューブを反転させてサンプルに混合します。次に、0.4ミリリットルの1〜3メタノール水溶液を混合物に加え、チューブを反転させてサンプルを混合します。次に、サンプルを室温で20,817gで2分間遠心分離し、相分離を可能にします。1ミリリットルの手動リキッドハンドリングピペットを使用して、脂質を含む上相を取り除きます。次に、0.2ミリリットルのメタノールを加え、チューブを反転させてサンプルを混合します。室温で20、817gで2分間遠心分離し、代謝物測定のために新しいチューブに極性相を回収します。タンパク質ペレットが外れないように、チューブの底に約50マイクロリットルの極性相を残します。次に、極性相を含むチューブを遠心蒸発器で一晩乾燥させます。プロテインペレットのチューブを30〜60分間乾燥させ、過乾燥を避けます。ワンステップアフィニティー精製を用いて、トランスジェニックシロイヌナズナ細胞培養におけるタンパク質-タンパク質間およびタンパク質-代謝物相互作用が同定されています。NDPK1を発現する細胞培養物は、エンプティベクター、NDPK2、NDPK3サンプルと比較して、バリンロイシン、グルタミン酸イソロイシン、ロイシンイソロイシン、およびイソロイシンフェニルアラニンに有意な濃縮を示します。既知のタンパク質-タンパク質およびタンパク質-代謝物の相互作用を探すために、NDPK1と共溶出する13のタンパク質と4つのジペプチドをステッチデータベースに対してクィアします。主な関連性は、APX1オルソログとアルデヒドデヒドロゲナーゼファミリー、および翻訳開始因子であるFBR12と翻訳開始因子2サブユニットのアルファホモログとの間に見られます。同定されたジペプチドは、報告されたタンパク質パートナーを示していません。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば4時間で完了します。この手順を試行する際は、実験全体を通してサンプル、装置、試薬を冷たく保つことが重要です。この手順に続いて、顕微鏡熱泳動や活性アッセイなどの他の方法を実行して、分子間の直接的な相互作用やタンパク質活性に対するそれらのリガンドの推論を決定することができます。このビデオを見れば、全手順でサンプルを取り扱う方法を理解し、信頼できる結果を得て、選択したタンパク質のリガンドを特定できるはずです。メタノールとMTBE溶液の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。適切な個人用保護具を着用し、この手順を実行するときは、ドラフトの下での作業などの予防措置を常に講じる必要があります。

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