2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ
August 6th, 2018
タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。
この手法は、基礎研究における重要な課題解決に活用できるだけでなく、必須タンパク質の新規低分子リガンドを解明することで、医学、医薬、バイオテクノロジーの分野にも貢献することができます。この技術の主な利点は、密接な生体内条件で、選択したタンパク質と選択したタンパク質の代謝パートナーの並行分析を可能にすることです。この方法は、事前に選択されたリガンドに制限されることなく、相互作用する分子を釣り上げるのに役立ちます。
この方法は植物用に開発されましたが、HeLa細胞、大腸菌、S.Cerevisiaeなどの他のシステムにも適用できます。まず、MSMO培地を調製し、1モルの水酸化カリウムでpHを5.7に調整します。次に、溶液を摂氏121度で15分間オートクレーブします。
実験開始直前にサプリメントを培地に加えます。次に、トランスジェニックPSBLシロイヌナズナ細胞培養物を、100ミリリットルのフラスコ内の50ミリリットルのMSMO培地で培養します。次に、フラスコを軌道プラットフォームシェーカーに置き、光の中で130rpm、摂氏20度で細胞を穏やかに攪拌します。
7日ごとに、新鮮な培地で細胞を1〜10溶液で継代培養します。次に、円錐形のフラスコにナイロンメッシュを取り付けたガラス漏斗を使用し、真空ポンプに接続して、対数成長段階で細胞を採取します。次に、乾燥させた細胞をアルミホイルで包み、液体窒素で凍結します。
事前に冷却されたミキサーミルを使用して、20ヘルツの振動周波数に設定します。収穫して凍結した植物細胞材料を微粉末に2分間均質化します。次に、液体窒素を使用して、サンプルごとに3グラムの粉砕粉末を分注し、解凍を防ぐために事前に冷却した装置を使用します。
次に、液体窒素予冷モルタルを使用して、粉砕粉末を3ミリリットルの氷冷溶解バッファーで融解するまで粉砕します。解凍したサンプルをすぐに2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分割します。サンプルを20、817gで摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除きます。
サンプルを遠心分離している間、サンプルあたり100マイクロリットルのIgGセファロースビーズを分注してください。1ミリリットルの溶解バッファーを添加し、ボルテックスによりビーズを再懸濁します。フラッシュスピンを2, 000 gで3秒間回転させ、溶解バッファーを廃棄します。
最後に、ビーズを400マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。遠心分離後、透明な植物溶解物の3ミリリットルを15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに移します。あらかじめ平衡化したビーズを植物溶解物に加え、回転するホイール上で4°Cで1時間インキュベートします。
真空マニホールドの上部にある35マイクロメートルの細孔サイズのフィルターを備えたスピンカラムのルアーロックキャップに接続されたシリンジに混合物を移します。ビーズへの害を避けるために、真空ポンプを穏やかな圧力でオンにして、ライセートをユニットに通します。結合していないライセートは、マニホールドの基部にある廃棄物ステーションに排出され、ビーズに結合したタンパク質複合体はフィルター上に残ります。
シリンジを細胞溶解液から空にしたら、10ミリリットルの洗浄バッファーを加えてビーズを洗浄します。次に、ミリリットルの溶出バッファーを添加して、2回目の洗浄ステップを実行します。次に、シリンジとルアーロックキャップを取り外します。
カラムの底蓋を閉じ、50ユニットのタバコエッチングウイルスであるプロテアーゼを含む溶出緩衝液400μLをビーズに加えます。カラムをテーブルシェーカーに置き、摂氏16度で30分間、1, 000rpmに設定します。次に、さらに50ユニットのプロテアーゼをカラムに加え、前のステップと同様に混合物をシェーカー上でインキュベートします。
次に、ボトムキャップを取り外し、カラムを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに交換します。20, 817 gで1分間遠心分離し、溶出液を収集し、タンパク質および代謝物の抽出を進めます。抽出を開始するには、溶出液に3〜1対1のMTBEメタノール水溶媒1ミリリットルを加えます。
チューブを反転させてサンプルに混合します。次に、0.4ミリリットルの1〜3メタノール水溶液を混合物に加え、チューブを反転させてサンプルを混合します。次に、サンプルを室温で20,817gで2分間遠心分離し、相分離を可能にします。
1ミリリットルの手動リキッドハンドリングピペットを使用して、脂質を含む上相を取り除きます。次に、0.2ミリリットルのメタノールを加え、チューブを反転させてサンプルを混合します。室温で20、817gで2分間遠心分離し、代謝物測定のために新しいチューブに極性相を回収します。
タンパク質ペレットが外れないように、チューブの底に約50マイクロリットルの極性相を残します。次に、極性相を含むチューブを遠心蒸発器で一晩乾燥させます。プロテインペレットのチューブを30〜60分間乾燥させ、過乾燥を避けます。
ワンステップアフィニティー精製を用いて、トランスジェニックシロイヌナズナ細胞培養におけるタンパク質-タンパク質間およびタンパク質-代謝物相互作用が同定されています。NDPK1を発現する細胞培養物は、エンプティベクター、NDPK2、NDPK3サンプルと比較して、バリンロイシン、グルタミン酸イソロイシン、ロイシンイソロイシン、およびイソロイシンフェニルアラニンに有意な濃縮を示します。既知のタンパク質-タンパク質およびタンパク質-代謝物の相互作用を探すために、NDPK1と共溶出する13のタンパク質と4つのジペプチドをステッチデータベースに対してクィアします。
主な関連性は、APX1オルソログとアルデヒドデヒドロゲナーゼファミリー、および翻訳開始因子であるFBR12と翻訳開始因子2サブユニットのアルファホモログとの間に見られます。同定されたジペプチドは、報告されたタンパク質パートナーを示していません。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば4時間で完了します。
この手順を試行する際は、実験全体を通してサンプル、装置、試薬を冷たく保つことが重要です。この手順に続いて、顕微鏡熱泳動や活性アッセイなどの他の方法を実行して、分子間の直接的な相互作用やタンパク質活性に対するそれらのリガンドの推論を決定することができます。このビデオを見れば、全手順でサンプルを取り扱う方法を理解し、信頼できる結果を得て、選択したタンパク質のリガンドを特定できるはずです。
メタノールとMTBE溶液の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。適切な個人用保護具を着用し、この手順を実行するときは、ドラフトの下での作業などの予防措置を常に講じる必要があります。
概要
この記事では、植物細胞培養に最適化されたタンパク質-タンパク質およびタンパク質-代謝物相互作用の並列分析プロトコルを紹介します。この方法は親和性精製と質量分析を組み合わせて、in vivoで相互作用する分子を同定します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 生化学
- 細胞生物学
- 植物科学
背景
- タンパク質相互作用は細胞機能に不可欠です。
- これらの相互作用を理解することで、様々な分野での研究が進展します。
- この方法は異なる生物学的システムに適応可能です。
- 必須タンパク質の新しいリガンドの発見を可能にします。
研究目的
- タンパク質と代謝物相互作用を分析する手法を開発すること。
- 植物細胞の代謝メカニズムの理解を深めること。
- 植物以外の他のシステムにも適用できるプロトコルを提供すること。
使用方法
- MSMO培地の調製と遺伝子導入されたArabidopsis thaliana細胞培養の成長。
- 植物細胞材料の収穫と均質化。
- IgGセファロースビーズを用いた親和性精製。
- タンパク質と代謝物の検出のための質量分析。
主要な結果
- NDPK1発現細胞における重要なタンパク質-代謝物相互作用の同定。
- stitchデータベースを使用した共溶出タンパク質と二ペプチドの発見。
- 特定のタンパク質と代謝化合物の間の顕著な関連。
- この方法は約4時間で完了します。
結論
- このプロトコルにより、タンパク質相互作用の効率的な分析が可能になります。
- 様々な生物学的研究の文脈で利用可能です。
- サンプルの完全性を維持するために、低温条件を保つことが重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables parallel identification of protein-protein and protein-metabolite interactions in near-physiological conditions, supporting target validation and ligand discovery in early discovery workflows. By capturing endogenous complexes without pre-selection bias, it enhances predictive confidence in lead identification and reduces mechanistic ambiguity in drug target assessment. The approach is adaptable across biological systems, offering a scalable tool for de-risking therapeutic hypotheses in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping endogenous protein and metabolite interaction networks.
- Operational Value: Provides functional target validation data under near-native conditions, reducing false positives through empty-vector controls.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying co-eluting metabolites and proteins that inform target engagement and pathway context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares affinity-purified complexes for downstream MS analysis, generating quantitative interaction profiles.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via one-step extraction, improving reproducibility across runs.
- Screening Readiness: Outputs compatible with UPLC-MS/MS enable scalable compound screening against identified ligands.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase interaction data to preclinical validation by identifying disease-relevant metabolites and proteins.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct target modulation or off-target metabolic effects.
- Biomarker Alignment: Detected metabolites (e.g., valine-leucine, isoleucine glutamate) may serve as translational biomarkers when correlated with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, delivering interaction data that informs hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing unbiased protein and metabolite partners of bait proteins in cellular lysates.
- Screening: Generates metabolite and protein readouts that can be used to assess compound interference or stabilization of complexes.
- Analytics: Delivers quantitative UPLC-MS/MS outputs enabling comparison of interaction strength across conditions or genetic backgrounds.
- Translational Research: Links molecular interactions to metabolic pathways, supporting biomarker-driven advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Protocol can be standardized across model systems (e.g., HeLa, E. coli, yeast) for cross-project consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by validating interactions in near-vivo conditions, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: One-step MTBE/methanol/water extraction simplifies workflow, enhancing reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by identifying metabolic liabilities or co-factors that modulate target activity.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on interaction network robustness and ligand diversity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in affinity purification, metabolite extraction, and mass spectrometry-based proteomics and metabolomics.
- Depends on access to UPLC-MS/MS systems and centrifugation equipment capable of 20,817 g.
- Necessitates cross-team standardization of lysis, wash, and elution conditions to ensure reproducibility across laboratories.
- Adaptation to non-plant systems requires validation of lysis buffer compatibility and tag accessibility in mammalian or microbial lysates.
- Practical limitations include metabolite volatility during extraction and potential interference from abundant cellular proteins or lipids.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Preparation of Plant Cell Material
1:55
Tandem Affinity Purification (TAP)
4:59
Metabolite and Protein Extraction
6:15
Results: Simultaneous Characterization of Protein-Protein and Protein-Metabolite Interactions Employing a Single-Step Tandem Affinity Purification Coupled with Mass Spectrometry
7:23
Conclusion
