Name: 早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ介在ニューロン前駆体の採取と移植法を用いた発達神経科学における細胞運命の解析。マウス生後早期脳から前駆体を採取し、同年代の受容体に移植することで環境変化が神経細胞の成熟に与える影響を評価する技術を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、健康の国民の協会 (K99MH104595) および T.J.P. に発育研究所所内研究プログラムに支えられました。 そのラボでこのアプローチは創業 Gord Fishell に感謝いたします。

すべての実験手順、健康の国民の協会のガイドラインに従い行った NICHD 動物ケアおよび使用委員会 (ACUC) によって承認されました。下記プロトコル利用Nkx2.1 CreC/+;+/- Ai9 MGE 派生介在ニューロン前駆体を収穫する子犬しますが、必要な蛍光レポーター マウスの任意の行で実行できます。男性と女性の両方の初期生後マウス (P0 P2) は、ドナーとホストのティッシュを無差別に使用されました。
1. ソリューションの準備
<ol><li>(単位 mm) の次のレシピによるとショ糖人工髄液 (sACSF) の準備: 87 NaCl、26 NaHCO3、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、0.5 CaCl2、7 MgCl2、10 グルコース、95 %o飽和 75 ショ糖2、5% CO2 ph 7.4 を =。</li>
	<li>350 mL 純粋な ddH2O ビーカーはに基づいて最終的な音量の塗りつぶし (sACSF の 500 mL で十分でしょう 1 2 リットル)、電磁攪拌棒を追加し、攪拌プレートにビーカーを置きます。</li>
	<li>一度にすべての塩 (NaCl、NaHCO3KCl、NaH2PO4グルコース、スクロース)、重量、次の表に従って水を追加します。最終的な音量に応じて量を調整できます。<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
				<td>分子の重量</td>
				<td>濃度 (mM)</td>
				<td>グラム/500 mL</td>
			</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
				<td>58.44</td>
				<td>87</td>
				<td>2.54</td>
			</tr>
<tr>
<td>重炭酸ナトリウム</td>
				<td>84.01</td>
				<td>26</td>
				<td>1.09</td>
			</tr>
<tr>
<td>塩化カリウム</td>
				<td>74.55</td>
				<td>2.5</td>
				<td>0.09</td>
			</tr>
<tr>
<td>ナトリウムりん酸一</td>
				<td>119.98</td>
				<td>1.25</td>
				<td>0.08</td>
			</tr>
<tr>
<td>グルコース</td>
				<td>180.16</td>
				<td>10</td>
				<td>0.9</td>
			</tr>
<tr>
<td>ショ糖</td>
				<td>342.3</td>
				<td>75</td>
				<td>12.84</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>バブルの 95% O25% CO2 (carboxygen) CaCl2 (500 mL sACSF の 1 M 溶液から 0.25 mL) の適切な量を追加する前に、少なくとも 20-30 分の MgCl2 (500 mL sACSF の 1 M 溶液から 3.5 mL) とソリューション.</li>
	<li>標準的な pH 計を用いて pH を確認してください。ソリューションの pH が必要場合、正しく準備 = 7.4。</li>
	<li>純粋な ddH2シリンダー卒業 O と 500 mL の最終巻にソリューションをもたらします。</li>
	<li>sACSF ができるまで 1-2 日後に控えを準備します。使用前に氷の場所、解剖の開始前に少なくとも 15 分の carboxygen とバブルし、sACSF の解剖を通してバブルのボトルを維持します。</li>
</ol>2. 解剖準備
<ol><li>次のツールは、/オートクレーブ滅菌する必要があります: 少なくとも 1 つ小さな高級はさみ、2 微細鉗子 (スタイル #5)、曲面微細鉗子、脳 matrice カビやいくつかのかみそりの刃の断面します。頭蓋骨から脳を削除する小さなヘラはオプションです。</li>
	<li>ペトリ皿 (9 cm と 4 cm の直径) と解剖の顕微鏡に近い作業ステーションをセットアップ 50 mL 分離脳領域を収集するために円錐形のプラスチック製の管や大口径パイプ プラスチック転送ピペット、すべて氷で保たれます。氷の上の carboxygenated の sACSF のいくつかの 50 mL チューブを準備します。複数の脳領域を解剖、正しくことを確認、明確にラベル コレクション チューブと汚染を避けるため転送ピペット。</li>
	<li>低体温症を通して子犬の氷麻酔追加の氷のバケツ、死体を処分する適切な有害廃棄物バッグがあります。</li>
	<li>組織および trituration のパスツール ピペット火磨かれたガラスを準備します。殺菌し、ピペットの先端を形作るブンゼン バーナーを使用します。異なる穴の開口部をもついくつかのピペットを準備: 大きい (~ 600 μ m)、媒体 (~ 300 μ m) と小 (~ 100 μ m)。流れる水を使用して異なる製粉速度を確保するためのヒントをテストします。各種類の少なくとも 1 つのピペットは分離脳領域ごとに必要ですが、目詰まりやヒントを壊す場合各サイズの余分ないくつかのことをお勧めします。</li>
</ol>3. 移植準備
<ol><li>電極の引き手を使用して細いガラス マイクロ ピペットを準備します。鋭い角度の点を作るべき先端の面取りが壊れたり直径 20 〜 40 を有する先端で μ m。 は確認のほこりを顕微鏡でヒント視覚検査または残留ガラス粒子絞りを妨害しています。</li>
	<li>細い針の注射器を使用すると、完全に鉱物油とガラス マイクロ ピペットを塗りつぶします。Nanoject 装置 (または他のマイクロインジェクション装置) にマイクロ ピペットを挿入します。Nanoject III の次のプログラムを設定: ボリューム = 60 nL 率 = 30、サイクル 25、遅延を = = 1 s。</li>
	<li>磁気ベースに接続されているマニピュレーターに Nanoject を確保し、x または y に沿って斜めに立ち上がるない、Nanoject がまっすぐに指すように、マニピュレーターを調整する軸。</li>
	<li>いくつかの接着剤パテを添付 (1 ~ 2 P0 P2 子犬の cm) 子犬の頭の上に高架のサーフェスを作成するシャーレのカバーの上部に。</li>
	<li>ラボのカット 6 ~ 8 cm 長いストライプ テープし、真ん中のひし形の穴を作る。テープも皮膚をストレッチし、建造物や対象地域の簡単な可視化をできるようにしながら、中には、子犬の頭を安定させるために使用されます。</li>
	<li>インジェクション駅横にある加熱パッドを準備し、注射を開始する前に '低' 設定をオンにします。パッドをカバーいくつかのペーパー タオルやおむつパッドとのそれ。</li>
	<li>小さなハサミを実行する準備ができてがある複数の移植条件を実行するタグにつま先/尾クリッピング子犬受信異なる注射です。</li>
</ol>4. P0 P2 マウス脳の除去
<ol><li>右の手順を開始する前に、冷やして carboxygenated sACSF といくつかのペトリ皿を入力します。〜 25 mL sACSF で採尿管を埋めます。</li>
	<li>氷の下でいくつかのパラフィルムやグローブも覆われている場所で P0 P2 子犬をラップします。5 分間タイマーを設定し、それを起動します。その後、子犬を削除し、後足のピンチには応答しないことを確認してください。</li>
	<li>子犬の首をはねるし、シャーレ sACSF でいっぱいの頭を収集します。頭蓋骨を公開する正中線に沿って皮膚をカットします。</li>
	<li>頭蓋骨の脳/脊髄でのオープニングを検索し、頭蓋骨部背側に沿って鉗子の一方の端を挿入します。優しく正中線で頭蓋骨を持ち、'' 脳を傷つけないように注意しながら、脳を公開するために横方向に離れた部分に皮をむきます。</li>
	<li>頭蓋骨の背と側面部分を除去した時に任意の領域を傷つけないようにしようとして、脳の腹側表面の下にすくって頭蓋骨から脳を取り除きます、鉗子やヘラを使用します。場所別のシャーレに脳 carboxygenated sACSF でいっぱい。 
	  注: 皮質、線条体、海馬を解剖するための 2 つの戦略を提案します。(手順 5.1 5.10) の最初の戦略は、2 番目の方法 (手順 6.1 6.7) 蛍光レポーター マウス線条体を淡蒼球と他の脳構造から明確に分離する必要があります、マウスの任意の行に便利です。線条体が必要でない場合 2 つの手法の線条体固有の部分を無視します。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig1.jpg"> 図 1: 回路図と、テクニックは #1 の脳解剖の画像 5.1 5.10 の手順で説明されている手法。線条体組織が必要な場合は、上脳行列腹側で P1 脳を置きます。かみそりの刃を前方脳線条体を通してコロナ セクションを取得するを介して matrice スロットに配置します。両半球から線条体部分を削除、海馬の前方にある線条体を含むすべてのセクションを繰り返します。線条体組織する必要がない場合単に hemisect、脳半球の内側を皿に置き、海馬を公開する腹内側脳構造 (視床、大脳基底核等) を削除します。ピンセットを使用して、海馬のピンチ、半球を裏返しし、皮質組織の固まりを解剖するピンセットを使用します。カットは線条体のセクションを削除するだろうスケマティック半球を通して黒い垂直線。スケール バー = 500 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
5. 収穫の線条体, 海馬, 皮質、テクニック 1
<ol><li>Matrice 金型、腹側を断面に脳全体を配置します。(前方の嗅索) を介して脳の最も前方部分を介して 1 のかみそりの刃を置きます。</li>
	<li>0.5 mm スライスを生成する最初の 1 つにちょうど後部別のかみそりの刃を挿入し、追加のかみそりの刃をこの 1 つの後方に配置します。</li>
	<li>これらのスライスを carboxygenated sACSF とシャーレに転送し、sACSF と別皿に脳の残りの部分を配置します。線条体スライスを切り裂くスコープ線条体を視覚化するために転送します。これらのスライスは前方の線条体の大部分を含み、海馬を欠いている必要があります。Nkx2.1 Cre+/-; とスコープ解剖蛍光灯を使用します。Ai9淡蒼球の強力な tdTomato 信号から信号の弱い線条体 tdTomato を区別するために+/-スライス。</li>
	<li>蛍光の有無にかかわらず、sACSF と正しくラベル付けされた 50 mL チューブにすべてのセクションおよび転送線条体の塊の両方の半球から線条体出てピンチ、氷の上を格納します。</li>
	<li>Hemisect 鉗子またはかみそりの刃を使用して正中線に沿って脳と内側面を上向きになるように半球を倒します。</li>
	<li>この組織を鉗子でつまんで腹側脳 (視床、大脳基底核など) を削除します。完了すると、(背側皮質に沿って前後軸にまたがるソーセージ状構造) 海馬と皮質の心室側を明確に表示する必要があります。</li>
	<li>海馬を削除するには、前の海馬の前で鉗子の先端を挿入し、鉗子を後方移動と海馬-皮質のボーダーに沿う摘心によって皮質から海馬を優しきます。SACSF に正しくラベル付けされた 50 mL チューブに孤立した海馬を転送、氷の上を格納します。</li>
	<li>大脳皮質を解剖するには、hemisected 皮質内側を置きなさい。最も背を挟まないように鉗子を使用、内側体性感覚皮質、〜 2 mm x 2 mm. の正方形塊のまま野の腹側、前部と後部の部分皮質をフリップは、内側が起動し、すべての余分な非皮質組織 (視床のきれいなので、大脳基底核など。)内側の表面は必要に応じて。SACSF に正しくラベル付けされた 50 mL チューブに皮質チャンクを転送、氷の上を格納します。</li>
	<li>なったと皮質の両方を収集する他の半球を繰り返す地域。</li>
	<li>すべての子犬で、シャーレを保つため、sACSF 冷たくて新鮮な子犬の間に sACSF を交換することを確かめるためには、この手順を繰り返します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig2.jpg"> 図 2: 回路図とテクニック 2、脳解剖の画像 6.1 6.7 の手順で説明されている手法。脳解剖皿の背側にピンで留めます。大脳皮質を剥離した後フォワード、海馬、線条体、表示され、以前の手法で説明されているように皮質のセクションを削除ことができますし、削除することができます。トランスジェニック マウス ラインによって線条体は淡蒼球や他の組織を削除するクリーンアップすることができます。Nkx2.1Cre; でAi9マウス ライン、淡蒼球、トマト + 細胞は線条体と比較して有意に高い密度。スケール バー = 500 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
6. 収穫線条体, 海馬, 皮質、テクニック 2
<ol><li>SACSF を含む sylgard コーティング ペトリ皿で脳の腹側を置くし、小脳や前皮質あるいは嗅球を介してそれをピンで止めます。</li>
	<li>1 つの半球にはじまって、基になる海馬から後部皮質や他の組織を優しくカーブタイプ鉗子を使用します。優しくフラット シャーレに皮をむいた皮質を横たわっていた。他の半球に繰り返します。なったと線条体は、露出した脳にはっきり目に見えるにする必要があります。</li>
	<li>正中線で 1 つの海馬をピンチし、横方向を削除する海馬の皮に鉗子を使用します。コレクション バイアル氷の上に配置し、他の海馬とを繰り返します。</li>
	<li>線条体、周囲の組織からそれを緩和する線条体の端をこすり優しく。それから下につまんで線条体を削除し、コレクション チューブ氷の上に追加します。他の線条体に繰り返します。</li>
	<li>皮質のセクションは、5.8 の手順で説明するように収穫できます。</li>
	<li>遺伝子改変レポーター マウスの線を使用している場合 (例えば、 Nkx2.1-Cre;Ai9、 Lhx6 GFP等)、sACSF とシャーレに線条体を転送およびスコープ解剖蛍光表示。鉗子を使用して ( ; Nkx2.1 Cre の線条体から線条体以外の任意の組織を削除するにはAi9マウス、すべての '明るい' 組織を削除は、淡蒼球ははるかに高い MGE 由来 tdTomato + セル密度線条体と比較して)。すべて線条体に繰り返します。</li>
	<li>すべての子犬で、シャーレを保つため、sACSF 冷たくて新鮮な子犬の間に sACSF を交換することを確かめるためには、この手順を繰り返します。</li>
</ol>7. 1 つのセルの状態を生成します。
<ol><li>解体が完了したら後、は、1 mg/mL に、10 mg プロナーゼを計量し、10 mL の carboxygenated sACSF で溶解プロナーゼ ソリューションを準備します。</li>
	<li>転送 5 mL を 50 mL コレクション バイアルから組織はラウンド プロナーゼ sACSF 溶液 2 mL を含む下部チューブです。組織サンプルをミックスするインキュベーション中に 3-4 回指でチューブを揺れ/フリック、室温で 20 分間、インキュベートします。</li>
	<li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol><ol><li><li><li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig3large.jpg" target="_blank"></a><ol start="4"><li><li><li><li><li><li><li><li></ol>

<ol><li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+cortical+interneuron+precursors+is+prescient+of+their+mature+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).</li>
<li>Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+and+temporal+origin+of+chandelier+cells+in+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex.</a> Science. 339 (6115), 70-74 (2013).</li>
<li>Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneuron+specification%3A+the+juncture+of+genes%2C+time+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルの 1 つの重要な側面は、細胞の生存を最大にします。組織や細胞が確実常に氷冷 carboxygenated sACSF では、細胞の生存を促進するために必要です。効率的な解離と解離細胞脳環境の内外で様々 なソリューションを過ごす時間の長さを最小限に抑える戦略が必要です。脳解剖され、移植の数、に応じて実験の長さを減少する郭清および/または移植の手順で支援パートナーに有益なことです。健康と子犬の生存を保証するには、また氷麻酔時間 (< 4 分) を最小限に抑え、移植手順中に光で加熱した子犬を保つ重要なとしてます。
移植された脳では有意な変動があること、他の脳が何千人も含まれている間いくつかない接木のセルを含めることができます。移植細胞密度を高めるかどちらの可能性が高まるが、接ぎ木の子犬の数を増やすことができます細胞移植、収穫数を増やすことができます解剖のためのいくつかの P0 P2 リットルを組み合わせること成功した移植。適切な脳の領域をターゲットに、子犬の頭が安定し、脳の中にマイクロ ピペットを下げるときに移動しないことが重要です。頭のシフトやマイクロ ピペット シャフ...

適切な皮質機能は、興奮性の投射ニューロンと介在ニューロン gaba 作動性抑制性、明瞭な形態、電気生理学的特性、接続性と非常に異質人口のバランスを必要とする神経マーカー。異常な開発および介在ニューロン (および特定の介在サブグループ) の機能は、統合失調症、自閉症、てんかん1,2,3などの精神疾患の病態にリンクされています。さらに、これらの脳障害に関与する多くの遺伝子を若い介在4で濃縮され強く。したがって、通常の開発と多くの脳疾患の潜在的な病因を理解する介在ニューロンの運命決定と成熟を調節するメカニズムの理解が必要です。
2 一時的な萌芽期の構造、内側と仙骨神経節隆起から主に前脳のニューロンが生まれて (MGE と CGE、それぞれ)。これらの後の細胞 (介在ニューロン前駆体) さまざまな回路に組み込まれ、終脳全体で分散する長引く接線方向の移動相を受けます。MGE 派生介在ニューロンから成る 3 主重複、神経に定義されたサブグループ: 高速パルブアルブミン (PV+) 介在ニューロン、高速ソマトスタチン (SST+) 介在ニューロンのスパイクをスパイクと後期神経スパイク硝酸neurogliaform とアイビーの海馬の細胞を構成する酸化物合成酵素 (nNOS+) の介在。多数の研究所が太陽光発電+または SST + 介在ニューロン、モルフォゲン、介在ニューロン前駆体の生年月日および神経因性部モードの空間勾配を含む初期の運命の決定を調整する、MGE 内のいくつかのメカニズムを識別しました。5,6,7,8,9,10. 介在ニューロンが当初 '基本クラス' に区別して徐々 に成熟して '決定的なクラス'11彼らの環境と対話することが提案されています。最近の証拠いくつかの成熟した介在のサブタイプことを示して遺伝子ハードワイ ヤードこれらの細胞は、神経節隆起の後になると初期定義された固有の遺伝的プログラムが以前よりも大きな役割を果たすことを示す感謝12,13。ただし、固有の遺伝的プログラムは、異なる介在サブタイプにドライブ分化する環境手がかりと対話する方法の重要な問題は大部分は未踏。
数多くの研究が様々 な成熟した細胞を移植し、一般的にローカルの内因性回路14,15を抑制する GABA をリリース コンセンサス結果による脳領域に直接 MGE の萌芽期細胞を移植します。 16,17,18,19。ひと誘導多能性幹細胞 (こと) を使用して大きな関心を生成している観測を約束これらの様々 な脳の病気を治療するために介在を派生します。ただし、これらの研究のいくつかの非常には、これらの移植細胞成熟成熟したニューロンの型にかを評価するときに、1 つの重要なコンポーネントは、トランスレーショナル アプローチについて考えています。
環境がどのように介在ニューロン分化と成熟に影響を与えるに対処するため接木介在ニューロンは、ホストの機能を採用するかどうかを調べるために新しい脳環境に未熟な介在ニューロン前駆体を移植して戦略を考案環境またはドナー環境20から機能を保持します。MGE の移植は、MGE は介在および多数の脳領域21全体分散 gaba 作動性投射細胞の混合された人口を含んでいるのでこの質問に対処するため適していません。これらの MGE の細胞は移行が知らなくても、1 つない完全に評価できますこれらの移植、脳環境によってどのように影響を受けるのか。移行を完了し、自分の目標に達している未熟な細胞を取得して初期産後縦長で介在ニューロン前駆体を収穫してこの問題を回避の頭脳領域しますが、最小限の操作環境で。大脳皮質の異なる領域間発現ニューロンの特定の機能に焦点を当て、その後、ホスト環境が介在プロパティを変更する方法を決定できます。このプロトコルで説明する一般的なアプローチは、任意の捜査に適用されるべき新しい環境で挑戦したときを動作することをどのように若いニューロンを検討したいです。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td></td><td>Σ S6297</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td></td><td>Σ S0751</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ΣC5080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Σ</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>脳マトリックス</td><td>ロボズ</td><td>SA-2165</td><td>線条体を収穫する場合のみ必要</td></tr><tr><td>ファインポイント デュモン鉗子</td><td>ロボズ</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>手動マニピュレーター スタンド付き</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 丸底プラスチックチューブ</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm シャー</td>レ <td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm シャー</td>レ <td>ThermoFisher</td><td></td> 12565100 <td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50umフィルター</td><td>シスメックス</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の homochronic 移植

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

神経細胞の運命決定と成熟には、遺伝的プログラムや環境の信号間の複雑な相互作用が必要です。しかし、この分化過程を規制する外因性のメカニズムと組み込みのロールを disentangling はすべて発達にかの難問です。この問題は、gaba 作動性介在ニューロン、一時的な萌芽期の構造から生まれた、終脳全体を分散させるため長引く渡り鳥先行き非常に異種細胞集団の拡大です。どのように別の脳環境影響介在ニューロン運命と成熟を探索するには、新生児マウス (P0 P2) で特定の脳領域からの蛍光に分類された未熟な介在ニューロン前駆体を収穫するためのプロトコルを開発しました。この歳で、介在ニューロンの移行がほぼ完了してこれらの細胞は比較的小さなシナプス統合の最終的な休息環境に居住しています。フローサイトメトリーによって単一のセル、ソリューションのコレクション、次のこれらの介在ニューロン前駆体は P0 P2 野生型産後子犬に移植しました。両方つながれたを実行することによって (例えば、皮質-皮質) または異所性 (例えば、野-海馬) 移植、1 つの缶が彼らの運命, 成熟, および回路の集積の影響新しい脳環境で未熟な介在に挑戦を評価。脳が成体マウスの収穫できアッセイはさまざまな移植細胞の免疫組織化学的, を含む posthoc 分析、電気生理学的および転写プロファイリングします。この一般的なアプローチは、どのように異なる脳環境を分析するための戦略を持つ研究者がニューロンの開発の多くの側面に影響を与えるし、特定の神経細胞の特性、主にハードワイ ヤード遺伝プログラムによって駆動されている場合を識別または環境の手がかり。

このプロトコルが初期生後脳 (図 1-2) から特定の脳領域を収穫、介在ニューロン前駆細胞の単一細胞状態を収集し、素朴な WT の様々 な脳領域にこれらの細胞を移植する方法を示します出生後の子犬 (図 3)。Posthoc 解析、細胞の形態、神経化学的マーカーおよび電気生理学的特性を特徴付ける P30 35 間介在ニューロン前駆体移植を受けた脳に収穫され。これらのタイプの試金は通常マウスで、P21 P30 の間しばしば行わが、移植細胞の成熟は郭清/分離手続により若干遅れる可能性があります、追加の 5-10 日を待ってお勧めこれを補うために遅延の成熟。実行する解析のタイプは、脳を収穫する適切な戦略を左右します。特に、我々 は、または特定のサブタイプ20に対してバイアスが特定の介在のサブグループの優遇細胞死を観察しなかった。
<p class="jove_content...

新しい脳領域の若いニューロンに挑戦と、神経細胞の運命と成熟の環境の sculpts に重要な洞察を明らかにできます。このプロトコルを記述する特定の脳領域からの介在ニューロン前駆体を収穫し、それらのいずれかの homotopically を移植する手順や出生後の子犬の脳にあり。

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

この手順の全体的な目標は、出生後のマウスの子犬の異なる脳領域から介在ニューロン前駆体を採取し、これらの細胞を年齢が一致したレシピエントに移植して、環境変化が介在ニューロンの運命と成熟にどのように影響するかを評価することです。この方法は、固有の遺伝的プログラムと環境信号がどのように相互作用して神経細胞の運命を形作るかという、発達神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、介在ニューロン前駆体の運命と成熟の変化を、新しい脳環境への養子縁組移行後に分析できることです。細胞の採取と移植のステップを視覚的に示すことは、技術の小さなエラーが非効率的で失敗した移植実験につながる可能性があるため、非常に重要です。まず、1枚のカミソリの刃を出生後1日目の子犬の脳の前頭葉に通し、追加のカミソリの刃を最初のカミソリの刃のすぐ後ろのスロットに配置して、2つの0.5ミリメートルのスライスを生成します。線条体スライスを泡立ったショ糖人工脳脊髄液またはsACSFを入れたシャーレに移し、残りの脳組織を氷上のsACSFを入れたシャーレに入れます。スライスを解剖顕微鏡の下に置き、鉗子を使用して両方の半球から線条体をつまみ、線条体チャンクを氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに入れます。脳が蛍光レポーターマウスから採取された場合は、蛍光顕微鏡を使用して、線条体のtd-トマトシグナルと淡蒼球のより強い蛍光シグナルを区別します。海馬を切除するには、鉗子を使用して正中線に沿って脳を半角化し、片方の半球を解剖顕微鏡の内側表面の下に置きます。鉗子を使用して腹側脳組織を切除し、皮質の背側と心室側に沿って前後のアクセスにまたがるソーセージ型の海馬を特定します。鉗子の先端を前海馬の手前に挿入し、海馬の皮質境界に沿ってつまみながら鉗子を後方に進めることで、海馬を皮質から優しく分離します。分離された組織を氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに入れ、対側半球の海馬採取を繰り返します。次に、半角分離した皮質の内側を下にして置き、鉗子を使用して皮質の最も背側、腹側、前部、および後部を取り除きます。内側皮質の残りの正方形を氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに移します。脳を切除した後、脳の腹側を下にして、小脳と前皮質または嗅球を通します。湾曲した鉗子を使用して、後皮質を下にある海馬および各半球の他の組織から穏やかに分離します。そして、背側皮質を前方に剥がして、下にある構造を露出させます。鉗子を使用して、正中線で海馬を一方の半球でつまみ、海馬を脳から横方向に剥がして海馬を取り除きます。氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに海馬を入れ、同じ方法で反対側の海馬を採取します。次に、線条体の端をそっとこすり、周囲の組織から線条体をほぐします。線条体の下をそっとつまんで、線条体

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Weber, R. Z., et al.マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植とin vivo生物ルミネセンス追跡J. Vis. 経験。(2022年)このビデオは、遺伝子組み換えヒト神経前駆細胞(NPC)のマウス脳への定位固定移植を示しています。研究者らは、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質を発現するNPCを注入し、神経学研究における細胞の生存、遊走、統合を研究するためのin...

マウス脳へのヒト神経前駆細胞の移植

このビデオでは、マウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆体を生成する方法を紹介しています。このプロトコルでは、幹細胞の増殖と胚様体(EB)への凝集を促進する特定の低分子阻害剤を含む培地で幹細胞を培養します。その後、EBは酵素と解離し、接着タンパク質でコーティングされた培養プレートウェルに播種して、皮質介在ニューロン前駆体への分化を促進します。...

マウス胚性幹細胞からの皮質介在ニューロン前駆体の生成

出典: Quattrocolo, G., et al.出生後早期マウス脳への介在ニューロン前駆体のホモクロニック移植J. Vis.

マウスの子犬の脳への介在ニューロン前駆細胞の移植

出典: Gonzalez-Ramos, A., et. al., 神経発達障害を軽減するための出生後早期マウス海馬へのヒト幹細胞由来 GABA 作動性ニューロンの移植。J. Vis.

マウスの子犬海馬へのヒト由来介在ニューロン前駆細胞の移植

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。...

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

神経前駆体のインビトロレンチウイルス工学、野生型脳への共同移植、および「テスト」および「コントロール」誘導体の対対モルモメトリック評価に基づいて、この方法は、新生児の生体内遺伝子制御における正確なモデリングを可能にするシンプルで手頃な方法でニューロン形態。...

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

ここでは、初期産後マウスの皮質に移植された皮質間ニューロン前駆体の活性を操作するために化学遺伝学的ツールを使用するように設計されたプロトコルを提示する。...

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

ニューロンプログラミングによって生成されたヒト多能性幹細胞由来のGABA作動性ニューロンの移植は、神経発達障害の潜在的な治療アプローチとなる可能性があります。このプロトコルは、ヒト幹細胞由来のGABA作動性ニューロン前駆体の生成と新生児マウスの脳への移植を記述しており、移植されたニューロンの長期的な調査とその治療可能性の評価を可能にします。...

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

学ぶ介在ニューロン前駆体の採取と移植法を用いた発達神経科学における細胞運命の解析。マウス生後早期脳から前駆体を採取し、同年代の受容体に移植することで環境変化が神経細胞の成熟に与える影響を評価する技術を解説します。

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

さらに動画を探す