早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

この手順の全体的な目標は、出生後のマウスの子犬の異なる脳領域から介在ニューロン前駆体を採取し、これらの細胞を年齢が一致したレシピエントに移植して、環境変化が介在ニューロンの運命と成熟にどのように影響するかを評価することです。この方法は、固有の遺伝的プログラムと環境信号がどのように相互作用して神経細胞の運命を形作るかという、発達神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、介在ニューロン前駆体の運命と成熟の変化を、新しい脳環境への養子縁組移行後に分析できることです。

細胞の採取と移植のステップを視覚的に示すことは、技術の小さなエラーが非効率的で失敗した移植実験につながる可能性があるため、非常に重要です。まず、1枚のカミソリの刃を出生後1日目の子犬の脳の前頭葉に通し、追加のカミソリの刃を最初のカミソリの刃のすぐ後ろのスロットに配置して、2つの0.5ミリメートルのスライスを生成します。線条体スライスを泡立ったショ糖人工脳脊髄液またはsACSFを入れたシャーレに移し、残りの脳組織を氷上のsACSFを入れたシャーレに入れます。

スライスを解剖顕微鏡の下に置き、鉗子を使用して両方の半球から線条体をつまみ、線条体チャンクを氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに入れます。脳が蛍光レポーターマウスから採取された場合は、蛍光顕微鏡を使用して、線条体のtd-トマトシグナルと淡蒼球のより強い蛍光シグナルを区別します。海馬を切除するには、鉗子を使用して正中線に沿って脳を半角化し、片方の半球を解剖顕微鏡の内側表面の下に置きます。

鉗子を使用して腹側脳組織を切除し、皮質の背側と心室側に沿って前後のアクセスにまたがるソーセージ型の海馬を特定します。鉗子の先端を前海馬の手前に挿入し、海馬の皮質境界に沿ってつまみながら鉗子を後方に進めることで、海馬を皮質から優しく分離します。分離された組織を氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに入れ、対側半球の海馬採取を繰り返します。

次に、半角分離した皮質の内側を下にして置き、鉗子を使用して皮質の最も背側、腹側、前部、および後部を取り除きます。内側皮質の残りの正方形を氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに移します。脳を切除した後、脳の腹側を下にして、小脳と前皮質または嗅球を通します。

湾曲した鉗子を使用して、後皮質を下にある海馬および各半球の他の組織から穏やかに分離します。そして、背側皮質を前方に剥がして、下にある構造を露出させます。鉗子を使用して、正中線で海馬を一方の半球でつまみ、海馬を脳から横方向に剥がして海馬を取り除きます。

氷上の50ミリリットルのsACSFチューブに海馬を入れ、同じ方法で反対側の海馬を採取します。次に、線条体の端をそっとこすり、周囲の組織から線条体をほぐします。線条体の下をそっとつまんで、線条体組織を採取します。

前に示したように、両方の半球から皮質を採取した後、線条体を蛍光解剖スコープ下に移します。鉗子を使用して、各線条体から真っ赤なtd-トマト陽性の淡蒼球組織を取り除きます。すべての組織を採取したら、組織を5mmの丸底チューブに移し、各収集チューブのsACSFを2ミリリットルの新たに調製したプロナーゼ-sACSF溶液と交換して、室温で20分間インキュベーションします。

インキュベーションの終わりに、プロナーゼ-sACSFを1〜2ミリリットルの再構成溶液と慎重に交換し、組織をファイヤーポリッシュしたパスツールパイプで機械的に解離させます。組織が曇り、組織の塊が見えない場合は、50ミクロンのフィルターで細胞溶液を濾し、新しい5ミリリットルの丸底チューブに細胞溶液を濾し、蛍光活性化細胞ソーティングの前に細胞塊を取り除きます。フローサイトメトリーから細胞を受け取った後、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。

遠心分離後、各チューブから最後の20マイクロリットルの上清を除くすべてを吸引し、ペレットを再構成してカウントします。必要に応じて、細胞溶液をsACSFで1マイクロリットルの濃度あたり10〜5番目の細胞の1〜3倍に希釈します。先端の細いマイクロピペットに鉱物油を入れます。

マイクロピペットをナノリットルインジェクターに取り付け、ナノリットル注入装置を磁気ベースに取り付けられたマニピュレーターに固定します。最初の子犬が氷上で麻酔されている間に、細胞溶液を数回ピペットで動かして、均一な細胞分布を確保します。鉱油を排出し、ピペットに単細胞懸濁液を完全に充填します。

つま先をつまんでも反応がないことを確認したら、子犬をシャーレカバーの上に置き、頭を粘着性のパテに乗せて、頭のてっぺんが比較的平らになるようにします。ひし形の穴が開いたラボテープで頭を覆い、皮膚が伸びるまで教えられたテープを引っ張って、頭がしっかりと固定され、ラムダが穴を通して見えるようにします。固定した子犬をナノリットルインジェクターの下に移動し、マイクロピペットを下げて、先端がラムダの真上にくるようにします。

マニピュレーターのX座標、Y座標を観察し、マイクロピペットが頭部の内側、外側、および前後の軸に沿った適切な座標に配置されるまで、マニピュレーターノブを調整します。先端が皮膚に小さなくぼみを作るまでマイクロピペットを下げ、z軸マニピュレーターノブをしっかりと、しかし穏やかに回して、マイクロピペットを皮膚と頭蓋骨を脳に通します。マイクロピペットを少し引っ込めて、先端がテントのような形をした皮膚の円錐形に囲まれるまで待ちます。

そして、z軸に沿って座標を表示します。次に、マイクロピペットを適切な実験深度まで下げ、細胞を注入します。細胞が送達されてから15秒待ってからマイクロピペットを引っ込め、必要に応じて2番目の場所で注入を繰り返します。

子犬をヒーティングパッドに置き、完全に回復するまで監視してから、ホームケージに戻します。移植された細胞は、数十から数千の範囲で変動する細胞生存率で、標的となる脳領域全体に移動します。移植された細胞は、多くの細胞が介在ニューロンの形態と十分に特徴付けられた介在ニューロン神経化学的マーカーを示す適切な領域内に局在します。

ドナー細胞は、ヘテロトピア移植によって新しい環境に移植されても生存し、成熟します。移植された細胞の電気生理学的分析により、明確に定義された介在ニューロンのサブタイプを代表する成体のような生理学的特性と明確な発火パターンが明らかになり、移植された介在ニューロンが宿主環境で適切に成熟できることが示唆されています。移植された細胞は、自発的な興奮性シナプス後電流も示します。

チャネルロドプシン-2を発現する移植された介在ニューロンに隣接する錐体細胞からの記録は、これらの内因性錐体細胞の青色光によって誘発されるシナプス後GABA作動性電流を明らかにします。この手順を試みるときは、細胞を氷上に保ち、パスツールピペットで細胞を穏やかに回転させて細胞死を最小限に抑えることが重要です。この手順に続いて、移植された細胞に対してシングルセルシーケンシングなどの他の方法を実行して、環境変化が細胞のトランスクリプトームにどのように影響するかをより完全に定義できます。

このビデオを見た後、新生児の子犬のさまざまな脳領域から介在ニューロン前駆体を分離し、これらの細胞を年齢が一致した出生後の子犬のさまざまな脳領域に移植できるはずです。