Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

この手順の全体的な目標は、生物学的サンプルの代謝活性を分析し、嫌気性経路がサンプル内の細胞エネルギー生産にどの程度寄与しているかを判断することです。この方法は、医薬品開発におけるミトコンドリア毒性の程度に関する製薬分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的の細胞サンプルの酸素消費量と熱生成の同時測定を容易にすることです。

したがって、この方法は、医薬品開発中の治療計画に関する洞察を提供します。また、凍結保存に対する代謝プレコンディショニングの影響を評価できるcyrobiologyなどの他の分野にも適用できます。呼吸計を準備するには、まず各呼吸計チャンバーに2点2ミリリットルのDMEMを追加し、ストッパーを完全に挿入します。

ストッパースペーサーツールでストッパーを調整して、媒体への酸素拡散を最適化し、酸素濃度と酸素フラックスが安定するまで、750rpm、37°Cでサンプルを連続的に攪拌するようにチャンバーを設定します。呼吸計ソフトウェアが、実験で使用した培地の酸素溶解度を考慮するようにプログラムされていることを確認します。次に、酸素濃度トレースの安定した部分を選択し、この部分を100%の空気飽和度に校正します。

次に、チャンバー内に気泡が存在しないように注意しながら、ストッパーを閉じます。約10分後、安定した酸素流束が観察されるはずです。熱量測定の準備をするには、まず2点5ミリリットルの脱イオン水を基準アンプルに加え、次にキャップを締めます。

エアポンプを使用して、アンプルから外部の破片を取り除き、アンプルをゆっくりと下げて、熱量計の基準チャネルにアンプルを配置します。アンプルは、細胞サンプルを含むアンプルが調製されるまで、位置1に留まります。熱量測定に使用されるDMEMは、加湿雰囲気と5%CO2の摂氏37度のインキュベーターで平衡化する必要があります。

実験を開始するには、使用する熱量計アンプルごとに100ミリリットルのプレートに3ミリリットルのDMEMを加え、サンプルが熱量測定の準備ができるまでプレートをインキュベーターに置きます。培地が平衡化している間に、倒立顕微鏡を使用して、60〜80%のコンフルエントで均一に分布しているHepG2細胞を含むプレートを選択します。まず、細胞培養培地を取り出し、10ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。

3ミリリットルの予熱したトリプシンを摂氏37度で加え、プレートを摂氏37度でインキュベートします。7〜10分間のインキュベーション後、3ミリリットルの摂氏37度DMEMで酵素反応を中和し、5ミリリットルのピペットを使用して細胞を穏やかに解離して単一細胞懸濁液にします。細胞を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離し、パレットを約5ミリリットルの新鮮なDMEMに再懸濁します。

細胞を徹底的にピペットで動かして細胞クラスターを分解し、カウントした後、細胞を培地50マイクロリットルあたり約200万個の細胞に濃縮します。この分析法の再現性は、一貫性と精度のある細胞数に依存します。サンプルが均質であり、分析中のどの時点でも細胞が凝集していないことを確認することが重要です。

次に、呼吸測定および熱量測定を行う準備ができるまで、細胞を氷上に保存します。熱量測定の前に、熱量計がコンピューターに接続されていること、および熱量測定信号が安定しており、マイクロワットであることを確認してください。サンプル調製前にインキュベーターに入れた平衡培地で細胞を1ミリリットルあたり100, 000細胞に希釈します。

次に、各アンプルに2.5ミリリットルの細胞溶液を加え、アンプルの蓋と培地との間にガス拡散を可能にするのに十分な量の空気が維持されていることを確認します。すぐにキャップを締め、密封されたアンプルを空気で洗浄して、外部の破片を取り除きます。次に、細胞サンプルと一緒に密封されたアンプルをゆっくりと下げて、熱量計の1つを配置します。

サンプルを十分に混合して均質な溶液を確保し、連続攪拌下で呼吸器計の各密閉チャンバーに200万個の細胞を注入します。熱量計の1番の位置で15分後、基準アンプルと細胞のあるアンプルの両方をゆっくりと下げて位置2にし、下げた時間を記録します。細胞を呼吸計に注入してから10〜15分後には、酸素フラックスの安定化と酸素濃度の着実な減少が観察されます。

リーク呼吸を決定するには、各チャンバーに1マイクロリットルあたり4ミリグラムのオリゴマイシンを注入し、酸素フラックスが約10分間安定するまで待って、先ほど示したように安定したリーク呼吸数を記録します。次に、最大フラックスを決定するために、2マイクロリットルのゼロポイント2ミリモルFCCPをチャンバーに注入し、各注入後に酸素フラックスが安定するようにし、最大フラックスに達するまで滴定を続けます。最大フラックス中の安定した呼吸数を記録します。

サンプル測定前にレスプロメーターチャンバーが作動している場合、酸素濃度と酸素フラックストレースの両方が安定している必要があります。アンプルを位置2まで下げた後、熱出力が安定している時間を特定し、酸素フラックスが安定している対応する時間を特定して、熱量スピロメトリック比を計算できます。HepG2細胞をグルコース非存在下で培養し、ガラクトースを補充してミトコンドリアの関与を増加させると、細胞は熱量計内で増殖せず、アンプル内で約30分後に代謝活性が低下するため、熱量測定の計算は熱放散が測定された最も早い時点に制限されます。

酸素フラックスが安定し、酸素濃度が着実に低下するまでに約15分かかるため、熱産生と酸素消費量の測定値が同じ時点で収集されるように、細胞がアンプルにピペットで移された時間を記録することが重要です。細胞の安定化された酸素フラックスは、熱量スピロメトリック比を計算する際の酸素消費量の代用として機能するため、追加の滴定を実行してリーク呼吸を評価することができます。これは、酸素フラックスの低下と最大非結合呼吸によって示され、連続したFCCP滴定で呼吸が増加しないことによって示されます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間未満で完了できます。

この手順を試みる際には、他の細胞株が異なる代謝特性を持っている可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、新しい各細胞株は、熱量測定と呼吸測定の両方に対して最適化する必要があります。このビデオを見れば、HepG2細胞の熱量測定用試料作製方法、正しい機器キャリブレーション、および熱量測定実験の適切な実施方法について十分に理解できるはずです。