Name: 低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学ぼう、JC-1蛍光色素を用いたフローサイトメトリーで低酸素・再酸素化後のヒト心筋細胞のミトコンドリア膜電位を測定する方法。細胞傷害に対する保護薬剤の効果評価にも応用可能です。

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この研究は、国立キー研究と開発中国プログラム (第 2017YFC1700503) からの補助金によって支えられた国家の基本的な研究プログラム (973 プログラム) 中国 (No.2012CB518602)、中国の国家自然科学基金 (号 81370223号 81573957)、北京連合医学の大学 (2016-1002-01-02) の院生の革新的な研究財団。

1. 試薬および解決の準備
<ol><li>ひと心筋細胞 (HCMs) 完全培地を準備するには、製造元の指示に従って細胞成長培地 500 mL に細胞成長培地補足ミックスの 25 mL を追加します。4 ° C で使用する前に 37 ° C に暖かい店。</li>
	<li>Tongxinluo (TXL) ソリューションを準備 TXL 無血清/グルコースの超微粉体を溶解することによりダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) と DMEM (詳細についてを参照してください11) を追加して TXL の 400 μ G/ml の濃度を調整します。4 ° C で使用する前に 37 ° C に暖かい店。</li>
	<li>暗闇の中で 15 mL 遠心管中のバッファー (5 x) を染色株式の 1 mL、4 mL の超純水水原液 (200 x) JC 1 25 μ L を追加することで JC 1 作業溶液 5 mL を準備します。数回上下混合物をピペット、37 ° C 使用する前に暖かい。</li>
	<li>24 mL の超純水水を 50 mL 遠心管中のバッファー (5 x) を染色株式 6 mL に追加することによって染色バッファーの作業の 30 mL を準備します。このソリューションの氷を使用します。</li>
</ol>2. 低酸素/再酸素化モデルの確立
<ol><li>6 ウェル プレートでホーチミン完全培地でよくごと板 1.0 x 10 の5セル。37 ° C で 5% CO2と 95% 空気の入ったセルのインキュベーターで約 70% の confluency に到達する成長します。</li>
	<li>リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) で HCMs を洗ってください。さまざまな治療法を公開 (400 μ G/ml TXL か)/グルコース無血清 DMEM 37 ° C で 5% CO2と 95% 空気の入ったセルのインキュベーターで低酸素の前に 30 分の 2 mL に</li>
	<li>遊離酸素を清掃し 18 時間 (図 1 a)、低酸素症と嫌気性中11,12,の酸素分圧を測定する指標を誘導する、気密・低酸素瓶 (2.5 L) 触媒装備 HCMs を孵化させなさい13、37 ° C で 5% CO2と 95% 空気の入ったセルのインキュベーターで 注: それは瓶の中の遊離酸素を清掃する触媒の約 1.5 時間かかります。したがって、jar ファイルを開く前に、HCMs は 19.5 h の jar ファイルに保存されます。平地環境で水色から低酸素状態 (図 1 b) で白と淡いに嫌気性のインジケーターの色が変わります。</li>
	<li>HCMs を 37 ° c 2 h 5% CO2と 95% 空気を含む設定インキュベーターに 6 ウェル プレートを移動することによって reoxygenate します。</li>
</ol>3 フローサイトメトリー用 HCMs の準備
<ol><li>37 ° C に 0.25% トリプシン エチレンジアミン四 edta 溶液と PBS を温める</li>
	<li>各ウェルから培地を吸引、1 ml の PBS のセルを洗浄し、井戸の壁に沿って 0.25% トリプシンの 0.5 mL を追加します。</li>
	<li>すべて HCMs がほとんど戸建 (約 1 分) までは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>トリプシンを中和するために井戸に DMEM 完全培地 (10% 牛胎児血清を DMEM 培地) の 1 つの mL を追加します。15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送して、室温で 3 分間 500 × g で遠心分離によって HCMs をペレットします。</li>
	<li>慎重にペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。</li>
	<li>各管に 0.5 mL ホーチミン完全培地の JC 1 作業溶液 0.5 mL を加えます。上下にピペッティングによる、HCMs 再懸濁します。</li>
	<li>蛍光指示薬の漂白を防止するアルミ箔で全体の管をカバーし、分間インキュベート HCMs (5% CO2と 95% の空気を含む 37 ° C) で通常の状態で 20。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 500 × g で遠心分離によってペレット HCMs</li>
	<li>2 mL の冷たい JC 1 染色バッファーで 2 回 HCMs を洗い流してください。</li>
	<li>HCMs を 300 μ L のサンプル チューブ (12 mm × 75 mm) の冷たい染色バッファーの最終巻で再懸濁し、セルを使用して、30 分以内で分析。 注: は、肯定的な制御のための 20 μ M の濃度で 1 時間 HCMs を処理するカルボニル シアン m-クロロフェニル ヒドラゾン (CCCP)、呼吸の電子伝達系の強力な阻害剤を使います。</li>
</ol>4. 流れの Cytometer セットアップ
<ol><li>流れの cytometer を起動し、ソフトウェアがそれに接続されていることを確認します。</li>
	<li>流体工学のスタートアップを実行、ストリームを開始し、打ち切りを設定します。</li>
	<li>流れの cytometry ソフトウェアで 2 つのドット プロット ウィンドウを開きます。<ol>
<li>選択転送それぞれのサイズとその粒度の面で細胞の特徴を表す最初のドット プロットの Y 軸上の X 軸 (FSC) 光と側方散乱光 (SSC) に散在。</li>
		<li>JC 1 色素細胞内の蛍光強度を測定するために使用 2 番目のドット プロットに対数目盛を使用して X 軸 Y 軸の FITC (530 ± 30 nm) では、PE (575 ± 26 nm) 検出のチャネルを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 フローサイトメトリー測定とデータ解析を流れ
<ol><li>チューブを arm をサポートし、空白(HCMs 染色されていない JC 1) 位置へのアンロードをクリックして管のサンプルします。ロードチューブ サポート アームを作業位置に戻りますをクリックします。</li>
	<li>空白のサンプル チューブの懸濁液から粒子を収集し、さらに最初のドット プロット (図 3) の分析細胞集団 (P1) をゲートのレコードをクリックします。</li>
	<li>他のサンプル チューブに HCMs を収集し、セルのドットが 2 番目のドット プロットの中心部にあることを確認への蛍光チャネルの電圧を調整することにより測定を最適化します。</li>
	<li>各サンプル チューブの統計情報を表示し、緑の蛍光強度の赤蛍光強度の比で割って各サンプルの Mmp を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).</li>
<li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JC-1%2C+but+not+DiOC6%283%29+or+rhodamine+123%2C+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells%3A+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li>
<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
<li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation%2C+Size+Fractionation%2C+and+Real-time+MOMP+Measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、JC 1 染料を使用して JC 1 アッセイによって H/r. 検出にさらされた後細胞の MMP を評価するプロトコルを提案する、セルの MMP はミトコンドリアのサイズ、形状、および単一成分蛍光に影響を及ぼすかもしれない密度などの要因から独立して14をを信号します。したがって、JC 1 アッセイの結果は比較的信頼性の高いです。その上、それは、便利で JC 1 分析を実行する時間を節約。この試金は材料と試薬の低要件、一般的に、MMP 測定する細胞の剥離から、染色を行う未満 1.5 h です。
研究者が信頼でき、満足のいく結果を取得する場合、JC 1 アッセイを実行するとき、いくつかの重要なステップを誇張することはできません。まず、流れの cytometer で収集しているまでは、JC 1 が読み込まれたセルを冷たい染色バッファーに格納する必要があります。温度 MMP の安定性にかなりの効果があり部屋の温度で短時間後多く 1 つのサンプルの値を変化させます。さらに、予備実験をお勧めします pretreating 時間と、CCC...

冠動脈心疾患は、死の世界の主要な原因です。治療の選択肢の虚血性損傷を減らすことと st 患者の梗塞サイズを制限する心筋梗塞を高架は via 初回経皮的冠動脈インターベンション (PCI)1、タイムリーかつ効果的な心筋再灌流 2。ただし、再灌流は、最終梗塞サイズ3の 30% までを占めることができます追加の損傷を引き起こします。それは普遍的にミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) がだけ虚血/再灌流時のミトコンドリアの損傷および細胞死の中心ではないことを認めたが (私/R)、心保護4信号の収束先ではまた,5. mPTP 開口部は内部のミトコンドリア膜電位 (MMP)4の脱分極もたらす、我々 検出 5, 5 ', を用いた mPTP 開口 1 '6'-テトラクロロ-m--1、6、3、3 '-エチル-imidacarbocyanineiodide (JC 1) 試金。
JC 1 アッセイは、定性と定量は、cytofluorimetric メソッドと単一ミトコンドリア6のレベルで MMP を分析することによってさらに検証されています。オレンジ色発光 (590 ± 17.5 nm) マトリックスで通常 MMP; とミトコンドリアの赤を産する集計形式として存在する JC 1MMP の損失と JC 1 は 530 ± 15 nm の発光と蛍光グリーンを生成する単量体のフォームに変換されます。したがって、赤/緑の蛍光強度比の減少は、虚血/再灌流などの条件で MMP の削減可能性 (私/R)。
JC-1 に加え MMP もローダミン 123 と 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine ヨウ化 [DiOC6(3)] など脂溶性陽イオン膜透過性と研究されています。しかし、これらの 2 つのプローブと比較して、JC 1 MMP の分析信頼性の高いものです。ローダミン 123 (特にモード7、8を焼入) で比較的貧しい感度と貧しい人々 の特異性があります。ローダミン 123 のシフトは時々 観察検出する研究者または機器のハードが非常に小さいです。以外にも、単一のセルにローダミン 123 の異なるミトコンドリア結合部位がある、だからそれは、異なる蛍光排出量9を必要があります。DiOC6(3) は MMP を検出するためお勧めできませんのいずれかとして、それは血しょう膜10の脱分極に敏感に反応します。
したがって、ここで我々 は保護剤の有無を低酸素/再酸素化にさらされた後 HCMs MMP を評価するために JC 1 アッセイを使用します。

<table><tbody><tr><td>ミトコンドリア膜電位アッセイキット、JC-1</td><td>Beyodtime、中国</td><td>C2006</td><td>キットには、JC-1ストック溶液(200倍)、ストック染色バッファー(5倍)、CCCP(10mM)</td></tr><tr><td>Tongxinluo超微粉末</td><td>石家荘Yiling Pharmaceutical Co.、中国</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI KIT</td><td>Becton-Dickinson、米国</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Human cardiac myocyte</td><td>Promocell, Germany</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Growth Medium (SupplementMix)</td><td>Promocell, Germany</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)</td><td>Promocell, Germany</td><td>C-22070</td><td>used with Myocyte Growth Medium SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute;リュー、マーシーl'のエトワール、フランス</td><td>96127</td><td>2.5L</td></tr><tr><td>触媒(アナロパック)</td><td>三菱ガスケミカル&nbsp;株式会社会社&nbsp;, 日本</td><td>&nbsp;C-1</td><td></td></tr><tr><td>嫌気性インジケーター</td><td>BioM&eacute;リュー、マーシーl'のエトワール、フランス</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>ベクトン・ディキンソン、アメリカ</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva ソフトウェア</td><td>ベクトン・ディキンソン、アメリカ</td><td></td><td>バージョン8.0.1</td></tr><tr><td>サンプルチューブ</td><td>コーニングサイエンス、アメリカ</td><td>352054</td><td>12*75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ハイクロン、アメリカ</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

閉塞した冠動脈のタイムリーかつ効率的な再灌流は、ST セグメント患者における心筋梗塞サイズを減らすための最善の戦略は、心筋梗塞を高架です。ただし、さらに心筋細胞死、再灌流障害として知られている現象で発生することができます再灌流自体。ミトコンドリア膜電位の低下 (MMP)、またはミトコンドリア脱分極とミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) の開口部は再灌流障害の最後のステップとして、広く認められてを担当ミトコンドリアと心筋細胞死。JC 1 は MMP の値によってミトコンドリアに蓄積される脂溶性カチオン染料です。MMP が高いより JC 1 はミトコンドリアに蓄積されます。緑からの蛍光発光シフトによるミトコンドリアの JC 1 の増加量を反映できる (~ 530 nm) 赤 (~ 590 nm)。したがって、赤/緑の蛍光強度比の低減は、ミトコンドリアの脱分極を示すことができます。ここでは、我々 は MMP を測定する JC 1 の利点やフローサイトメトリーによる検出に再酸素化低酸素後のヒトの心筋細胞における mPTP の開口部を取る。

MMP の変化を評価する JC 1 アッセイを実行する前に、実験実施研究者によって設定条件を正常に確認するを強くお勧めします。低酸素/再酸素化 (H ・ R) が大幅 HCMs (アネキシン V +/PI±) のアポトーシスを誘導した流れ cytometry 結果 (図 2)、正常群と比較して示すように、私のセル ベースのモデルを確立した我々 を示す/R (45.00 ± 2.13% 対。11.50 正常群、 p ± 0.18% &lt; 0.05)。Tongxinluo、心保護効果を持つ中国の伝統医学を防ぐ HCMs H/R の状態でのアポトーシス ( p , H/R 群 45.00 ± 2.13% 対 24.50 ± 1.13% &lt; 0.05)。
CCCP は電子輸送鎖の電子キャリアの正常な活動の間に確立されたプロトンの勾配 (MMP の損失) の...

ここでは、JC 1 染料を使用して保護エージェントの有無を低酸素/再酸素化にさらされた後細胞のミトコンドリア膜電位を評価するプロトコルを提案する.

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

この方法は、ミトコンドリア膜電位の細胞に対する低酸素/再酸素化の影響を測定するのに役立ち、薬剤が損傷から保護するかどうかを評価するために使用できます。このアッセイの主な利点は、それによって検出されるMMPがミトコンドリアサイズなどの要因の場合であることです。さらに、材料と輝きに対する要件が低くなっています。6ウェルプレートに70%コンフルエントなヒト心筋細胞から始めます。リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した後、2ミリリットルの血清およびグルコースフリーDMEMに薬物またはビヒクルを追加します。5%CO2と95%の空気を含む細胞培養インキュベーターで、摂氏37度で30分間インキュベートします。30分後、ヒト心筋細胞の皿を2.5リットルの気密性低酸素瓶に入れます。遊離酸素を除去する触媒と、媒体中の酸素張力を測定するためのアネロビックインジケーターを装備しています。ジャーを組織培養インキュベーターに入れます。アエロビックインジケーターの色は、正常酸素環境では水色から低酸素状態では淡い白に変わります。ヒトの心筋細胞を再酸素化するには、6ウェルプレートを瓶から取り出し、インキュベーターの棚に2時間置きます。再酸素化に続いて、1ミリリットルの予熱したPBSで細胞をすすぎ、0.5ミリリットルの予熱した25%トリプシンをウェルの壁に沿って加えます。すべてのヒト心筋細胞がほぼ剥離するまで、摂氏37度で約1分間インキュベートします。次に、トリプシンを中和するために、1ミリリットルのDMEM完全培地をウェルに加えます。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、室温でGの500倍で3分間遠心分離することによりHCMをペレット化します。遠心分離後、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。次に、5ミリリットルのヒト心臓筋細胞完全培地と5ミリリットルのJC-1ワーキング溶液を各チューブに加えます。HCMをピペッティングで上下させて再懸濁します。蛍光インジケーターの漂白を防ぐためにチューブをアルミホイルで覆い、細胞を通常の状態で20分間インキュベートします。摂氏4度に予冷した遠心分離機でGの500倍で3分間遠心分離することにより、ヒト心筋細胞をペレット化した後、2ミリリットルの氷冷JC-1染色緩衝液で細胞を2回すすぎます。2回目のすすぎ後、ヒト心筋細胞を300マイクロリットルの氷冷染色緩衝液に再懸濁します。そして、サンプルをそれぞれのサンプルチューブにろ過します。フローサイトメトリーで30分以内に細胞を解析します。フローサイトメーターを起動し、ソフトウェアが接続されていることを確認します。流体スタートアップを実行します。ストリームを開始し、ブレークオフを設定します。フローサイトメトリーソフトウェアで2つのドットプロットウィンドウを開きます。最初のドット プロットで、X 軸で前方散

a-flow-cytometry-based-assay-for-measuring-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

呼吸計測の酸化的リン酸化の解析と組み合わせてサポニン透過処理繊維の調製物は、ミトコンドリアの機能の統合的な評価を提供します。生理的および病的状態におけるミトコンドリア呼吸はミトコンドリアの相互作用、形態および生化学を含む様​​々な規制の影響を反映することができます。...

サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

このビデオでは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体、ミトコンドリアDNA関連タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質に対する抗体でニューロン細胞を標識し、その後、フローサイトメトリーでそれらのレベルを定量化する方法を示します。...

フローサイトメトリーを用いたニューロンにおける複数のミトコンドリアパラメータの測定

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。...

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル...

細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析

ゼノバイオティック流出ポンプは造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)において非常に活性であり、ミトコンドリア膜電位蛍光色素であるTMRMの押し出しを引き起こす。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルの存在下でTMRMによるHSPCにおけるミトコンドリア膜電位を正確に測定するプロトコルを提示する。...

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。...

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

心筋保護に対する低体温の異なる程度の明確な影響は十分に評価されていない。本研究の目的は、ヒト心筋細胞系モデルにおける異なる低体温症治療に続く細胞死のレベルを定量化し、将来の詳細な分子研究の基礎を築くことであった。...

ヒト心臓筋細胞モデルにおける低体温症前処理に対する心筋保護のインビトロ評価

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

学ぼう、JC-1蛍光色素を用いたフローサイトメトリーで低酸素・再酸素化後のヒト心筋細胞のミトコンドリア膜電位を測定する方法。細胞傷害に対する保護薬剤の効果評価にも応用可能です。

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフローフローサイトメトリーを用いたアッセイ

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低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

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低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフローフローサイトメトリーを用いたアッセイ