Name: 最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ最小限の脊髄損傷マウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化評価法。Neurosphereアッセイを用いて損傷後の神経前駆細胞の挙動と再生医療への応用可能性を定量的に解析する技術です。

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この作品は Krembil 財団 (営業許可 CMM) によって資金を供給します。WX はカールトン マルグリット スミス学生賞の受信者です。NL は、オンタリオ州大学院奨学金を受け取った。

「ガイド ケアと使用の実験動物」に従い、トロント大学で動物ケア委員会によって承認されたこのプロトコル (2ndエディション動物の世話、カナダ評議会 2017).
1. 最小限の脊髄傷害手術
注: 手術前にすべての手術器具と材料が (図 1 a) 適切な方法で滅菌されていることを確認してください。
<ol><li>4-5 正方形のガーゼを重ね、ガーゼの固定ロールを取得する途中でそれらを一緒にテーピングして呼吸器サポート アーチを構築します。</li>
	<li>誘導チャンバーにマウスを置きし、5% イソフルレンで麻酔を開始します。プロシージャ全体だけでなく、前に、つま先ピンチ反射の有無を確認します。手術は、完了に 30 分以上かかることが、として最小限のイソフルラン暴露 (5% で 5 分) や 2-3% で残り時間を最適化します。</li>
	<li>2-3% イソフルラン維持投与量で麻酔器に接続されている鼻の円錐形にマウスを転送します。バリカンを使用して、手術のため皮膚の広い長方形領域を公開する首/耳まで半ば後ろから動物の背から毛皮を削除します。</li>
	<li>脳定位固定装置に添付のノーズコーンにその鼻を置き、イヤバーと頭蓋骨を安定させるマウスを転送します。マウスの脳定位固定装置で保護されて一度耳バーと 2-3% に戻って下の配置中にイソフルラン 5% を維持します。</li>
	<li>術前鎮痛薬を腹腔内管理 — メロキシカム (2.0 mg/kg)。気前よく潤滑目麻酔と角膜の乾燥を防ぐためにオープン マウスの目に。</li>
	<li>尾のベースを軽く引いてマウス体内と背骨を矯正しながらマウスの腹部の下に胸部サポート アーチを配置します。尾および星のような位置にすべての拡張の手足を保護するのにテープにラベル付け室を使用します。セキュリティで保護された、一度押して上部胸郭に向かってマウスの腹部からの呼吸器サポート アーチ吻方、-胸椎 (図 1 b) を支えるために。</li>
	<li>70% エタノール、ポビドン ヨードに続いて手順 1.3 の準備毛皮クリップ皮膚領域を消毒して滅菌手術野を準備します。2 回繰り返します。広い滅菌フィールドを維持する滅菌手術用ドレープを適用します。</li>
	<li>#10 メス刃を使用して、縦切開は、胸椎の曲率を両方の肩甲骨の中間点から動物の長手方向の軸線に平行ください。軟部組織と脊柱輪郭線 (図 1) を公開するために皮膚を撤回します。</li>
	<li>(これは T4/5 椎体レベルを設定) 甲の脂肪パッドの下の境界を識別します。同じ #10 刃で慎重に、力、列から裏筋腱をデタッチする椎体骨 T5-T8/9 の両側に沿ってカットします。</li>
	<li>背骨の両側に切開サイトにリトラクターの歯を挿入します。露出を調整するには、十分に収縮の筋層 (図 1) にあまり負担をかけることがなく背骨を昇格するリトラクターを拡大します。</li>
	<li>手術顕微鏡下で注意深く洗浄残留筋肉や他の軟部組織 (図 1E) の椎体の骨を公開する脊椎を覆います。脊椎が上下の歯の鉗子で椎骨の棘突起を握りしめると、わずかに移動することによって削除されますを識別します。 注: これは椎間関節を識別できるようにする必要があります、興味の脊椎骨の下に小さな開口部 (椎間孔) を公開します。</li>
	<li>露出椎間孔を摘出する椎弓板に尾の両側に鈍化デカールバサミの 1 つのヘッドを挿入して、二国間接続椎間関節を切りなさい。</li>
	<li>板を上方に持ち上げるし、分離し、骨を取り除くラミナの上部アタッチメントを断ちます。 注: これは、脊髄 (図 1 f) を含む無傷の硬膜嚢が公開されます。過剰な可能性があります影響を受ける領域の上に 1 cm × 1 cm のガーゼをプレカットや滅菌 PBS で洗浄出血を配置することによって制御できます。</li>
	<li>ランドマークとして背側正中静脈、正中線の両側に約 0.5 mm 外側で脊髄 (約 1 mm 深い) の背側表面に (針ベベルが上向き) で 30 G の針の先端の 45 ° 曲がったシャフトを挿入します。</li>
	<li>針 〜 2 mm の尾側から吻側 (正中線に平行) に移動、針の傾斜面の全体の長さがコードに挿入されます。エントリ (図 1) のパスを介してが針を抜きます。 注: 必要があります出血、脊髄組織の腫脹は、この段階で見られるかもしれない。</li>
	<li>傷を閉じるため、リトラクターを削除し、6-0 吸収性縫合糸を用いた正中線で一緒に傷害のいずれかの側に背中の筋肉を縫合します。その後穿刺部位の皮膚を閉じます 4-0 滅菌絹縫合糸を使用します。</li>
	<li>綿棒の先端を用いた術後感染症を防ぐために表面的な縫合皮膚の上部に抗生物質軟膏を適用されます。0.1 mg/kg 皮下流体 (リンゲル液の 1 mL) と共にブプレノルフィンの術後鎮痛を管理します。</li>
	<li>イソフルラン気化器と酸素をオフにします。脳定位固定装置とない寝具で清潔なケージの場所から、マウスを削除します。</li>
	<li>次の覚醒麻酔とモニターの動作から回復のための熱ランプから約 30 cm のケージにマウスを配置します。マウスは 5-10 分でウェイク アップさせる、可能な麻痺や覚醒時に尻尾の弱点と後肢の機能を持つ必要があります。</li>
	<li>次の数日間マウスの動作を監視し、適切な術後ケアと鎮痛剤 (リンゲル液ソリューション液皮下、0.1 mg/kg ブプレノルフィン 2すなわちマッシュ、一日 2-3 日間で、適切な重量の監視のために皮下に毎日 x) 回復としてに従ってローカル動物施設規制し、個別に異なる場合があります。</li>
</ol>2. Neurosphere アッセイ郭清
注: 全体で適切な無菌培養手順に従います。
<ol><li>酵素液調製法
	<ol>
<li>アルブミン オボムコイド阻害剤含有ガラス瓶と優しく渦溶解するまでに 32 mL のアールのバランスの取れた塩ソリューション (EBSS) を追加します。</li>
		<li>プリポーション パパインのバイアルに EBSS 5 mL を追加し、溶解する 37 ° C の水浴中に置きます。ソリューションになる (ソリューション 1) をオフにします。</li>
		<li>EBSS の 500 μ L を取るし、濃度が 1 mg/mL (ソリューション 2) のバイアル ガラス プリポーション DNase を追加します。前後のバイアルを傾けることによってとてもやさしく混ぜるし、ソリューション 1 にこの混合物を 250 μ L を追加します。 注: 作られたすべてのソリューション (ソリューション 1 と 2) は、組織の 2 つの部分の処理のために十分です。組織のより多くの部分を処理している場合は、詳細のソリューションの準備と対応します。</li>
	</ol></li>
	<li>ティッシュの準備と郭清
	<ol>
<li>場所研究室ワイプはマウス ケージにイソフルランに浸し、完全にマウスを麻酔する蒸気の 2 〜 3 分を許可します。次のノックアウト マウスをケージから取り外し、つま先ピンチ反射の有無を確認します。</li>
		<li>(すなわち、金属ケージのカード) に動物を安楽死させる金属鈍器で頚部転位を実行します。スプレー 70% エタノールをたっぷりと半ばにその首から euthanized 動物。</li>
		<li>頭蓋底で頭を切断し、破棄バイオの袋にはさみを使用します。正中切開は、皮膚筋や椎体骨の輪郭線 (図 2 a) を公開する背中の全体の長さに沿って。</li>
		<li>各肩甲骨の内側面を持ち上げる (すなわち。、肩甲骨-脂肪質のパッドを覆うによって識別される) (肩甲骨・椎体間の軟部組織をカットするはさみを使用。基になる脊柱を公開する完全に独立した.</li>
		<li>以下の脊柱の湾曲、上胸部開口部にはさみのペアを挿入し、リブ、筋肉、臓器 (図 2 b) を切り取ることで、脊柱を分離します。</li>
		<li>尾椎孔・開口部にはさみを挿入し、ラミナ (背側表面) の両側に椎間関節をカットします。そのままケーブルを損傷しないように注意します。続きを所望のレベルおよび/またはコードの長さまで、このプロセスが公開されます。</li>
		<li>通常人工髄液をシャーレに脊髄組織を転送する前にコードから横方向に伸びる spinal nerve(s) を慎重にカットします。(図 2) の氷のサンプルを保ちます。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で ~ 2 mm 吻側と尾側に損傷部位を含むように脊髄組織を切断します。そっと背側と腹側の亀裂に沿って縦 2 等分にコードを分離する鉗子の 2 つのペアを使用して (図 2')。</li>
		<li>刀、負傷した背白質をカットします。15 mL の円錐管に作品を配置します。</li>
		<li>1 つを保持鉗子、ダウン脊髄の半分はいじめるし、白質の脊髄の rostrocaudal 範囲に沿って必要な脳室周囲領域を分離する微細鉗子の別のペアを使用してを削除します。脊髄の他の半分に繰り返します。</li>
		<li>別の 15 mL の円錐管に脳室周囲組織の作品を配置します。刀を使用し、軽く円錐管の壁にティッシュをミンチします。 注: 組織解離変更、パパイン解離システム プロトコル23前述の組織準備手順24です。</li>
		<li>組織サンプルに新ソリューション 1 (ステップ 2.1.3) の 2.5 mL を追加し、30 分の 37 ° C でロッカーに配置。</li>
		<li>そっとカップ刻んだ 1,000 μ L ピペット チップ ソリューションで組織。300 x g 5 分間室温で曇り細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>アールの平衡塩類溶液, オボムコイド阻害剤ソリューション (ステップ 2.1.1) の 300 μ L 2.7 ml ソリューション 3 を準備と DNase の 150 μ L 私ソリューション (ステップ 2.1.3)。</li>
		<li>ステップ (ステップ 2.2.13) から上澄みを廃棄し、前の手順 (手順 2.2.14) からソリューション 3 の 1.5 mL で再懸濁します。</li>
		<li>レイヤーの ovoimucoid 阻害剤溶液 (ステップ 2.1.1) 不連続密度勾配を作成する新しい 15 mL の円錐管に 5 mL の上にこの新しいセル中断 (ステップ 2.2.15)。300 × gで遠心するルートで 5 分間</li>
		<li>上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 2 mL で再懸濁します。300 × gで遠心する室温 3 分</li>
		<li>上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 1 つの mL で再懸濁します。5 mL の容量のためのメディアの 4 mL に続いて 20 μ m の細胞ストレーナーを使用して懸濁液をフィルター処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>めっき
	<ol>
<li>表皮の成長因子 (20 ng/mL) と neurobasal メディアを補完 neurosphere 成長培地を準備/線維芽細胞増殖因子 (20 ng/mL)/ヘパリン (2 μ g/mL) [の決定的な NSCs] または [プリミティブ NSCs] の leukemina 抑制的な要因 (10 ng/mL)。25 mL の培養フラスコにいずれかのメディアの 10 mL を追加します。</li>
		<li>検定とトリパン ブルー色素を使用して25(ステップ 2.2.18) から懸濁液中の細胞数を計算します。計算された、(ステップ 2.3.1) で作製した培養フラスコにセルを追加 24 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) のためのインキュベーターに追加されたセル 10 細胞/μ L と場所組織培養フラスコの栄養密度。 注: カウント手法の例のとおりです: 10 μ L トリパン ブルー色素の細胞懸濁液とミックスの取る 10 μ L。診断にこの混合物の 10 μ L を追加します。光学顕微鏡 X 10、[生きているセルの数をカウントし、内 4 x 4 象限の 4 カウントのすべてのセルを合計します。数式を使用して: 2 x 10 x 1,000 x 100,000/[(X cells/4)] クローン密度 (10 細胞/μ L) を確保するため各 25 mL の培養フラスコにめっきされる細胞を懸濁液の量を与える。</li>
		<li>24 h 後優しくフラスコを旋回し、15 mL の円錐管に内容を注ぐ。300 × gで遠心するルートで 5 分間</li>
		<li>上澄みを廃棄し、新鮮な neurobasal メディアの 1-2 mL のセルを再度中断します。</li>
		<li>2.3.2 補われるそれぞれのマイトジェン メディア (決定的な NSC 成長 EFH) と原始的な NSC 成長の LIF の 500 μ を含む 24 ウェル培養プレートのクローンの密度で懸濁液とプレートのセルのセルの数をカウントする手順を繰り返します。 注: 2 x 10 x 1,000 x 適応式 (5,000/[セル/4 X) を使用して) よく 500 μ L のメディアを含む各メッキに細胞懸濁液の体積を計算します。</li>
		<li>7 日間 (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) 成長するインキュベーター内のセルを含んでいる版を配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>カウント
	<ol>
<li>次の 7 日間培養プレートを削除し、光学顕微鏡で見る。球状のコロニーをカウントすることによって神経幹細胞を定量化する > dNSCs 文化の直径約 80 μ m と > 50 μ m 径 pNSCs 文化。 注: 必要な場合、神経幹細胞は継代26さらにすることができます。 または差別化します。セルが必要なくなった場合は、培地の色が黄色に変わり、20 分間 (約 1 mL) の井戸に加速の過酸化水素を追加することによって処分します。破棄します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatWalk-assisted+gait+analysis+in+the+assessment+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).</li>
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手術中に、研究者が最適な結果を取得し、動物間のばらつきを最小限に抑えるのために特に注意を払う必要がありますいくつかの重要なステップがあります。注意が必要 (イソフルラン) 吸入麻酔と手術中に麻酔が長時間27神経保護効果が示されていると。したがって、損傷脊髄の再生能力を学習の際の努力として迅速かつ効率的に交絡変数を防ぐために可能な限り手術を行うこと。マウスあたり同じイソフルラン暴露時間を維持すると、変動が少なくなります。マウスの呼吸率は手術中で監視し、遅くはならない (より小さい 1 息すべて 2-3 s) または重く苦しい (すなわち、あえぎ)。麻酔の維持の線量は低い投与を受けたマウスのノートと長時間の麻酔による死亡を防ぐために 2-3% から下げることができます。
脊柱の両側に筋肉の切開の際、手術中に余分な注意してください。カットが深く、刃のエッジは、筋肉切開中骨の椎体に対して平らになるように刃は内側に曲がることを確認します。刃が外側に傾いて、血管から余分な出血の可能性があります。研究者は、深い釣りはさみ、脊髄を損...

中枢神経系には、すべて異なる成熟した神経細胞の種類1,2,3,4に上昇を与える能力を持っている自己更新多能性幹細胞の集団が含まれています。これらの神経の幹細胞 (NSCs) は、脳や脊髄の専門にされたニッチに存在し、増殖、移行、および成熟神経細胞に分化する損傷アクティブすることができます。NSCs と彼らの子孫は、大脳皮質損傷モデル5,6傷害のサイトに移行する示されています。脳の側脳室から、グリア瘢痕形成7に貢献しているアストロ サイトに分化し、損傷部位に移行する NSCs を示されています。脊髄、ただし、いくつかの研究の脊髄損傷回復を促進するためこれらの同じ内因性 NSCs に利用できるかどうかを求めるに行われています。確かに、現在、脊髄における幹細胞のプールの活性化が中心管8を並べる脳室周囲ニッチの直接の物理的損傷を必要かどうかまたは脊髄へのダメージ コード (茎を残して実質のかどうかに議論は細胞ニッチそのまま) で内因性 NSCs9を有効にするに十分です。
脊髄損傷 (SCI) モデルの数は、急性および慢性の傷害の病態生理を研究に使用されています。これらのモデルは、神経保護、抗炎症、および開発細胞移植/交換戦略10、11,13SCI を治療するために潜在的な療法をテストする使用されています。現在のモデルには、コード14,15で大規模な機能障害と同様に広範な病変とキャビテーションが発生する圧縮および/または挫傷の傷害が含まれます。結果グリア瘢痕脊髄16の幅/円周の大半と共にいくつかの脊髄セグメントをまたがることができます。したがって、これらのモデルは臨床的に関連性の高い、彼らは損傷内因性 NSCs の応答を勉強する重要な課題を与えます。中央運河17を割くことができる傷害の穏やかな形態をさせるために適応することができます損傷の化学モデルがあります。しかし、これらのタイプの損傷の SCI に関連付けられている脱髄に焦点を当てるし、外傷性理に関連付けられている物理的および/または機械的損傷の臨床的に関連するモデルではないです。
現在の損傷モデルの制限に対処するため、我々 は針トラック最小限 SCI モデル、もともと、ラット9、成体マウス モデルのアプリケーションのために開発を適応しています。適応傷害モデルはマウスの脊髄の背外側領域の一貫した病変を作成でき、予備の損傷のレベルで中心街にある運河。このモデルの利点は、NSC の速度論の研究を許可する損傷部位への損傷とその潜在的な放射状の移住、次します。マウス モデルの使用は、内因性 NSCs と傷害に続く彼らの子孫の系譜追跡を許可するトランスジェニック マウスの使用もできます。NSCs のプロパティは、このプロトコルで導入された体外neurosphere アッセイの変更フォームを使用してさらに評価できます。
Neurosphere アッセイは、生体外でコロニー形成試金マイトジェン存在 NSCs の隔離を可能にします。クローン メッキ密度個々 NSCs は NSCs の小さな個体の前駆細胞18,19の大半で構成される細胞の浮遊球コロニーを生じさせるのに増殖します。我々 のプロトコルで脊髄の脳室周囲の地域から 2 つの異なる、後月関連 NSCs の分離を示す — 基準条件と私たちの最小限の SCI のモデル。決定的な神経幹細胞 (dNSCs) 特急ネスチンとグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) と上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF) やヘパリン (EFH と呼ばれる一緒に)20存在下で栽培されています。これらの dNSCs は生体外で非常に少ない神経幹細胞に上昇を与える素朴な脊髄にまれです。ただし、次の脳室周囲地域21由来神経幹細胞の数を拡大して、最小限の SCI dNSCs をアクティブ化を示します。原始的な神経幹細胞 (pNSCs) は、神経幹細胞系列の dNSCs の上流。pNSCs 多能性マーカー Oct4、という極めてまれな、特急の低水準で、白血病の抑制的な要因 (LiF) 応答22。pNSCs は、成体マウス脊髄初代培養; ミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の存在のためにから分離したときの神経幹細胞を形成しません。pNSC 神経幹細胞は、MBP 欠損マウスから分離することができ、その数は拡大続く傷害-dNSCs21に似ています。最後に、我々 は dNSC 由来の神経幹細胞を早く次の最小限の大回で損傷部位から分離することができます表示これらの結果は示して私たち損傷モデルと試金が増殖して損傷に応答を移行する能力などの脳室周囲 NSCs の活性化特性を評価できます。

<table><tbody><tr><td>Agricola Retractor</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>17005-04</td><td></td></tr>モ<tr><td>リアVannas-Wolffスプリングはさみ(湾曲)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15370-50</td><td>鈍い先端を得るために注文時にカスタマイズ</td></tr>グレー<tr><td>フ鉗子(ストレート、1 x 2歯)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイングレーフ鉗子(湾曲、鋸歯状)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11152-10</td><td>または</td></tr>、<tr><td>Hartman Hemostats(ストレート)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td>を<td>縫合するための他の</td></tr>鉗子、または<tr><td>メスハンドル#3</td>、<td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td>、<td>またはその他の適切な</td></tr><tr><td>バリカン amazon.ca</td><td></td><td>https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>またはその他の適切な</td></tr><tr><td>定位固定剤楽器</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>またはその他の適切な</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>または任意の適切な制裁を受けた私の動物ケア施設</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>または動物ケア施設Tears NaturalePMによって認可された任意の適切な</td></tr>。<tr><td></td><td>アルコン</td><td>、https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>、またはその他の適切な</td></tr><tr><td>イソフルラン</td>、<td>バクスターインターナショナル、インク</td><td>、DIN 02225875</td><td>、またはその他の麻酔に適した</td></tr>Q<tr><td>チップ、コトム、スワブ</td><td>、amazon.ca</td><td></td><td></td>https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</tr><tr><td>コットン ガーゼ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>30 G 針</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>305106</td><td>怪我用</td></tr><tr><td>25 G 針</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>305122</td><td>薬物注射用</td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>3090659</td><td>薬の注射用</td></tr> 3 <tr><td>mL シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>309657</td><td>液体注射用</td></tr><tr><td>4-0 縫合</td><td>糸 uoftmedstore.com</td><td>2297-VS881</td><td>皮膚縫合用</td></tr><tr><td>6-0 縫合</td><td>uoftmedstore.com</td><td>VS889</td><td>筋肉縫合</td></tr>用 <tr><td>ポリスポリン軟膏</td><td>amazon.ca</td><td>102051</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>15mL円錐管</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>適切な</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr> 適切な<tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>任意の</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>任意の適切な</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>適切な</td></tr><tr><td>標準 解剖ツール</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ 2000</td><td></td></tr><tr><td>計数顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎-A 中</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L- グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30%</td><td>Glucose</td><td>Sigma G6152</td><td>1 M、9.01 g in 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM、1.30 g in 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td></td><td>ΣH3375</td><td>23.83 g 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>R&Dシステムズ</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>プトレシン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>I5500</td><td></td></tr>セ<tr><td>レン</td><td>シグマ</td><td>S9133</td><td></td></tr>プロ<tr><td>ゲステロン</td><td>シグマ</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>パパイン解離システム&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td>1バイアルのパパインは、2つのサンプルに使用できます</td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>粉末を1mLのホルモンミックスで再構成し、冷凍庫に保存するために20uLのバイアルに分注します</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>0.5 mLのホルモンミックスで再構成し、20 μに分注した粉末。冷凍庫に保管するLバイアル</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>インハウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11.69 g in 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M KCL</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7.46 g in 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20.33 g 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl2</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902</td><td>1.59 g 100 mL dH2O</td></tr></tbody></table>

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する neurosphere アッセイ

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

大人の哺乳類の脊髄における神経幹細胞 (NSCs) は、勉強できる体外neurosphere アッセイを用いた脳室周囲細胞の有糸分裂比較的静止人口です。このコロニー形成アッセイは NSCs の料理で外因性の要因に対する反応を研究するための強力なツールしかし、これも使える強みの適切な理解と分析の限界と生体内での操作の影響を検討します。臨床的関心の 1 つの操作は、活性化 NSC 内因性傷害の効果です。脊髄損傷の現在のモデルは、挫傷、圧縮、および断裂の一般的なモデルの重大度は、幹細胞が存在する傷害のサイトで NSC ニッチの破壊を引き起こすこの研究への挑戦を提供します。ここでは、成体マウスの脊髄 (T7/8) の下位胸椎レベルの表面的な背側表面でローカライズされた損傷を引き起こす最小損傷モデルをについて説明します。この損傷モデルは傷害のレベルで中心部の運河をスペアし、傷害に続く様々 な時点で病変のレベルで存在する NSCs の解析が可能します。ここで、NSCs プリミティブと決定的な NSCs 脊髄脳室周囲地域内に存在する 2 つの異なる、後月関連集団の活性化を研究する neurosphere アッセイを利用できる方法を紹介 (pNSCs と dNSCs、それぞれ)。我々 は分離し、傷害および白質傷害のサイトのレベルで脳室周囲領域からこれらの NSCs を文化をデモンストレーションします。私たち手術後脊髄の解剖は、pNSC とコントロール、けがを介して、活性化に話すと比較して負傷したコードの脳室周囲の地域から dNSC 由来神経幹細胞の数の増加を示します。さらに、外傷後に、dNSC 由来の神経幹細胞分離できます傷害のサイトから-彼らの脳室周囲のニッチから傷害のサイトに移行する NSCs の能力を示します。

術後では、マウス尾と 24 h までの可能な限りの後肢麻痺を含む最小限の運動障害を体験してください。この後、マウスを体験する後肢麻痺麻痺や歩行の変化は最小限。
図 3は、最小限の脊髄損傷後 5 日 neurosphere アッセイから代表的な結果を示しています。(EFH 産) dNSC 由来神経幹細胞の絶対数が傷害の後 (LIF 産) pNSC 由来神経幹細胞の数より大きい (図 3 a 3 b、それぞれ)。決定的な neurosphere (図 3) とプリミティブ neurosphere (図 3 D) の高い電源画像直径 (≥80 μ m)、通常より大きいされている決定的な神経...

ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs の移行を定量化する方法を紹介します。

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

この方法は、再生医療における神経前駆細胞の役割に関連する質問に答えるのに役立ちます。具体的には、損傷が神経前駆細胞の行動にどのように影響するかを調べることができます。この手法の主な利点は、脊髄損傷が内因性神経前駆細胞動態に及ぼす影響を研究するアプローチを提供することです。これらの手法を視覚的に示しておくことが重要です。外科的および解剖のステップは正確さを必要とするため、練習で完成させることができますが、学ぶのは難しい場合があります。手順を開始する前に、バリカンを使用して、麻酔をかけたマウスの背側から背中の中央部から首と耳までの毛皮を取り除きます。マウスを定位固定装置に固定した後、腹部の下に4〜5枚のロールガーゼを置き、尾の付け根を軽く引っ張って体と背骨をまっすぐにします。胸部ガーゼロールをマウス腹部から胸部上部に向かって吻側に押し込み、胸椎を支えます。また、実験用テープを使用して、尾と手足を星のような向きに固定します。露出した皮膚を70%エタノールとポビドンヨードスワブで連続的に消毒した後、10番のメスの刃を使用して、両方の肩甲骨の中点から胸椎の湾曲まで、動物の縦軸に平行な垂直切開を行います。皮膚を引っ込めて、軟部組織と脊柱の輪郭を露出させます。そして、スーパー肩甲骨脂肪パッドの下縁を特定します。次に、メスを使って椎骨T5からT8の両側と9つの骨を慎重に、しかし力強く切断し、脊柱から背中の筋腱を切り離します。リトラクターの歯が脊椎の両側の切開部位に挿入されるように、リトラクターを再配置します。そして、収縮した筋肉層に過度の負担をかけずに背骨が十分に上昇するまで、各リトラクターを拡張して露出を調整します。手術用顕微鏡で、脊椎を覆っている残りの筋肉やその他の軟組織を慎重に洗浄し、椎骨を露出させます。歯付き鉗子で椎骨の棘突起をつかみ、鉗子をわずかに上下に動かして、切除する椎骨を特定します。次に、一対の湾曲した鈍いハサミの一対の先端を、露出した椎間孔の両側に挿入します。そして、接続している椎間関節を両側に切断します。次に、椎弓板を上に持ち上げ、椎弓板の上部のアタッチメントを切り取り、骨を分離して取り除きます。椎弓板を切り取って取り除くときは、下にある脊髄を傷つけないように、常にハサミを上に傾けるように注意してください。背側正中線静脈を目印にして、30ゲージの針先の45度曲げたシャフトを、斜角を上にして、脊髄の背側外側表面に1mmの深さで挿入します。そして、正中線の両側から横方向に約0.5ミリメートル。針を尾側から吻側方向に約2ミリメートル動かして、斜角の全長がコードに挿入されるようにします。次に、エントリのパスをたどって針を削除します。傷口を閉じるには、リトラクターを取り外し、6-0吸収性縫合糸を使用して、正中線に沿って損傷の両側の背中の筋肉を結合します。そして、上

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオプロトコルは、成体マウスの脳室周囲領域からの神経幹細胞を生成し、拡大するニューロスアッセイ法を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。...

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

このビデオプロトコルは、胚14日目マウスの脳の神経節隆起から神経幹細胞の単離と拡大のためのニューロスアッセイのアプリケーションを示しています。...

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

このビデオは、ニューロスフィアからの神経前駆細胞の移動応答を研究するin...

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

出典:Lakshman, N., et al.A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenus Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp.

神経幹細胞の活性化と移動を研究するための最小限の脊髄損傷モデル

増殖因子を含むフィブリンマトリクスは、完全な脊髄切断の部位に移植された神経幹細胞を維持するために使用した。移植された細胞が完全に病変空洞を満たし、長距離のホスト脊髄に軸索を延長したニューロンを含む複数の神経細胞型に分化した。...

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。...

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

成体の哺乳類の脊髄には、培養で単離および増殖可能な神経幹/前駆細胞(NSPC)が含まれています。このプロトコルは、ラットおよびヒト臓器移植ドナーからの成体脊髄の脳室周囲領域から生成されたNSPCの採取、単離、培養、および継代について説明しています。...

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

この記事では、新生児マウスで再現可能な脊髄圧迫損傷(SCI)を生成する方法について説明します。このモデルは、自発的な機能回復の根底にある適応可塑性のメカニズムを研究するための有利なプラットフォームを提供します。...

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

本稿では、主マウス神経原性ニッチ由来の出生後マウス神経幹細胞から神経球培養を生成するためのプロトコルについて詳細に述べる。神経球は、脳組織から神経幹細胞を同定するために使用され、前駆細胞数の推定を可能にする。さらに、これらの3D構造は分化条件でメッキすることができ、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを生じさせ、細胞運命の研究を可能にする。...

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

学ぶ最小限の脊髄損傷マウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化評価法。Neurosphereアッセイを用いて損傷後の神経前駆細胞の挙動と再生医療への応用可能性を定量的に解析する技術です。

最小限の脊髄損傷のマウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

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