最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

この方法は、再生医療における神経前駆細胞の役割に関連する質問に答えるのに役立ちます。具体的には、損傷が神経前駆細胞の行動にどのように影響するかを調べることができます。この手法の主な利点は、脊髄損傷が内因性神経前駆細胞動態に及ぼす影響を研究するアプローチを提供することです。

これらの手法を視覚的に示しておくことが重要です。外科的および解剖のステップは正確さを必要とするため、練習で完成させることができますが、学ぶのは難しい場合があります。手順を開始する前に、バリカンを使用して、麻酔をかけたマウスの背側から背中の中央部から首と耳までの毛皮を取り除きます。

マウスを定位固定装置に固定した後、腹部の下に4〜5枚のロールガーゼを置き、尾の付け根を軽く引っ張って体と背骨をまっすぐにします。胸部ガーゼロールをマウス腹部から胸部上部に向かって吻側に押し込み、胸椎を支えます。また、実験用テープを使用して、尾と手足を星のような向きに固定します。

露出した皮膚を70%エタノールとポビドンヨードスワブで連続的に消毒した後、10番のメスの刃を使用して、両方の肩甲骨の中点から胸椎の湾曲まで、動物の縦軸に平行な垂直切開を行います。皮膚を引っ込めて、軟部組織と脊柱の輪郭を露出させます。そして、スーパー肩甲骨脂肪パッドの下縁を特定します。

次に、メスを使って椎骨T5からT8の両側と9つの骨を慎重に、しかし力強く切断し、脊柱から背中の筋腱を切り離します。リトラクターの歯が脊椎の両側の切開部位に挿入されるように、リトラクターを再配置します。そして、収縮した筋肉層に過度の負担をかけずに背骨が十分に上昇するまで、各リトラクターを拡張して露出を調整します。

手術用顕微鏡で、脊椎を覆っている残りの筋肉やその他の軟組織を慎重に洗浄し、椎骨を露出させます。歯付き鉗子で椎骨の棘突起をつかみ、鉗子をわずかに上下に動かして、切除する椎骨を特定します。次に、一対の湾曲した鈍いハサミの一対の先端を、露出した椎間孔の両側に挿入します。

そして、接続している椎間関節を両側に切断します。次に、椎弓板を上に持ち上げ、椎弓板の上部のアタッチメントを切り取り、骨を分離して取り除きます。椎弓板を切り取って取り除くときは、下にある脊髄を傷つけないように、常にハサミを上に傾けるように注意してください。

背側正中線静脈を目印にして、30ゲージの針先の45度曲げたシャフトを、斜角を上にして、脊髄の背側外側表面に1mmの深さで挿入します。そして、正中線の両側から横方向に約0.5ミリメートル。針を尾側から吻側方向に約2ミリメートル動かして、斜角の全長がコードに挿入され

次に、エントリのパスをたどって針を削除します。傷口を閉じるには、リトラクターを取り外し、6-0吸収性縫合糸を使用して、正中線に沿って損傷の両側の背中の筋肉を結合します。そして、上にある皮膚を閉じるための4-0シルク縫合糸。

ニューロスフェアを分離するには、背中の全長に沿って皮膚に正中線を切開して、筋肉と椎骨の輪郭を露出させます。各肩甲骨の内側を持ち上げ、はさみを使用して肩甲骨と椎骨の間の軟部組織を切り取ります。下にある脊柱が露出したら、脊柱の湾曲に沿って胸の上部開口部にハサミを挿入し、付着した肋骨、筋肉、内臓を切り取って脊柱を隔離します。

ハサミを尾椎孔に挿入し、無傷の脊髄を傷つけないように注意しながら、椎弓の両側の椎間関節を切断します。適切な長さの臍帯が露出したら、脊髄組織を氷上の通常の人工脳脊髄液のペトリ皿に移す前に、臍帯から横方向に伸びる脊髄神経を慎重に切断します。解剖顕微鏡下で、脊髄組織を損傷部位の吻側と尾側に約2ミリメートルの組織を含むように切断し、2対の細い鉗子を使用して、背側と腹側の亀裂に沿って脊髄を2つの縦半分に穏やかに分離します。

マイクロハサミを使用して、負傷した背側外側白質を切り取ります。そして、損傷した組織を15ミリリットルの円錐管に入れます。脊髄の半分を鉗子で保持し、脊髄の吻側尾側に沿って2対の鉗子で損傷していない白質をからかい、取り除き、適切な脳室周囲領域を分離します。

同様に、損傷した白質と関連する脳室周囲領域を脊髄の残りの半分から分離した後、脳室周囲組織の片を個々の15ミリリットルの円錐管に配置します。そして、マイクロハサミを使用して、チューブの壁に対して組織をやさしくミンチにします。組織消化手順が完了し、単一細胞懸濁液が得られたら、細胞条件ごとに1つの25ミリリットルの組織培養フラスコに10ミリリットルの適切な培地を追加してニューロスフィア培養をセットアップします。

そして、単離された神経幹細胞を1マイクロリットルあたり10細胞のクローン密度まで追加して、細胞培養インキュベーターで培養します。24時間後、フラスコを静かに撫で、内容物を遠心分離用の個々の15ミリリットルの円錐管にデカントします。ペレットを1〜2ミリリットルの新鮮な神経基礎培地に再懸濁してカウントします。

そして、1つの条件につき1つの24ウェル組織培養プレートにクローン密度で細胞をプレートし、1ウェルあたり500マイクロリットルの適切な対応するマイトジェン補充培地を含む。次に、細胞培養インキュベーターでニューロスフェアを7日間成長させます。最小限の脊髄損傷から5日後、決定的な神経幹細胞由来のニューロスフェアの絶対数は、原始的な神経幹細胞由来のニューロスフェアの数よりも多くなっています。

決定的なニューロスフェアは、より大きな直径と大きな暗い中心を示します。一方、原始的なニューロスフィアはサイズが小さく、より密集しています。最小限の脊髄損傷は、損傷のレベルまで吻側である中心管での比較的緩やかな増加と比較して、損傷のレベルで中央管から成長するニューロスフェアの有意な増加を誘発します。

決定的なニューロスフェアは、損傷のレベルで病変のある白質からも生成できます。椎弓切除術のみの動物で形成する細胞を形成するニューロスフェアを含まない領域。原始神経幹細胞の同様の増加は、損傷後に観察されますが、病変部位のレベルの白質にある原始神経球は例外です。

一度習得すれば、手術技術は40分以内に行うことができます。また、組織の解剖と分離は、適切に行えば30分以内に行うことができます。外科的処置の後、動物系統に応じて、免疫組織化学や直系ショッキングなどの追加の方法論を使用して、増殖速度論や損傷後の神経前駆細胞の自己運命などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、脊髄損傷後の神経幹細胞の活性化を評価するためにニューロスフィアアッセイをどのように活用するかを十分に理解できるはずです。