Name: 上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca2 +応答をイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ 赤痢菌感染時のHeLa細胞における局所・全体的カルシウム応答の可視化法。蛍光プローブを用いた顕微鏡解析により、細菌感染誘導型シグナルの動態を解析し、細胞微生物学の理解を深める。

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ジェニー ・ リー Thomassin は、編集原稿で彼女の助けを感謝いたします。仕事は、ANR によって支えられた助成金 MITOPATHO や PATHIMMUN、Labex Memolife と PSL アイデックス Shigaforce から付与します。春暉太陽中国公費から博士の付与の受信者であります。ローラン Combettes 男 Tran ヴァン状態、WBI フランス exchange Tournesol プログラム N ° 31268YG の受信者 (Wallonie ブリュッセル国際、フォン デ ラ凝った日仏、ミニステール Français デ アフェール étrangères et アーツアンドクラフツ、ミニステール デ期高等エ デ ラ凝った dans ル幹部デ Partenariats ヒューバート Curien)。

1. 準備
<ol><li>
細菌の準備
	<ol>
<li>細菌をプレート-赤痢菌野生株 AfaE 双球菌 (M90T AfaE) を表現する-、トリプチ大豆 (TCS) 寒天プレート含む 0.01% コンゴーレッド (CR) と 37 ° C で 18 h にそれらをインキュベート 注: その再現性を高めるため 1.1.1 手順で取得した赤痢菌プレートは 4 ° C で格納され、CR の媒体上のすべてのコロニーは最終的に時間をかけて赤回すために、一週間以内使用します。</li>
		<li>縞板から 3 の赤色のコロニーを選ぶことによって TCS スープ前培養を接種します。 メモ: 3 植民地で接種はその病原性プラスミドは、遺伝子組換えを受けている単一のクローンを拾う確率を制限する実行されます。</li>
		<li>200 rpm で 37 ° C で 16 時間振動のインキュベーターで液体細菌文化を育てます。75 mg/mL の最終的な集中にアンピシリンを追加します。抗生物質の過剰が大きな病原性プラスミドの損失につながる可能性がありますので、抗生物質濃度は最小発育阻止濃度 x 3 を超えない。 注:赤痢菌の病原性プラスミドの維持は、適切な抗菌薬濃度を添加したクロム プレートに細菌文化をメッキすることによって確認する必要があります。白人の植民地の存在は、プラスミドの損失を示します。</li>
		<li>1: 100 希釈で前培養と TCS 文化を接種します。2 h 200 rpm での振動のインキュベーターで 37 ° C でそれを孵化させなさい。600 の光学濃度は、nm (外径600 ナノメートル) は 0.2 - 0.4。</li>
		<li>21 ° C で 13,000 x g で 2 分間培養を遠心し、EM 媒体 (の 120 mM の NaCl、7 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgCl2、5 mM グルコースおよび 25 mM HEPES の同等のボリュームでペレットを再懸濁します、pH 7.3 を =)。</li>
		<li>0.1 の最終的な OD600 ナノメートルで EM バッファー内細菌懸濁液を希釈してすぐに使用または 21 ° C で保存し、次の 60 分以内使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セル準備
	<ol>
<li>DMEM ブドウ糖 1 g/L と HeLa 細胞 10% 牛胎児血清 (FCS) を添加した 10% CO2と 37 ° C で育てて.成長する TC-7 4.5 G/L グルコース、DMEM で成長 10 %fcs と 10% の CO2を含む 37 ° C の定温器で非必須アミノ酸を含みます。</li>
		<li>コンフルエントの状態にリンクされているセル メンテナンス、成長接触阻止を避けるために定期的にセルを分割します。これは Ca2 +プローブ荷重/トランスフェクション効率にとって重要です。</li>
		<li>3 x 105細胞/ウェル HeLa 細胞の実験の前に日の密度で 6 ウェル プレートで滅菌 25 mm 径円形カバーガラス上 HeLa 細胞をプレートします。</li>
		<li>TC 7 セル、trypsinize し、セルをカウントします。4 x 105細胞/ウェルでそれらの種子し、10% の CO2の 37 ° C で 5 ~ 7 日間それらを孵化させなさい-偏光は、実験前にインキュベーター。<ol>
<li>細胞培養液を実験の日まで毎日更新します。 注: ガラス底直径 35 mm の使い捨て室は、coverslips 含む井戸の代替としても使用可能性があります。後者は使用すると、加熱ステージ温度制御や目標は不十分で、サーモスタット インキュベーション室にマウントされている場合、顕微鏡ステージが必要です。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験の日メディアを取り出して、洗浄セル 3 x は 21 ° C で 1 mL EM 媒体</li>
	<li>3 mm の蛍光 4時14 21 ° C で 30 分間 EM バッファー内セルを読み込む 注意: サブ合流 HeLa 細胞の読み込みには、主要な問題は発生しません分極された TC 7 セルの読み込みが多くの場合異種と効率悪い。これらの細胞のための分散剤の添加により積載効率が向上することがわかった、プルロニック酸 — 最終濃度 0.1% と 20 μ M からの最終的な集中で陰イオン輸送阻害剤 bromosulfophtalein ので、蛍光色 4 AM 含有 EM。レシオ メトリック化学の使用プローブまたは遺伝子エンコードは、フレットのプローブを必要とするデュアル取得はローカル Ca2 +応答の計測に必要な取得の速度と互換性がありません。</li>
	<li>サンプル 3 を洗って x EM をバッファーに格納し、さらに 1 mL の午前部の加水分解を許可する 21 ° C で EM バッファーにそれらを孵化させなさい。使用蛍光-4 は、すぐにまたは (21 ° C で維持される) 次の 90 分以内に細胞を読み込まれます。</li>
</ol>2. 感染症およびローカル Ca2 +応答画像集録
<ol><li>イメージングの商工会議所またはガラス下部室の蛍光色 4 ロード セルを含む coverslip を配置します。ガラス底使い捨ての部屋のセル換散から生じる可能性のある化合物を削除するのには EM バッファーで 3 x またはイメージング室のサンプルを洗います。1 mL の EM バッファーを追加します。</li>
	<li>33 ° C に加熱倒立蛍光顕微鏡ステージでチャンバーを配置します。 注: この温度は、現地の反応を可視化する赤痢菌侵入プロセスと互換性のある最適な温度と Ca2 +反応の減速間の妥協として選択されます。私たち使用浸漬油目的 X 63 (NA = 1.25) 位相コントラスト リングを装備。</li>
	<li>顕微鏡フィールドを選択し、集録パラメーター、露光時間を含むとビニング蛍光 4 蛍光信号を最適化するために、必要に応じてを設定します。 注: ローカル Ca2 +イメージングの主要な課題は、低振幅と、応答の小さい持続期間少なくとも 30 さんの取得を必要とするいくつか市販裏面照射型 EM CCD や C-MOS カメラを提示必須蛍光色 4 を使用してローカルの Ca2 +応答を検出する感度。検出感度がまた光損傷または高周波蛍光色 4 の蛍光励起にリンクされている自発的な応答などの工芸品を制限する重要な問題です。ここでは、470 の LED ベース照明 480 ± 40 nm バンドパス励起フィルター、ダイクロイック フィルターは 505 nm 1.0 中立的な密度のフィルターと組み合わせて、最大強度の 5% で使用される 527 ± 30 nm バンドパス排出と nm を用いてこれらの問題を最小限に抑える限られた期間の買収のストリーム。120 s ストリームのバッチによってローカル Ca2 +シグナルの解析を定期的に行った。これらの低照明条件下で蛍光退色は 2 分ストリーム集録中に観察されなかった.別のフィールドを使用、同じサンプルの連続した買収を実行できます。一般的なルールとして最初取得ストリームは自発的な応答の不在の保障を細菌刺激のない状態でコントロール フィールドで実行されます。自発的な反応が認められた場合、応答が観察されなくなるまでサンプルが EM バッファーで洗浄しました。</li>
	<li>細菌をサンプルに追加するには、商工会議所から 500 μ L の EM バッファーを削除し、最終的な OD600 ナノメートル0.05 に対して選択した顕微鏡によるフィールドの移動を避けるために適切なケアを取得するステップ 1.1.6 で準備して細菌懸濁液 500 μ L を追加ボリュームは、細菌と細菌細胞のサンプルの上に均一に分布の適切な混合を確認します。</li>
	<li>細菌の添加によって買収を実行します。また、買収 10 分使用条件下での細胞の上に土砂を細菌に必要な時間に対応する細菌の添加を行います。買収ストリームの最後には、細菌の細胞と細菌侵入サイトに関連付けられた膜フリルに連絡を視覚化する選択したフィールドの位相コントラストの画像を取得します。</li>
	<li>画像関連の買収やファイル貯蓄、全体のプロセスをカバーする新しいフィールドの選択の期間に適している間隔でステップ 2.5 のように取得手続きを繰り返します。 注:赤痢菌がわかった 20 分の 5 分ごとを買収にストリーム次の侵略イベントの大部分をカバーできる 10 分の細菌堆砂</li>
	<li>取得手続きの最後に、Ca2 +イオノフォア イオノマイシン サンプル Ca2 +信号の最大振幅を決定するための 2 μ M の最終的な集中を追加します。画像を集録信号安定化、通常 10 分以内までのすべての 3-5 秒。</li>
	<li>10 mM の Ca2 +蛍光信号を決定するための最終濃度 Ca2 +グリコールエーテルジアミン四酢酸キレート剤を追加することによって従ってください。画像を集録信号安定化、通常 10 分以内までのすべての 3-5 秒。 注: グローバル Ca2 +バリエーションの比較的低速のダイナミクスのため実行これらの買収 Ca2 +連続治療中同じミクロな場にイメージングを可能にする (ストリーミング モード) ではないすべての 3-5 秒。</li>
</ol>3. 分析
<ol><li>同じ収益率でベースライン蛍光 ΔF/F0ΔF が利益 (率 ROI) の地域の平均蛍光強度の変化を表すと F0の割合として時間をかけてゾル性細胞質の Ca2 +バリエーションを表現、細胞に欠けている分野の非関連する領域が減算されます。<ol>
<li>ベースライン レベルに対応する、様々 な分野で各セルの基底蛍光レベルを削除します。これらのレベルは低周波により明確に定めることができるし、指定したストリーム取得のローカル Ca2 +応答期間の比較的短い。 注: は、質問への対応と検討した病原性モデルの顕著な特徴を定量化します。古典的なさまざまなパラメーターは、Ca2 +シグナル、ローカルまたはグローバル Ca2 +応答、持続時間、振幅、これらの応答の周波数を示す細胞の頻度などを分析する考慮されます。赤痢菌およびローカル応答の場合の分析の別の重要な側面の細菌侵入サイトと応答の空間関連付けることです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>グローバルまたはローカル応答を示す応答細胞の割合を定量化するには、時系列 4 蛍光強度の変化に対応する細胞で Roi を描画します。<ol>
<li>偽陽性を得点を避けるためにローカルの Ca2 +応答振幅の平均蛍光強度セル基準の 3 倍の上記背景バリエーションや、少なくとも 200 ms の期間などを識別するために厳格なパラメーターを設定します。 注: 一般的なルールとしても、小さなローカル Ca2 +反応が自分のプロファイルで任意のバック グラウンド ノイズと区別できます。Roi は、ローカル変化の検出を実現する十分な蛍光信号を統合するのに十分な大きさにする必要があります。4 蛍光検出の強さに応じてこれらの Roi は、2-5 mm の直径のサークルに対応があります。</li>
		<li>応答がローカルまたはグローバルかどうかを決定するため、同じセルの異なる地域の 2 地域で平均蛍光 4 蛍光強度の変化を測定します。 注: 多数のセルの解析は、イメージング ソフトウェアは、選択された領域の期間平均蛍光強度の変化のオンライン画面の表示を許可するの使用によって促進されます。市販のイメージング ソフトウェア、そのようなオプションがありますが、これはROI 強度進化プラグインを使用して氷フリーウェアを使って行うこともできます。</li>
		<li>ローカル応答を示す細胞の割合を決定します。 ※ この割合をサポートするための十分な数にする必要があります [顕微鏡] フィールドで分析セルの合計数から算出しています、統計的に有意な非パラメトリック テストを使用します。</li>
		<li>現地の反応の期間を決定します。 注: ローカル Ca2 +応答さらに区別できる期間は彼らによると (すなわち、 500 ミリ秒未満、5 や 10 秒間以上の 10 s)、赤痢菌侵入サイトとの関連付け。</li>
	</ol>
</li>
	<li>応答の振幅を定量化します。まず、最大 Ca2 +およびセル背景レベル ステップ 2.1.7 のように決定を調整します。蛍光色 4 負荷をセルごとに異なる場合がありますので、フィールドの個々 のセルのこれらの決定を実行します。<ol>
<li>最大応答の相対的な割合として応答の振幅を表します。</li>
		<li>サンプルの応答の振幅に潜在的な相違点を分析するパラメトリック テストに続いて、正規性の検定を利用した統計的テストを実行します。</li>
		<li>対応する位相コントラストの画像で視覚化される細菌膜フリルにそれぞれ局在により細菌侵入サイトと比較してこれらの応答の関連付けを決定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
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<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

著者申告するものがあります。

本稿では、我々 は、全体的な Ca2 +応答と同様に、赤痢菌侵入の比較的短い動態の中に赤痢菌の拡張動態の中にローカル Ca2 +シグナルに従う設計プロトコルについて説明します。以下、Ca2 +の検出能力を最適化に対処する必要がある問題を見つけることができますキーは生物的プロセスとの干渉を最小限に抑えながら信号します。
化学対Ca2 +プローブをエンコードされた遺伝子。
ローカル Ca2 +バリエーションのイメージは、その高い量子収率とその高速応答ダイナミクスのため蛍光 4 化学プローブを使用しました。取得に必要な速度はまたデュアル波長集録を実行できないためレシオ メトリック プローブの使用を排除します。ただし、病原性微生物の使用は、Ca2 +化学プローブを用いた標準的な手順を妨げる可能性があります。たとえば、長時間細胞感染赤痢菌で ...

Ca2 +細胞骨格の再編、炎症性応答、およびホスト病原体の相互作用1,2,3に関連する細胞死経路を含むすべての知られている細胞プロセスを調整します。生理学的な条件の下で基底細胞内 Ca2 +濃度低い nm の波長範囲の何百ものですが、アゴニスト刺激時に一過性に増加を受けることができます。これらのバリエーションは、プラズマと小胞体膜にポンプやチャネルの作用により振動現象をしばしば示します。これらの振動のパターンと期間、期間、および Ca2 +増加の振幅によって特徴付けられる細胞は、ターンでは、Ca2 +のコード4,5 として知られている特定の応答をトリガーによって復号化.病理学の条件下でのゾル性細胞質の Ca2 +濃度の持続的な増加は、ミトコンドリア膜の透過と pro アポトーシスや壊死の要因6のリリースに関連する細胞死につながる可能性があります。 7。
赤痢、細菌性赤痢の病原には、タイプ III の分泌システム (T3SS)8,9を使用して宿主細胞にエフェクターを注入することで上皮細胞が侵入します。宿主細胞の赤痢菌の侵入は、ローカルおよびグローバルな Ca2 +シグナル、T3SS によって誘発されるに関連付けられます。細孔形成に関しては毒素、宿主細胞膜に挿入し T3SS エフェクタの注入はほとんどの場合が必要 T3SS トランスロコン PLC と (1、4、5) イノシトール三リン酸 (InsP3) の活性化に関与-従属 Ca2 +リリース。ローカライズされた PLC 刺激と赤痢菌侵入結果、になって長期 InsP3 依存性 Ca2 +のサイトで重合のアクチンの蓄積の組み合わせ10 月に発売します。タイプ III エフェクター IpgD、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2)-4-ホスファターゼ、PIP2、それによりローカル Ca2 +の閉じ込めに貢献する InsP3 を生成する PLC の利用可能な基質の量を制御するローカル量に制限細菌の侵入サイト11,12の応答。赤痢菌の侵入サイト10でアクチンの重合に寄与するこれらローカル Ca2 +応答可能性があります。ただし、赤痢菌、によって誘発される、またグローバルの Ca2 +反応が細菌侵入プロセスに不可欠であるコネキシン hemichannels プラズマ膜の開口部と、細胞内 ATP の放出をトリガーコンパートメントです。リリースされた ATP パラクリン的演技が感染した細胞の隣の細胞内 Ca2 +振動応答を刺激します。IpgD は遅いダイナ ミックスと常軌を逸した分離応答に全体的な Ca2 +応答を形成するための責任も。最終的には、長期にわたる細菌感染時に IpgD は InsP3 を介した Ca2 +シグナルの抑制につながります。Ca2 +シグナル伝達とその干渉、IpgD 遅延 Ca2 +-焦点接着構造の分解との早期剥離につながる依存カルパイン活性化感染細胞13。
一方、Ca2 +シグナルは、病因の重要な側面に関与している、微生物の使用は古典的なアゴニスト研究では見られない技術的な課題の数を発生させます。説明プロトコルここでインジケーターを使用して一般的に使用される蛍光 Ca2 +化学蛍光 4 我々 は赤痢菌の感染時にローカル Ca2 +信号の特性評価に設計されました。細菌のエフェクターの Ca2 +シグナル伝達の役割の特性評価に必要なその定量的評価の実施手順と同様、これらの信号の検出のための重要な手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph version 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED照明システム pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロディッシュ 35 mm、高&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカーゼ醤油(TCS)ブロス</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS 寒天</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>コンゴレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td><>Shigella flexneri 血清型 V. AfaE を発現する adhesin</td><td></td></tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>AfaEアドヘシンを発現する同質遺伝子ipgD変異株</td><td></td></tr></tbody></table>

上皮細胞の赤痢菌の感染時に ca2 +応答をイメージング

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2 +は、すべての知られている細胞プロセスにかかわるユビキタス イオンです。全体的な Ca2 +応答は細胞の運命に影響を与える、無料 Ca2 +細胞質濃度で、内部の店舗や細胞膜のチャネルを通じて流入からリリースにリンクされているローカルのバリエーションは皮質細胞プロセスを調整します。病原体に付着またはホスト細胞トリガー グローバルおよびローカル Ca2 +シグナルに影響を与える可能性がありますホスト細胞膜の基礎となるアクチン細胞骨格の再編に侵入します。これらのイベントは、拡張動態上擬似確率的に低周波数で発生可能性があります、ために、病原体による Ca2 +シグナルの解析は対処する必要がある主要な技術的な課題を発生させます。
ここで、上皮細胞の赤痢菌の感染時にグローバルとローカルの Ca2 +シグナルの検出のためのプロトコルを報告します。これらのプロトコルの工芸品は、長期の暴露にリンクし、関連付けられている Ca2 +蛍光プローブの励起光損傷は厳しく、中に定義された時間の期間にわたって集録パラメーターを制御することにより対処法赤痢菌侵略。厳密な化学プローブ蛍光 4 を使用して拡張の感染動態の中に振幅とグローバルのゾル性細胞質の Ca2 +シグナルの頻度を分析する手順が実装されます。

赤痢菌の侵入は非定型の長期的なローカル Ca2 +応答に関連付けられています。
上記のプロトコルに従い WT赤痢菌と挑戦された蛍光 4 読み込まれた HeLa 細胞と Ca2 +信号を解析するストリームを買収を行った。代表的な実験は単一セルと対応する位相コントラスト (図 1 a、左の関心領域内平均 4 蛍光プローブの蛍光強度のコマ撮り画像シリーズを図 1に示すパネル)。赤痢菌侵入サイトは、位相コントラスト (図 1 a, 矢印) で検出された膜フリルが特徴です。無料の細胞内 ca2 +が赤痢菌侵入サイトさまざまな振幅と感染の世界的な増加によって...

ここでは、赤痢菌に感染した HeLa 細胞によるカルシウム (Ca2 +) 応答を可視化するためのプロトコルを提案する.細菌感染のパラメーターを最適化して Ca2 +蛍光プローブとイメージングにより、非定型グローバルおよびローカル Ca2 +シグナルによる細菌感染速度の広い範囲に、特徴付けられます。

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca2 +応答をイメージング

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

化学プローブを用いたこの蛍光顕微鏡分析の全体的な目標は、病原性赤痢菌による感染中に宿主細胞によって誘発される局所的および全体的なカルシウム応答を分析することです。この方法は、細胞骨格の再編成や細胞死につながる病原体によるシグナル伝達など、細胞微生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、化学プローブを使用することで、病原体によって迂回された局所的なプロセスに関連する局所的なカルシウムシグナルを追跡できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、生物学的サンプルの完全性を維持しながら局所的なカルシウムシグナルを追跡できるパラメータの設定のために苦労します。まず、0.01%コンゴレッドを含むトリプチカーゼ大豆またはTCS寒天プレートにAfaE接着を発現させた野生型赤痢菌をプレート化し、プレートを摂氏37度で18時間インキュベートします。縞模様のプレートから、3つの赤いコロニーを選び、TCSブロスにアンピシリン1ミリリットルあたり75マイクログラムを接種して、前培養液を調製します。振とうインキュベーターで37°C、200rpmの振とうインキュベーターで16時間培養します。次に、TCSに細菌のプレカルチャーを1:100の希釈で接種します。培養物を摂氏37度で、200rpmの振とうインキュベーターで2時間インキュベートします。600ナノメートルでの光学密度が0.2〜0.4であることを確認してください。培養物を13, 000g、摂氏21度で2分間遠心分離し、ペレットを等量のEM培地に再懸濁します。EMバッファー中の細菌懸濁液を最終OD60000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000010%FCSを添加したグルコース1リットルあたり1グラムでDMEMでHeLa細胞を増殖させ、10%CO2で摂氏37度で培養を増殖させます。1リットルあたり4.5グラムのグルコース、10%FCS、および非必須アミノ酸を含むDMEMでTC7細胞を増殖させ、摂氏37度、CO2を10%で培養します。細胞の維持のためには、コンフルエント状態に関連する増殖接触阻害を避けるために、細胞を定期的に分割します。これは、カルシウムプローブのローディングとトランスフェクション効率を高めるために重要です。TC7細胞をトリプシン化してカウントします。HeLa細胞を用いた実験の前日に、1ウェルあたり5個の細胞に対して10の3倍の密度で、直径25mmの無菌の直径25mmの円形カバースリップに細胞をプレート化します。次に、実験前に分極を可能にするために、ウェルごとに5つの細胞に10の4倍で細胞を播種し、毎日培地を交換しながら5〜7日間インキュベートします。実験当日は、培地を取り出し、1ミリリットルのEM培地を使用して細胞を3回洗浄します。細胞に3マイクロモルのFluo-4 AMおよびEMバッファーをロードし、プレートを摂氏21度で30分間インキュベートします。EMバッファーを使用して、サンプルを3回洗浄し、1ミリリットルのEMバッファーを加え、細胞を摂氏21度でインキュベートして、AM部分の加水分解を可能にします。Fluo-4をロードした細胞が入ったカバースリップをイメージングチャンバーまたはガラス底チャンバーに入れます。EMバッファーを使用してサンプルを3回洗浄し、細胞溶解から生じる可能性のある化合物を除去します。次に、1ミリリットルのEMバッファーを追加します。チャンバーを33°Cに加熱した倒立蛍光顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡フィールドを選択し、必要に応じて露光時間やビニングなどの取得パラメーターを設定して、Fluo-4蛍光シグナルを最適化します。サンプルに細菌を添加するには、チャンバーから500マイクロリットルのEMバッファーを慎重に取り出し、500マイクロリットルの細菌懸濁液を追加して、0.05の最終的なOD600を得ます。すぐに取得を行うか、10分待ってから細菌が細胞に沈殿します。取得ストリームの最後に、選択したフィールドの位相コントラスト画像を取得して、細胞に接触する細菌と、細菌の侵入部位に関連する膜の波紋を視覚化します。画像取得、ファイルの保存、およびプロセス全体をカバーする新しいフィールドの選択の期間に適した間隔で、取得手順を繰り返します。取得手順の最後に、カルシウムイオノフォアイオノマイシンの2マイクロモルをサンプルに追加して、カルシウムシグナルの最大振幅を決定します。信号が安定するまで、通常は10分未満で、3〜5秒ごとに画像を取得します。続いて、カルシウムキレート剤EGTAを最終濃度10ミリモルまで添加し、カルシウム非存在下での蛍光シグナルを決定します。信号が安定するまで、通常は10分未満で、3〜5秒ごとに画像を取得します。テキストプロトコルに従って画像解析を行います。この実験では、Fluo-4をロードしたHeLa細胞に野生型赤痢菌を添加し、カルシウムシグナルを解析するためにストリーム取得を行いました。Fluo-4プローブの蛍光強度のタイムラプス画像シリーズを、単一細胞の関心領域で平均化し、対応する位相コントラスト画像を示します。遊離細胞質カルシウムの非定型局所的な増加は、赤痢菌浸潤部位で観察され、振幅と持続時間は2.5秒から5秒の範囲で変化し、その後、感染細胞の全体的な増加が続きます。この例では、III型エフェクターIpgDを欠損した同遺伝子変異株、ホスファチジル4,5−ビスリン酸ホスファターゼが、野生型赤痢菌株と比較して、よりグローバルで非定型でない局所応答を長時間誘導した。この実験で見られるように、長期にわたる感染動態に対する全体的なカルシウム応答のイメージングは、野生型赤痢菌の挑戦から30分後に応答の頻度が減少することを示しています。最後に、カルシウムアゴニストヒスタミンに対する用量依存的な細胞応答の定量化は、赤痢菌感染の後期段階でのイノシトール三リン酸依存性カルシウム放出の阻害を示しています。この手順に従うと、適合する流体とイメージングを同時に組み合わせたすべての方法を実行して、特定のプロセスにおけるカルシウムシグナルの役割に対処することができます。病原体を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、廃棄物処理、汚染された表面や機器の清掃などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Vonaesch, P. ら、 哺乳類細胞の細菌挑戦後のストレス顆粒形成の免疫蛍光解析。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオは、病原性細菌シ ゲラ・フレクスネリ...

がん性上皮細胞の シゲラ 感染による応力顆粒の形成

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

このビデオは、ヒト上皮細胞の赤痢菌感染時に局所的および全体的なカルシウムイオン応答を検出する技術を示しています。赤痢菌は宿主細胞に侵入し、浸潤エフェクターを放出し、細胞内のカルシウムレベルに影響を与えます。局所的および全体的な細胞質カルシウムの振幅と周波数は、蛍光インジケーターを使用して研究されます。...

細菌感染細胞のカルシウム応答を研究するイメージング技術

我々は内膜破裂を追跡するための方法を説明することは細胞内細菌によって誘発...

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

病原体の普及に対抗するために、宿主細胞には、細菌を区分し、オートファジーを誘導するそれらの細胞骨格を再編成する。組織培養細胞のシゲラ感染を使用して、このプロセスの基礎となるホストおよび病原決定因子が同定され、特徴付けられる。 シゲラ感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、発見された分子およびメカニズムの役割は、in vivoで調べた。...

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

赤痢菌による上皮細胞感染解析

パイエル板を覆う特殊な濾胞関連上皮におけるM細胞は腸管関連リンパ系組織における粘膜免疫監視に重要な役割を果たす。ここでは、M細胞による細菌のトランスサイトーシスのために評価方法を説明...

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。...

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

肺炎球菌によるマウス鼻咽頭のコロニー形成および後の付着またはリクルートされた細胞の抽出について説明する。この技術は、ナアレスを通して鼻咽頭および流体の収集を洗い流し、その場所でのmRNA発現の差動細胞定量および分析を含む様々な読み出しに適応可能である。...

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。...

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

学ぶ 赤痢菌感染時のHeLa細胞における局所・全体的カルシウム応答の可視化法。蛍光プローブを用いた顕微鏡解析により、細菌感染誘導型シグナルの動態を解析し、細胞微生物学の理解を深める。

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca^{2 +}応答をイメージング

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