Name: 暗殺者のバグやその他のカメムシの昆虫から毒の毒素を収穫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぼう、アサシンバグなどのカメムシ類から電気刺激やハラスメントを用いて毒液を採取する方法。これらの技術は、神経科学や毒学研究において未解明のタンパク質毒素の特性解析と新規医薬応用の基盤を提供する。

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我々 は金融を認めるオーストラリア国立保健・医学研究評議会 (主要研究員、オーストラリアの研究評議会 (助成金 DP130103813 と G.F.K.、EABU に DECRA 交わり DE160101142 に LP140100832) からサポートG.F.K. に APP1044414)、クイーンズランド大学 (A.A.W. に員) など。

このプロトコルは、レスポンシブル ・ ケアと教育・研究における動物の使用(PPL 4.20.11) と同様に、国立健康医学研究議会ののケアのためのオーストラリアのコードとの使用でクイーンズランド大学のポリシーに準拠します。科学的な目的のための動物(8th版 2013)。
注意: すべき envenomated は暗殺者のバグを処理するとき注意してください。守備の毒を吐く種を処理するとき、目を保護するために注意してください。全体で世話をする実験動物を傷つけないように。これには、輪ゴムなどの拘束圧の監視、および、テングが壊れていないことが含まれます。
注: 必要に応じて、0.5-2 の CO2の露出によって動物を anaesthetize 分や毒で収穫前の 4-10 ° C に冷却を目指す 1-3 安全な移送と拘束を容易にします。Anaesthetization は必須ではないが、アジャイルまたは強力な標本の安全制限を容易にする可能性があります。しかし、動物は毒を収穫できるように目がさめている必要があります。プロテアーゼ阻害薬を追加するかどうかを決定するときダウン ストリーム アプリケーションを覚えておいてください。
1. 電気刺激による毒の毒素の収穫
<ol><li>ライブ標本から毒素を収穫するを取得します。</li>
	<li>正極・負極の事前に用意されたプラスチック ピンセットは、どちらかの先端にマウント。電化のピンセットを electrostimulator または電圧の調整が可能な定電圧源に接続します。<ol>
<li>小さな (~ 10 mm) と大 (〜 25 mm) サシガメ、15 と 25 V のピーク電圧をそれぞれ使用します。</li>
		<li>巨大な水のバグなど大きな heteropterans は、最大 40 V を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>胸部にゴムバンドを使用して、プラットフォームにそれらのストラップがライブのバグを抑制します。</li>
	<li>適切な収集のヒントに口吻の先端を配置します。サシガメ、P200 ピペット チップを使用します。巨大な水のバグ、P200 先端開口部のサイズを増やすために下肢をカットします。<ol>
<li>優しく清潔なピンセットの閉じたペアでテングを持ち上げ、テングの終わり上コレクション先端の開口を押してください。</li>
		<li>必要に応じて、収集に口吻を配置する前に取り込み 〜 5 μ L の純水がヒントします。これは収穫された毒が薄くなることが毒、チップ内部の残りの損失を低減します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気刺激を適用します。2.5 M NaCl/50% グリセロールなどの導電性ゲルの刺激電極を浸しなさい。胸部に電極を適用します。Belostomatids、頭の背側後面に 2 つの電極を適用します。</li>
	<li>Autodegradation を防ぐために毒を格納します。毒を押し出し後、-60 ° C または-20 ° C でチューブやプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含むチューブにすばやく転送します。</li>
	<li>1.5 と 1.6 の手順を繰り返して十分な毒を取得または今後さらに毒はありません。</li>
</ol>2. ハラスメントによる毒の毒素の収穫
<ol><li>毒を収穫するため動物を準備し、1.1 と 1.3 1.4 のサブセクションで説明するようコレクション前庭で口吻の先端を配置します。</li>
	<li>毒が自然に押し出されて、2.3 の手順に進みます。ない場合は、優しく触って脚、腹部と触角にピンセットで毒を生成まで動物を苦しめます。</li>
	<li>すぐに必要な場合、管含むプロテアーゼ抑制剤のカクテル、-60 ° C または-20 ° C の管へ毒を転送します。</li>
</ol>3.「吐き」種の毒から嫌がらせで毒の毒素の収穫
<ol><li>Anaesthetize、または、部分的に anaesthetize、任意の時期尚早守備吐きようにエンクロージャから取り外す前に昆虫。</li>
	<li>毒吐く動作を引き起こします。含まれており、標準 90 x 16 mm ペトリ皿の深い蓋を使用して虫の位置を変更します。防ぐため飛行する昆虫の上 1-4 cm のやや後方の蓋を保持します。ほとんどの昆虫はしばしば立て続けに数回を吐き出すでしょう。すべての毒を皿の下側に収集します。</li>
	<li>ペトリ皿の下側に毒を収集するには、10 μ L の純水で洗浄します。すばやく-60 ° C または-20 ° C でチューブやプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む管にそれを転送します。</li>
</ol>4. 腺解剖によって毒の毒素の収穫
<ol><li>動物を犠牲に。大きく anaesthetize またはを使用して動物を殺す > CO2を 5 分露出。動物のハウジング筐体の空気穴に直接パイプを純粋な CO2 。</li>
	<li>ピン昆虫解剖トレイ。暗殺者のバグの腹側表面 (4.3) を解剖します。巨大な水のバグの背側表面 (4.4) を解剖します。</li>
	<li>腹側郭清<ol>
<li>毒液腺に穴をあけることがなく昆虫を押しながら後部の腹部に 3 本のピンを挿入します。</li>
		<li>小型のメスを使用して腹部の腹側表面に短い正中切開をカットします。外骨格のみをカットし、内部構造を損傷しないように注意しながら、頭を前方正中切開を拡張するのにミニチュアはさみを使用します。</li>
		<li>内部構造を公開するには、するには、正中切開から昆虫の側に伸びる複数の水平カットを確認します。内部構造を明らかにする腹側の外骨格の各フラップ、ピンバックします。</li>
		<li>大きなサシガメの中間腹部、前腹部、最初と 2 番目の足の間と第 1 戦の前に 4 つの横切開を作る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>背郭清<ol>
<li>基地の近くの翼を削除します。毒液腺に穴をあけることがなく昆虫を押しながら後部の腹部に 3 本のピンを挿入します。</li>
		<li>ミニチュアはさみやメス、外骨格のみをカットし、内部構造を損傷しないように注意しながら使用して腹部に頭から正中切開をカットします。</li>
		<li>昆虫の 2 つの半分を離れて強制的に。公開されている内部の空洞を残して昆虫の長さに沿って横方向にいくつかのピンを配置します。</li>
		<li>ピンセットを使用して飛行筋肉を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>郭清トレイを洪水します。簡単に可視化バグが内部構造をフロートし、するを許可する浸水までは、PBS を追加します。</li>
	<li>マイクロ剪刀、ピンセットを使用すると、気管や神経組織結合を慎重に取り外します。毒液腺のように細長い、消化管の各側面に沿って延びる透過する構造体です。<ol>
<li>前葉および後葉門部で会った 2 つのダクトとその特徴的な外観、主な腺を識別します。</li>
		<li>必要な場合は、肺門からダクトをトレースして付属腺を識別します。門部から発せられる 2 つのダクトを切断することによって主要な腺を無料します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>必要な腺ルーメンを収穫します。30 μ L の PBS または PBS を含有した氷の腺を遠心機に転送プラスのプロテアーゼ抑制剤のカクテル。鋭いピンで腺を槍します。<ol>
<li>10 s および腺ルーメンを空にして (1 分、5,000 × g、4 ° C) 遠心分離機の渦。ピンセットを使用して腺組織を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>毒素抽出物を明らかにします。遠心分離機 (5 分、17,000 × g、4 ° C) 任意の固体粒子、上澄みを保持とペレットを破棄を削除します。Autoproteolytic の劣化を防ぐため-60 ° C または-20 ° C で保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venoms+of+heteropteran+insects%3A+A+treasure+trove+of+diverse+pharmacological+toolkits%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits.</a> Toxins. 8 (2), 43(2016).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

サシガメ毒を収穫の最も重要なステップは、研究の目的に応じて適切な方法を選択します。かめむし類の毒を収穫のために提示する 3 つの方法のそれぞれが長所と短所下流のアプリケーションに応じて。
テング (プロトコル 1-3) から毒を追放するバグを誘発する腺組織で毒の汚染を回避します。さらに、これらのメソッドは非殺傷、バグズ ・ ライフのコースで何度も繰り返すことができます。電気刺激は通常、毒の最大量を提供し、いくつか研究5,8によると昆虫を捕食する強力な毒性を持つ毒を得られます。防御的な応答を刺激、テングと電気8異なるたんぱく毒をもたらす可能性があります 1 つの毒を引き出すために別の方法です。ただし、多くの種の電気刺激と挑発が動作しません、毒液腺の分泌の出力の平行調査なしは不明だが腺腔 (または腺ルーメンの組み合わせ) が収穫されています。
相補的な多くの方法では郭...

かめむし類の毒は、強力生理活性物質1です。たとえば、キスのバグ (クロタマゴバチ)、ベッドのバグ (Cimicidae) などのカメムシの吸血の毒/唾液分泌を容易に止血2を破壊して給餌。これらの毒の毒素は、凝固、血小板凝集と血管収縮、痛みなど複数の経路をターゲットし、経路をかゆみ。他のほとんどのかめむし類種から毒は吸血するのではなく、捕食を容易にするために合わせられます。その毒は、麻痺、死および無脊椎動物3,4に注入する組織の液状化を引き起こします。脊椎動物に注入される毒液抜本的な効果はあります。例えば、脊椎動物にサシガメHolotrichius innesiから毒の注入により痛み、筋麻痺、出血;このバグによってマウス envenomated は呼吸麻痺5のためすぐに死にます。
トランスクリプトームおよびプロテオーム研究は、いくつかのかめむし類の毒のタンパク質組成を明らかにしました。捕食性の種の毒は、プロテアーゼ他酵素とペプチド及びタンパク質の未知構造と機能6,7、8に富んでいます。バグ キス毒は、血液凝固、血小板凝集や血管収縮2,9メンバーに深く影響を与える triabin タンパク質ファミリーが豊富です。ただし、どの毒素の根底にある毒のほとんどの生物活性は知られていません。たとえば、キス バグブラジルサシガメ ジャガイモの毒は、鎮痛剤、ナトリウム チャンネル10を阻害すると報告されているが、解明する責任のコンポーネントが残っています。同様に、どのコンポーネントのサシガメ毒麻痺や痛みの原因は知られていません。特定毒生物活性と構造と、新しい毒の毒素の機能を特徴づける担当の毒素を識別するための前提条件は、毒を得ています。
電気5,6,7,8,11,12,13守備の挑発が毒を heteropterans から入手します。応答4,8、機械的に圧迫、胸郭12,14,15,16毒液腺8,17 を解剖 ,18,19,20,21,22、および23ムスカリン性アセチルコリン受容体のアゴニストのアプリケーション。2 つの独立したルーメン、前方メイン腺 (AMG) と後部主な腺 (PMG) 主な腺から成っているかめむし類の毒腺の形態は複雑に潜在的な長所と短所の任意のメソッドを判断として付属腺 (AG) を関連付けられています。これらの異なる腺コンパートメント獲物の捕獲や防衛、口腔外消化8,17を含むさまざまな生物学的機能特化する可能性があります異なるタンパク質の分泌物を生成します。Peiratine と ectrichodiine の暗殺者バグで AMG は獲物の捕獲および口腔外消化17PMG に関連付けられています。しかし、harpactorine の AMG8防御毒を分泌する仮説があるに対し、 Pristhesancus plagipennis PMG のバグは獲物の捕獲や消化を特化されています。AG は、サシガメ8小さな分泌機能を持つ、巨大な水のバグ23プロテアーゼ ストレージの主要なサイトに記載されています。明らかに、さらに作業は様々 なカメムシ サブグループ間で各腺区画の機能を明らかにする最も毒の毒素の機能を決定する必要があります。本報告ではこの目標に向かって heteropterans から毒の毒素を収穫するためのプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>Electostimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>S48 Square Pulse Stimulator</td><td>パルス電気刺激を可能にする電気刺激装置</td></tr><tr><td>フェザーライトピンセット</td><td>オーストラリアの昆虫学用品</td><td>E122B</td><td>生きた毒のある昆虫を扱うため</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td><td>4693124001</td><td>毒の自己タンパク質分解を防ぐため</td></tr><tr><td>解剖機器</td><td>オーストラリア昆虫学用品</td><td>E152Micro</td><td>細かい解剖用</td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>オーストラリアの昆虫学用品</td><td>E162</td><td>細かい解剖用</td></tr></tbody></table>

暗殺者のバグやその他のカメムシの昆虫から毒の毒素を収穫

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

かめむし類昆虫サシガメ (サシガメ科) や巨大な水のバグ (タガメ) などの捕食性と毒の先祖から子孫し、現存する heteropterans の大半は、この栄養戦略を保持します。いくつかの heteropterans は、脊椎動物の血を主食に移行した (キスのバグ、クロタマゴバチ; などとベッドのバグ、Cimicidae) 餌植物 (ほとんどの Pentatomomorpha) に戻っている他の中。ただし、唾液キスのバグが吸血、少し容易にするために使用を除いてかめむし類の毒クモ、サソリやヘビの毒に比べてについて知られています。
かめむし類の毒の毒素の解析への 1 つの障害は、構造と両方は形態学的に複雑な複数の生物学的役割 (防衛、獲物のキャプチャ、および口腔外消化) を実行毒/口唇腺の機能です。この記事ではカメムシ毒を収集するを用いて正常に 3 つの方法をについて説明します。まず、便利な方法は頻繁に注入されるときに致命的な毒を収集する捕食動物、腺組織で汚染がなくなると電気刺激を示します。第二に、動物の穏やかな嫌がらせが毒テングや heteropterans のいくつかのグループで吐く毒から押し出しを生成するのに十分であることを示します。第三に、我々 は毒液腺を取得する麻酔動物の解剖によって毒の毒素を収穫する方法を説明します。この方法は他の方法を補完するものではなく電気刺激と嫌がらせが効果的なイチイから毒素の収穫を可能性があります。これらのプロトコルは、研究者かめむし類の構造機能解析と応用医学と農業の昆虫から毒素を収穫する有効になります。

P. plagipennis harpactorine と reduviine Platymeris ラダマンテュスなどのいくつかのかめむし類種は確実に電気刺激 (表 1) への応答では毒の大量 (5-20 μ L) をもたらします。一般に、ほとんどの peiratine、reduviine、および harpactorine のバグは、このメソッドへの応答で毒を生成します。Stenopodaine バグの間では、電気刺激はOncocephalus sp. Thodelmus sp ないから毒を誘発しました。サンプリング holoptiline および分類のバグには、電気刺激への応答の重要な毒 (例えば十分な質量分析法による解析) が出なかった。Belostomatid バグや略奪ハモグリムシから毒を収穫する電気刺激を使用もできます。しかし、サソリ (タイコウチ) の電気刺激は毒テングからではなく頭部腺のみの内容のリリースを誘発しました。いくつかの種の...

ただし、異翅亜目の多くの昆虫 (昆虫綱: 半翅目) は毒、毒組成とその毒の毒素の機能はほとんど知られてないです。このプロトコルでは、さらに特性評価、電気刺激、嫌がらせや腺の解剖を使用してのかめむし類の毒を収穫する方法について説明します。

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

アサシンバグは、毒を使用して獲物を麻痺させ、事前に消化する昆虫のグループです。しかし、動物の毒は新薬、殺虫剤、科学ツールとして注目されているにもかかわらず、それらが生成する毒素はほとんど完全に特徴付けられていません。この理由の1つは、アサシンバグがクモやサソリなどの象徴的な毒節足動物に比べてあまり知られていないことです。もう一つの理由は、最近まで、彼らの毒素を収穫する方法についての情報がほとんど入手できなかったことです。このビデオでは、研究者が暗殺虫や、巨大な魚を殺す水虫などの関連昆虫から毒毒素をうまく収穫できるようにする方法を紹介します。プロトコル1は、電気刺激によって毒を収穫する方法を説明しています。まず、適切な昆虫を集めます。大人と大きなニンフは、一緒に働くのが最も簡単です。昆虫が毒液を蓄積しているが飢えないようにするために、給餌後2〜7日で虫を使用するのが理想的です。先端に電極が付いた鉗子を一対用意し、電源に接続します。理想的には、この電源は、5ヘルツで5ミリ秒のパルスを送達できる電気刺激装置であるべきです。小さなバグまたは大きなバグには、それぞれ15ボルトから25ボルトのピーク電圧を使用します。電気刺激装置が利用できない場合は、5〜12ボルトの定電圧を使用してください。輪ゴムと発泡スチロールプラットフォームを使用して昆虫を拘束します。昆虫の吻を収集チューブに入れます。P200ピペットチューブは、ほとんどの暗殺虫に最適です。オプションで、収穫前に少量の水を先端に追加して、毒を最大限に回収することができます。電極に導電性ゲルを塗布し、電源を入れ、帯電ピンセットを昆虫に塗布します。吻からの毒の排出を監視しながら、さまざまな接触点で実験します。毒液は、自己タンパク質分解による消化を避けるために、氷点下で保存してください。毒がなくなるまで、新しいピペットチューブで電気刺激を繰り返します。プロトコル2は、防御反応を引き起こすことによって毒を収穫する方法を説明しています。上記のようにバグを準備して抑制し、テングを収集チップに挿入します。動物を傷つけることなく、防御反応を引き起こすためにバグに優しく嫌がらせをします。場合によっては、単に動物を拘束したり、テングを収集チューブに挿入したりすると、テングからの毒の排出を伴う防御反応を引き起こす可能性があります。そうでない場合は、動物の胸部、脚、腹部、特に触角にそっと触れて、毒を引き出します。プロトコル3では、この記事の書面による形式で、防御的に毒を吐く種から毒を収穫する方法も説明しています。プロトコル4は、解剖によって毒腺から直接毒を採取する方法を説明しています。二酸化炭素に10分間さらして動物に麻酔をかけます。後腹部に3本のピンを挿入して、毒腺に穴を開けずに昆虫を押さえます。腹部の腹面に小さなメスを使用して短い正中線切開を切ります。ミニチュアハサミを使用して、正中線を前方に頭まで伸ばし、外骨格のみを切断し、内部構造を傷つけないように注意します。内部構造を露出させるには、正中線切開部から昆虫の側面まで伸びる複数の横方向の切り込みを入れます。その後、2つの切り傷の間にある腹側外骨格をピンで留めて、内部構造を露出させることができます。バグが水没するまで生理食塩水を使用して解剖トレイを浸水させ、内部構造が浮き上がり、より簡単に視覚化できるようにします。毒腺は、消化管の両側に伸びる半透明の細長い構造として現れます。ピンセットとマイクロハサミを使用して、消化管や毒腺を破らないようにしながら、結合組織と神経組織と気管を慎重に取り除きます。主腺は、前葉と後葉、およびヒルスで合流する2つの管を備えたその特徴的な構造により認識できます。暗殺虫、そしておそらく他のヘテロプテランにとって、ほとんどすべての毒素は主腺の2つの葉の内腔に蓄えられています。したがって、主腺を気管と結合組織から解放した後、肺門から通じる2つの管を切断し、主毒腺を収集することができます。副腺も必要な場合、通常は腸と密接に対立しており、ヒルスから管をトレースすることで明確に識別できます。いずれにせよ、腺を時期尚早に壊して毒を周囲の生理食塩水に失わないように注意してください。主腺の葉を分離する場合は、生理食塩水から取り出した後すぐにこれを行い、書かれた原稿のステップ4.6および4.7で説明されているように、すぐに腺内腔の内容物の採取に進みます。結果は、使用する昆虫の正確なサブプロトコルと種によって異なります。このビデオで紹介されている第1と第2のサブプロトコルは、それぞれ電気刺激とハラスメントによって毒毒素を採取する方法を示しました。これらの方法の両方で、通常、約50〜250ミリグラム/ミルのタンパク質と、酵素、細孔形成毒素、ペプチドなどの100を超えるタンパク質ベースの成分を含む濃縮液体が得られます。これらのプロトコルの両方の主な利点は、迅速で非致死的であり、毒が腺組織によって汚染されていないことです。電気刺激またはハラスメントによる採取の最大の欠点は、得られた毒の腺源が不明であり、採取された毒のタンパク質含有量がプロトコルによって異なる可能性があることです。また、電気刺激と嫌がらせは、異翅目のすべての捕食種に効果的ではありません。前回のサブプロトコールでは、充血した毒腺を解剖して毒素を直接採取する方法を示しました。この手法では、さまざまなタンパク質のカクテルも得られますが、この場合、毒毒素は腺組織にある程度の汚染を示す可能性があります。しかし、解剖された腺から毒素を採取する利点は、起源の腺区画が正確に知られていることです。結論として、研究者が自分の研究課題に適した収穫方法を選択することを奨励します。例えば、種内での毒物使用の生物学に関する調査には、複数の採取技術を採用することで利益を得ることができます。バイオプロスペクティング研究では、特定の実験デザインによっては、複数の種から毒を採取する単一の方法の方が経済的かもしれません。このビデオとそれに付随する論文が、研究者がアサシンバグやその他のヘテロプテラ昆虫から毒を採取するのを容易にすることを願っています。これは、その組成、生物活性、進化を理解するための前提条件です。

harvesting-venom-toxins-from-assassin-bugs-other-heteropteran

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学ぼう、アサシンバグなどのカメムシ類から電気刺激やハラスメントを用いて毒液を採取する方法。これらの技術は、神経科学や毒学研究において未解明のタンパク質毒素の特性解析と新規医薬応用の基盤を提供する。

暗殺者のバグやその他のカメムシの昆虫から毒の毒素を収穫

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