Name: バイオインスパイアード法を用いた機能性シリカの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶバイオインスパイアード法による機能性シリカの作製と酵素のインプランテーション。迅速で環境に優しいこの手法は、材料特性のカスタマイズを可能にし、生体分子の封入効率を向上させます。

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1. 前駆体 (および省略可能な封止ソリューション) の準備
<ol><li>180 mL のプラスチックの容器にケイ酸ナトリウム五水和物 (318.2 mg) の 1.5 ミリ モルを測定し、20 mL の脱イオン水に溶解します。</li>
	<li>同様に、2 番目のコンテナーでペンタエチレング ヘキサメチレンテトラミン (PEHA、58.1 mg) の 0.25 モルを測定し、20 mL の脱イオン水に溶解します。<ol>
<li>代替アミン含有化合物、例えばdiethylenetriamine (データ) または triethylenetetraamine (TETA) を使用する場合は、合計 Si:N のモル比は、1 (すなわちデータの 0.5 モルまたはの TETA の 0.375 モルに対応するのには一定を確認します。記述されていたプロシージャ)15。</li>
		<li>高分子アミン添加物例えばポリエチレンイミン (PEI) または poly(allylamine hydrochloride) (PAH) を使用する場合は、濃度 1 mg/mL (最終反応体積)15を維持します。 注意: は、腐食性または毒性 (特に蒸気) として彼らの純粋な形で、ヒューム フード内でのみこれらのアミンを処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>合成時にその場でカプセル化を実行する蛋白質量があらかじめ決められた解散 (ここ 50 mg、BSA のウシ血清アルブミン) 5 mL の脱イオン水に。ケイ酸ナトリウム五水和物の溶解に使用する純水の量から水のこの量を減算します。<ol>
<li>脱イオン水で混合、その構造を変更することがなくタンパク質分解を容易にするため、容器のふたを 4 ° C で保存攪拌せずできれば解散の進捗状況を時折チェックしてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. シリカ合成
<ol><li>ケイ酸ナトリウム五水和物の時に PEHA が 180 mL コンテナーの 1 つのソリューションを組み合わせて、最終を作成する十分な脱イオン水を追加ソリューション ボリューム 41 mL (または 46その場でカプセル化を省略した場合)。</li>
	<li>ケイ酸ナトリウムと均一な混合を提供する攪拌バーの追加、スターラー プレート上に PEHA ソリューションの新たに準備された混合物を配置します。</li>
	<li>この容器に pH プローブを中断し、初期の pH を記録します。<ol>
<li>この段階では、必要に応じて、8.1 の手順に記載されているモリブデン ブルー吸光光度法を用いた初期 [Si] 濃度の後で決定するため開始の混合物の 750 μ 因数を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>図 1から計算された 1 M HCl のあらかじめ決められた数量を追加することで合成を開始し、濁度の即時の進化を観察 (図 2参照)</li>
	<li>酸の添加が終わると、すぐに追加封止ソリューション (もしあれば) 可能な限り迅速に。 注: これらの量の与えられる最終的な容積は 50 mL の全反応混合物、30 mM の Si と N 濃度につながるのです。これは、ことができますに応じて一定額で上記のすべての量を乗算することによって。</li>
	<li>反応完了を決定する 5 分後に pH を記録します。pH が 7 ± 0.05 であることを確認します。</li>
</ol>3 材料の酸溶出
<ol><li>さらに酸の付加によって (かとして製 coagulum として、シリカの前合成サンプルを再) 完成に達している反応後生成シリカの組成を変更します。</li>
	<li>シリカを再する場合 180 mL プラスチック容器に脱イオン水 100 mL で約 150 mg として用意してのバイオインスパイアード シリカをミックスし、攪拌プレートの上に置きます。</li>
	<li>懸濁液を十分に混合後は、容器内の pH プローブを中断します。</li>
	<li>(7-2 間) 目的の pH に達するまでさらに塩酸滴定し、ca. の安定化することができます 1 分。</li>
	<li>さらに 5 分を待つシステム完全に平衡が、分離固体シリカに進みますように。</li>
</ol>4. シリカ分離・乾燥
<ol><li>バイオインスパイアード シリカ懸濁液を 50 mL の遠沈管にデカントします。</li>
	<li>15 分間 5,000 g の懸濁液を遠心します。</li>
	<li>遠心分離とさらに詳しい分析 (例えばブラッドフォードの試金、次に見なさい) ストア後上澄みを削除します。脱イオン水で遠沈管を補充し、再渦のミキサーを使用してシリカを中断します。</li>
	<li>遠心分離、培養上清中のストレージ、および再懸濁液を 2 回繰り返します。</li>
	<li>最終的なの遠心分離後、上清を除去し、セラミックるつぼにシリカをこすり。</li>
	<li>一晩 85 ° C のオーブンで乾燥<ol>
<li>カプセル化が行われると、タンパク質の変性を避けるために凍結乾燥設備または真空下でオーブンを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. モリブデンの生産が [Si] 定量試薬 (MBR) を青
<ol><li>プラスチック製の 1 リットルのメスフラスコに発煙食器棚に 8 モル (10 g) アンモニウム モリブデン酸四水和物を追加します。</li>
	<li>攪拌で 500 mL の脱イオン水に溶解します。</li>
	<li>慎重に 10 M HCl 溶液 60 mL を追加してソリューションを酸性化します。</li>
	<li>1 l 最終的な音量を調整します。</li>
</ol>6. パラアミノフェノール硫酸還元剤 (RA) [Si] を決定するための生産
<ol><li>シリカフューム戸棚にスターラー プレート上の周囲温度で水のお風呂に 500 mL ガラス メスフラスコを配置します。</li>
	<li>パラアミノフェノール硫酸や亜硫酸ナトリウムの 16 ミリ モル (2 g) の無水シュウ酸の 111 モル (10 g)、19.5 ミリ モル (3.35 g) を加え、250 mL の水に溶かします。</li>
	<li>丁寧にゆっくりと攪拌しながら飽和硫酸酸性の 92 g (50 mL) を追加し、冷却ソリューションを待ちます。</li>
	<li>最後に、脱イオン水で 500 mL に希釈します。</li>
</ol>7. ケイモリブデン酸分析過程におけるケイ酸の種
<ol><li>5 mL のプラスチック瓶で MBR の 300 μ L 希釈はステップ 5.4 3 ml の脱イオン水で生産。</li>
	<li>無水ケイ酸のテスト ソリューションとミックスに振るの 10 μ L を追加します。 注: このソリューションは、黄色ゆっくりとなります。</li>
	<li>丁度 15 分後その青い異性体に複雑な黄色のトリメチルシリレーションを減らすためにセクション 6 から調製した還元剤の 1.6 mL を追加します。</li>
	<li>開発に少なくとも 2、24 h 以内に青の色を許可します。</li>
	<li>810 でサンプルの吸光度を測定 nm 紫外可視分光光度計の較正曲線に対して [Si] を計算します。</li>
</ol>8. シリコ モリブデン酸アッセイ高分子シリカ種
<ol><li>微量遠心チューブにモリブデン ブルー法を用いたポリケイ酸塩種の濃度を測定するには、750 μ L シリカ懸濁液と 750 μ L 2 M 水酸化ナトリウム溶液を組み合わせます。</li>
	<li>シールと遠心の浮動小数点の場所です。<ol>
<li>管内圧力の蓄積のための破裂を防ぐために残っている十分なヘッド スペースを確認します。 注: 500 μ L のヘッド スペースは、通常これを回避するための十分なです。また、手順が蒸発液体の損失が考慮する限りをオープン バイアルに実施することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>80 ° C に加熱水浴中のマイクロ遠心チューブ用のフロートし、1 h の溶解しておきます。</li>
	<li>1 時間が経過すると、マイクロ遠心チューブ用を外し、外の乾燥を拭いてください。</li>
	<li>いったん冷却、[Si] は 7.5 7.2 の手順で説明したように上記のように決定できます。</li>
</ol>9 シリカの蛋白質の集中の決定のためのブラッドフォードの試金プロシージャ
<ol><li>各割り当てられたキュベットに所定量 (室温) ブラッドフォード試薬とサンプルを挿入 (特定のボリュームの表 1と表 2を参照)。試薬の性質上、ボリューム変化を回避し、3 通の各ポイントを繰り返してすべてのキュヴェットのため使い捨てのピペット チップを使用します。</li>
	<li>3 回の反転でそれぞれキュベットをミックスし、10 分のための開発に任せます。</li>
	<li>595 で吸光度を測定空白として純粋培養上清を用いた nm。</li>
	<li>各測定値からコントロールのサンプル (両方のアッセイのキュベット 0 番) の吸光度を差し引くことによって各キュベットの元吸光度を計算します。</li>
	<li>較正曲線 (図 3) を使用して未知のサンプルの蛋白質の集中を計算します。元のサンプルの希釈の場合希釈倍率を考慮する必要があります。<ol>
<li>アッセイの感度に影響を与える可能性がありますランダムな変動を避けるために BSA の濃度に対してプロット測定した吸光度によって実験の各セットのための校正曲線を作成します。</li>
		<li>この蛋白質の試金は蛋白質の任意の型を定量化する標準として BSA を使用になっているが、精度向上のための興味のそれぞれの特定の蛋白質のための校正曲線を作成します。</li>
		<li>未知のサンプルのタンパク質含有量校正曲線の対象の範囲よりも高くなる場合は、必要に応じて希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>可能な蛋白質の損失を監視する再懸濁液中に各サンプルの蛋白質内容を決定します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競争の経済的利害関係を宣言しません。

現在の仕事、急速にそこにバイオインスパイアード シリカ材料と生体分子のカプセル化の沈殿のため手法を提案します。我々 は、追加する反応を開始する酸と生体分子の封止材の添加のタイミングの量すなわちプロシージャ内で重要な手順を示します。反応の進行と収量の両方に酸添加量の効果を示す (図 4および図 5、それぞれ)、合成条件、この感度にもかかわらず一貫性を可能にする制御を厳しく法を実証。活性種のカプセル化に関するがプロシージャの面で簡単ですカプセル化が表示されます (さらに、さらに、環境条件の pH の順序)、実験の条件に敏感であるためただし、材料の一貫性プロパティは達成可能なもう一度です。
15形態と気孔率の範囲を提供する多くの他の場所で公開されている、別の添加物を使用して合成条件を変更できます。さらに、ポスト合成テクニックを変更し、バイオインスパイアード シリカ材料を化学的に調整は、穏やかな浄化13やアミンの装飾など報告されています。20最後に、合成の穏やかな、水溶液の性質のためその場でカプセル化より、ここで示します酵素17,18から21全細胞に至るまで幅広い基板金属塩、22医薬品原、23と量子ドット。24
(材料の MCM 41 または SBA 15 家族) など他の有機性シリカの合成とは異なり添加物を作り出すことができない生の多官能性性質を命じた細孔構造も高い単分散粒子径分布Stöber 型シリカの特性。25これは生 (特別な場合) 外添加物26の明確に定義されたミセル形成挙動の不足とつながれる増加触媒活性単アミン含有添加剤を。26
その一方で、この多官能性添加物の性質は、短い反応時間と穏やかな温度と圧力の他の有機性シリカの合成と比較して使用できます。これも可能性につながる、室温添加溶出前述のように、まだこれらシリカの他の家族具体的のため、表面の化学反応を達成する必要があります。27,28,29その結果、バイオインスパイアード シリカ材料示されている両方より経済的で簡単に実用化と開発につながる大規模で生産する実用的。14
要約すると、バイオインスパイアード シリカ合成活性種をサポートまたはガス吸着メディアを製造する急速な安易な方法を表します。PH と反応後のタイトなコントロールを介してシリカ アミン複合材料の広い配列合成できるさまざまなプロパティを持つその場でカプセル化の異なる配列の有機の可能性をさらに引き立てています。無機、またはバイオ有機材料。添加材料と封止材濃度の独立後合成修正はまだ達成するのに、これらのメソッドは環境調和型の化学プロセスに向けた確実な一歩を表します。

工業用触媒の構造サポートとしてシリカの使用は確立され、改良された触媒活性、安定性、加工性、可能性のある運用のコストを減らし1を可能にします。これらの利点は酵素固定化の場合合成シリカ細孔システム内のストレージは無料対応で酵素寿命に大きなメリットを授けることができます。したがって、シリカ種を酵素をアタッチする珪質固体支持固定化のさまざまな方法を使用して調査を比較する複数のレビューにする最善の方法を見つけることに多くの努力が注がれてきました。2,3,4
酵素は通常、物理吸着または多孔質材料内でカプセル化に加えて、共有結合を介して接続されています。5は、それぞれの方法に関連する重要な欠点: シリカと生体分子は、受け入れにつながる反応条件によって弱体化することができます非常に簡単に一時的な表面の相互作用に依存している物理吸着酵素の溶出。通常多くの強力な共有結合の活性種の減少の立体配座自由のため低活性の結果します。カプセル化は、酵素の到達不能または拡散の制限による削減活動で起因できます。6
穏やかな (多くの場合と呼ばれる ' 生') シリカ合成の分野の最近の進歩は、材料の合成の際に生体分子と他の活性種の場でカプセルを確立しています。7,8,9このメソッドは従来固定の欠点の多くを否定 - 周辺孔窩洞の形態として弱い noncovalent 相互作用の使用によって吸着のアプローチとは異なり、生体分子の立体配座の自由を維持生体分子、溶出はまだできません。確かに、カプセル化タンパク質とも全体の細胞、10の範囲で動作するように実証されている、過酷なプロセスにより非アクティブ化などバイオインスパイアード シリカの効果でカプセル化を通じて条件を避けることができます。7,11
記載方法の目標は、バイオインスパイアード有機添加剤を使用して、ポーラスシリカ周囲条件下での制御可能なプロパティを持つを準備することです。メソッドは、カプセル化の選択を示さなければならない無機または有機分子を含むように簡単に変更できます。さらに有機酸の溶出テンプレートを削除することによって必要なバルク特性と浄化を達成するために、合成材料を変更する簡便な合成法を示します。
このメソッドはかなりより速くより穏やかを有効にするテンプレートの多孔質シリカ サポート (例えば、シリカ材料 MCM 41 や SBA 15 のような超分子界面活性剤アセンブリを介して)12の伝統的な合成と比較してください。合わせて、多数の固定の手順と骨の折れる浄化を必要とせずその場でカプセル化します。さらに、焼成ではなく、酸溶出の使用は、有機表面機能化の可能性を開きます。
このメソッドは、高い吸着を発見した活性種の固定化や効果を発揮する共有結合固定化でこれらの作業に適用されます。また、それらの生合成は、従来のテンプレート化されたシリカ材料と比較して工業化の地の利が、プロセスのスケール アップの研究の役に立つです。13,14フォトニクス材料の構造として、材料など孔の配列を必要とするアプリケーションのためこのメソッドお勧めしませんが不規則で一括プロパティの任意の類似性にもかかわらず。

<table><tbody><tr><td>シリカ合成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケイ酸ナトリウム五水和物</td><td>フィッシャー科学</td><td>10070470</td><td></td></tr><tr><td>ペンタエチレンヘキサミン(PEHA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>292753</td><td></td></tr><tr><td>ジエチレントリアミン(DETA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D93856</td><td>有毒</td></tr><tr><td>トリエチレンテトラアミン(TETA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>90460</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレンイミン) (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>6088</td><td>1.2K MW</td></tr><tr><td>ポリ(アリルアミン塩酸塩) (PAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>283215</td><td>17.5k MW</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl) 1M</td><td>Fisher Scientific</td><td>10487830</td><td></td></tr><tr><td>シリコモリブディ酸アッセイ</強力な>モ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リブデン酸アンモニウム四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302</td><td>M1019に置き換えられた製品</td></tr><tr><td>塩酸(HCl) 37.0%wt</td><td>Fluka Analytical</td><td>84436</td><td></td></tr><tr><td>無水シュウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75688</td><td></td></tr><tr><td>パラアミノフェノール硫酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10446880</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム亜硫酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10234400</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autotitrator Titrando 902</td><td>Metrohm</td><td>2.902.0010</td><td></td></tr><tr><td>801マグネチックスターラープレート</td><td>メトローム</td><td>2.801.0040 801.0040</td><td></td></tr>以上で使用するため ド<tr><td>ジーノ</td><td>メトローム</td><td>2.800.0010</td><td>アクア</td></tr><tr><td>トロードプラス</td>上記で使用するため <td>メトローム</td><td>6.0253.100</td><td>上記で使用するため</td></tr><tr><td>遠心分離機 Sorvall ST16</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>11814243</td><td>コードはフィッシャーサイエンティフィックUV-Vis用です</td></tr><tr><td>分光光度計 Genesys 10A</td><td>Thermo scientific</td><td>12104972</td><td>Code is for Fisher scientific</td></tr></tbody></table>

バイオインスパイアード法を用いた機能性シリカの作製

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

ここ記載されているプロトコルの目的は、バイオインスパイアード シリカ材料を合成し、そこに酵素カプセル化を実行、部分的または完全に酸の溶出によって同じを浄化です。添加物多官能性材料とケイ酸ナトリウムを組み合わせて、シリカは中和に周囲条件下で急速に形成されます。
シリカ収量に及ぼす中性化速度と生体分子の付加ポイントを調べた、付加ポイントを変えるための生体分子固定化効率を報告します。他の多孔質シリカの合成方法と対照をなしてバイオインスパイアード シリカ合成に必要な温和な条件が完全に繊細な生体分子のカプセル化と互換性があることを示します。また、温和な条件はベア材とアクティブ サポート媒体の両方としてバイオインスパイアード シリカ スケール アップと商品化のための有望なターゲットを作るすべての合成および変更手順の間で使用されます。
合成を示すことと、条件、すなわち中和率、最終的な合成の ph 値、高感度で再現性の高いにつながる自動滴定方法を使用してこれらのパラメーター制御を実証するただしタイト反応の進行経路と収量。
したがって、バイオインスパイアード シリカは将来のアプリケーションに多くの紹介、それらに限定されない、現在のアプリケーションと効力への汎用性を示す、優れたアクティブ材料サポート選択です。

上記で説明したテクニックは、一貫性と再現性をもってシリカを沈殿させることができます。これは湿式シリカ (図 2) の厚い coagulum に自発的に解決する動揺の停止時を反応容器内の濁度の急激な発症を決定する最も簡単です。反応の程度、それゆえ収量分離後この coagulum の質量を測定することによって確認することができます、通常 58 ± 6.5% (図 4黄色)。
反応の進行にさらなる洞察力に反応しているそれらの種と同様、未反応単量体ケイ酸塩種の量を検出するモリブデン ブルー分光法の適応によって生成される polysilicates または「オリゴマー」を形成、凝固するのに十分な大きさに到達する管理していない (図 4赤、青それぞれ)。
この特定のシリカ スペシエーション データ、特に関心の異なる滴定沈殿物の反作用の効率を比較するとき - する過程におけるケイ酸の重合に影響を与える最終的な反応 pH とこの速度に達するとどのように、「オリゴマー」と固体シリカその後凝固。若干ステージ 2.4 で追加酸の量を変更するの下で- またはオーバー-titration 反応混合物のすることができます (図 5) を実行します。これらの 2 つのケースのために再度シリカ種分化を測定することによって明確な違いは滴定反応 (図 5) 略歴にマイナー チェンジだけにもかかわらず反応の完了 (図 4) で見ることができます。
(29-33% の間残りの) 3 つの反応例の単量体の種の消費量の違いがない各場合で沈殿するオリゴマー シリカ種の量に明確な違いがあります。これは pH、長く成長する個々 の粒子を可能にするため効率的な凝固を行い高いを開催、ゾル-ゲル法シリカ -「アンダー」の場合の伝統的な理論と一致しています。急速な滴定による凝固がはるかに速く誘導 'シュート' の場合、それ故にシリカ種の少ないは凝固し、コロイド相に閉じ込められたまま十分な大きさに成長しています。16
シリカ形成滴定の重要性を考えると、適切な滴定ボリュームの先験的知識は不可欠です。アミン添加剤と血液凝固のシリカ表面酸性度、信頼性の高い実証システムの内容、濃度関係の変化の複雑なプロトン現象による反応の化学量論から抽出できませんが、価のボリュームが容易に (図 1) を生成します。
凝固が完了すると、材料表面容易に変更できます酸溶出を使用して、他の著者によって最近報告されています。13この組成、気孔率、(図 6 a と b) 添加物の化学活性など材料の特性を微調整できます。
この研究では、BSA は模範封止材酵素として使用された、複数酵素17,18ただし、ここで説明する方法を使用できます。タンパク質検出のプロシージャはブラッドフォードの試金のプロトコル、19各遠心サイクルから保存されている培養上清を使用しています。上清中のタンパク質の量は、ゼロのたんぱく (コントロールのサンプル) サンプルの上澄みに溶解した BSA の知られていた量から作成された較正曲線を使用して計算されます。シリカにカプセル化の蛋白質の量は、追加の蛋白質の初期量から上清中に検出された蛋白質の減算で計算されます。アッセイに必要な唯一の試薬は、ブラッドフォード試薬 (調達または標準的なレシピに従って作られた)。
サンプル ボリューム、検出される蛋白質の予想量と測定メソッドに応じて、アッセイ形式の 3 種類があります。ここで、続いて形式は分光光度計が指定されて、マクロとマイクロ サイズの使い捨てのキュベットを必要とし、タンパク質 1.4 mg/mL に 10 μ G/ml から検出することができます。
図 7に (手順 4.3) 各洗浄後検出される蛋白質の量は (これは 50 mg) 最初の蛋白質量の % として表示されます。約 BSA の ~ 50% は ~ 50% 固定効率に関連する最初の遠心分離後上澄みで検出されました。BSA は検出されなかった次の洗浄では、BSA (または他の酵素) がしっかりとない浸出 - シリカ合成中にカプセルがあった、これはこのメソッドの重要な利点です。生成されるシリカの BSA の存在を確認するためにフーリエ変換赤外分光法 (FTIR) 分析を行った。アミドの特徴的なバンドの存在 I および II 1650/cm (図 8) サンプルと 1,500/cm のエリアの BSA の存在下で準備が、コントロールのサンプル (BSA なし) が固体の BSA の存在を確認されていません。
(BSA 反応混合物の中和時に追加) 上記酵素添加法、に加えて他の可能なバリエーションなど、BSA 添加ケイ酸塩、添加剤溶液、中和前に混練時があります。または酵素に混合や中和前にケイ酸塩や添加剤のソリューションに追加します。これらの可能性のいくつかをさらに検討した、固定効率 (ブラッドフォードの試金に基づく酵素反応システムにより計算に追加の割合として固定化した BSA の質量) と最終的なシリカの BSA の量測定 (シリカの生成、複合総量の割合として BSA 濃度を図 9参照)。BSA は、未反応試薬 (図9 A ~ C の場合) に追加されたときがなかったこと固定効率や結果として得られる複合材料における BSA の量にかなりの相違が明らかになった。ただし、BSA はシリカ形成 (ケース D図 9に) の間に追加されると、固定効率と最終製品の BSA の量ともに有意に低かった。これらの違いにもかかわらず生産シリカの平均額 (85-90 mg) の間変わらずに残った。これらの観察は、BSA、ケイ酸塩/シリカと添加物のイオン化 (または等電点) に基づいて説明できます。酵素やシリカ前駆体の相互作用を可能にする追加のさまざまな方法。酵素の変更の追加の時に pH としてそれぞれの種のイオン化は順番固定効率を制御する分子間の相互作用を決定します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キュベットなし</td>
			<td>BSA (mg/mL) の濃度</td>
			<td>ブラッドフォード試薬 (mL)</td>
			<td>サンプル (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (コントロール)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>未知のサンプル (X)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: マクロのブラッドフォードの試金の設定と計算されたコンポーネント ボリューム。有効測定範囲 0.1-1.4mg/mL (1 複製のボリューム)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キュベットなし</td>
			<td>BSA (ug/mL) の濃度</td>
			<td>ブラッドフォード試薬 (mL)</td>
			<td>サンプル (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (コントロール)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>7.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>未知のサンプル (X)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:マイクロ ブラッドフォードの試金の設定と計算されたコンポーネント ボリューム。測定有効範囲 1-10 μ G/ml (1 複製ボリューム)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig1.jpg"> 図 1: 価データまたは時に PEHA が添加剤として使用して反応系のシリカ濃度に対してボリュームが必要です。シリカは、[N] を維持しながらさまざまな濃度で合成された: [Si] 1、2 つの異なる添加物化学物質の比。誤差は、平均約 1 つの標準偏差です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig2.jpg"> 図 2:ソリューション濁度を発揮し、最適な反応の指標である沈降シリカ coagulum 中 (a) と (b) 後攪拌、反応容器内の写真です。  
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig3.jpg"> 図 3: ブラッドフォード マクロ試金のための模範検。BSA の不在でバイオインスパイアード シリカ合成から上澄み混合手順 9.1 で説明した後、ブラッドフォード解析が行われる蛋白質の既知の量です。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig4.jpg"> 図 4: 異なる反応条件のシリカ種の最終重合状態。シリカを最適 (ベースライン) の条件を使用する合成と上または下滴定、その後相対シリカ濃度は単量体か二量体のケイ酸 (赤)、ポリケイ酸塩「オリゴマー」(青) を数値化し、、不安定な凝固シリカ (黄色)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig5.jpg"> 図 5:初期価量の関数としての反応システムを介して pH 進行。酸をすぐに投与後 ca。 38s 混合 8 以下に急速に低下する pH の原因します。その後、さらに酸の投与されている自動的に pH があった初期添加後 7.0 ± 0.05 300s ように。過剰滴定の場合は、初期投与量は 300 秒後に pH 6.65 に達し 7 下 pH をドロップするのに十分だったようには達成可能なこれはなかった。初期の HCl ボリューム追加「アンダー」'ベースライン、' と 'シュート' は 7.20 mL、7.05 6.90 それぞれ。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg"> 図 6:凝固シリカ材料の酸性化に代表的なプロパティ変更します。(添加剤濃度、pH に関しての変更 a) と (b) pH に関してシリカ多孔性の変化。マニングらから再現クリエイティブ ・ コモンズ ・ ライセンスの下で13 。 
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig7.jpg"> 図 7: バイオインスパイアード シリカ合成上清中に bsa。ブラッドフォードの試金は、そこから決定された (したがって、合成シリカから遮蔽) 相対的な量の残り、遠心分離後反応培養上清に実施されました。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig8.jpg"> 図 8: バイオインスパイアード シリカ カプセル化の活性種と FTIR 分析。スペクトルを示した: 黒線: バイオインスパイアード シリカ、灰色ライン: 純粋な BSA、ブルーライン: バイオインスパイアード シリカは BSA を搭載します。縦点線特性アミド バンド。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig9.jpg"> 図 9:固定効率と BSA 量シリカ複合体の作製時に PEHA 。BSA は、ケイ酸塩と混合する前に PEHA ソリューションで(A)を追加されました (B) PEHA、PEHA とケイ酸の混合後の PEHA とケイ酸塩のソリューション、および(D)の初期混合後(C)を混合する前にケイ酸溶液中・中和します。%Bsa を追加、シリカの BSA は質量によって最終的なシリカ複合体の BSA の % の濃度を意味しながら合計 BSA の比率で反応混合物からカプセル化として測定します。誤差は、平均約 1 つの標準偏差です。

ここでは、バイオインスパイアード シリカ材料を合成し、そこに酵素を固定化するためのプロトコルを提案する.シリカは、一定の速度で中和するケイ酸ナトリウムとアミン添加物' を組み合わせることによって合成されます。その場で酵素固定化またはカプセル化された添加物の合成後の酸の溶出によって材料特性と機能を変更できます。

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

この方法の主な利点は、速く、簡単で、環境に優しく、素材のカスタマイズが可能なことです。この方法は、生体模倣シリカがどのように形成されるか、生体分子の取り込み方法、および合成後の材料処理についての洞察を提供します。一般に、この方法に不慣れな人は、シリカの形成が速く、最適な結果を得るために特定の量の酸を迅速に添加する必要があるため、苦労します。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、それがどれほど穏やかで、条件が酵素と適合しているかに気づいたときでした。私たちは、この方法を使用して酵素の性能と安定性を高めることを考えました。酸中和ステップは最終的な材料特性にとって最も重要なため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。まず、318.2ミリグラムのケイ酸ナトリウム五水和物を180ミリリットルのプラスチック容器に秤量し、20ミリリットルの脱イオン水に溶解します。2番目の容器で、58.1ミリグラムのペンタエチレンヘキサミンまたはPEHAを計量し、20ミリリットルの脱イオン水に溶解します。ケイ酸ナトリウム五水和物の溶解に使用される脱イオン水の量からこの量の水を差し引きます。合成中にin situカプセル化を行うには、所定の質量のタンパク質を5ミリリットルの脱イオン水に溶解し、溶液を冷蔵庫に入れて完全に溶解します。溶解の進行状況を時々、できれば攪拌せずに確認してください。ケイ酸ナトリウム五水和物とPEHA溶液を容器の1つに組み合わせ、十分な脱イオン水を追加して、最終溶液容量を41.5ミリリットルにします。新しく調製した混合物を攪拌板の上に置き、攪拌子を追加して一貫した混合を提供します。次に、攪拌溶液にpHプローブを懸濁し、初期pHを記録します。あらかじめ決められた量の1モル塩酸を添加して合成を開始し、濁りの即時進行を観察します。最初の重要なステップは、シリカの形成を開始するための酸の迅速な添加です。pHをできるだけ早く7に下げる必要があります。カプセル化が行われている場合は、酸の添加が完了したらすぐにカプセル化溶液を追加します。次に、5分後にpHを記録して、反応の完了を判断します。反応が完了した後、混合物に塩酸をさらに添加して、製造されたシリカの組成を、所望のpHが2〜7に達するまで変更し、懸濁液を約1分間安定させます。これに続いて、生体模倣シリカ懸濁液を50ミリリットルの遠心分離管にデカントし、次いで懸濁液を5, 000gで15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、さらなる分析のために保管します。遠心分離チューブに脱イオン水を補充し、ボルテックスミキサーを使用してシリカを再懸濁します。生体分子の取り込みの場合、重要なステップは、さらに分析するために、生体模倣シリカ洗浄から上清を与えることです。遠心分離と再懸濁のステップを2回繰り返した後、上清を取り除き、シリカをセラミックるつぼにこすり落とします。シリカをオーブンで摂氏85度で一晩乾燥させます。5ミリリットルのプラスチックバイアルで、300マイクロリットルのモリブデンブルー試薬を3ミリリットルの脱イオン水で希釈します。次に、10マイクロリットルの塩酸試験液を加え、振って混ぜます。15分後、1.6ミリリットルの事前に調製したパラアミノフェノール硫酸塩還元剤を加えて、黄色のシリコモリブデン酸複合体を青色異性体に還元します。.これに続いて、UV-vis分光光度計で810ナノメートルでサンプル吸光度を測定し、検量線に対してシリコン濃度を計算します。使い捨てピペットチップを使用して、割り当てられた各キュベットにあらかじめ決められた量のBradford試薬とサンプルを追加します。各キュベットを3回反転させて混合し、10分間発育させます。次に、純粋な上清をブランクとして使用して595ナノメートルでの吸光度を測定します。各測定値からコントロールサンプルの吸光度を差し引いて、各キュベットの元の吸光度を計算します。次に、BSAの濃度に対して測定された吸光度をプロットすることにより、各実験セットの検量線を作成し、アッセイの感度に影響を与える可能性のあるランダムな変動を回避します。最後に、再懸濁中の各サンプルのタンパク質含有量を決定して、タンパク質損失の可能性を監視します。シリカ形成反応の収率は、通常、58プラスマイナス6.5%モリブデンブルー分光法は、未反応のモノマーケイ酸塩種、ならびにポリケイ酸塩またはオリゴマーを形成するために反応したが、凝固するのに十分なサイズに達することができなかった種の量を検出しました。凝固が完了すると、酸溶出を使用して材料の表面を容易に変更できるため、添加剤の組成、多孔性、化学活性などの材料特性を微調整できます。最初の遠心分離後に上清から約50%のBSAが検出され、これは50%の固定化効率に関連しています。以下の洗浄ではBSAが検出されなかったため、BSAは合成中に浸出することなく安全にカプセル化することができました。シリカのFTIRスペクトルは、BSAを含むサンプルでは特徴的なアミドバンドを示しましたが、コントロールサンプルでは見られませんでした。未反応の試薬にBSAを添加した場合、得られた複合材料中の固定化効率やBSAの量に大きな違いはありませんでした。シリカ形成時にBSAを添加すると、製品中のBSAの固定化効率と量が有意に低下しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば5分以内に完了できます。この手順を試みる際には、反応物の重量と量を正確に把握し、1回の投与で酸を迅速に追加することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、FTIR、SCM、ポロシメトリー、酵素アッセイなどの他の方法を実行して、生体分子の活性だけでなく、材料特性や形態に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生体模倣シリカ形成の分野の研究者が、生体分子のin situカプセル化能力を備えたシリカを迅速、簡単、制御可能、かつ環境に優しい方法で合成する方法を探求する道を開きました。このビデオを見れば、バイオインスパイアード法を用いたシリカの合成方法、生体分子のin situカプセル化方法、カプセル化効率の測定方法、添加剤の合成後溶出方法などについて十分に理解できるはずです。アミン、酸、生体分子の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、常にPPEやこぼれ防止などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Chemistry

化学

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