Name: 網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶラット網膜微小血管周皮細胞の免疫組織化学的可視化法。低温切片、ホールマウント、低張性血管分離の3手法を用いて、網膜微小血管の詳細な解析と周皮細胞の動態研究を支援します。

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デンマーク ルンドベック財団によって資金が供給された研究。

プロトコルは、最適化され、男性大人の白子のラットで示されます。すべての実験手順で動物は ARVO ステートメントで眼科と視覚に関する研究における動物の使用のための規則に従って扱われました。動物を二酸化炭素とそれに続く頚部転位によって安楽死させ。
1. ラット網膜のティッシュの準備
<ol><li>
低温セクション
	<ol>
<li>メスのラットの眼瞼の後部と前部 ~0.5 cm のスリットを作る。<ol>
<li>オプション: ジアテルミー バーナーを使用して、埋め込み中に一貫した方式で目をオリエンテーションと視神経を通って垂直クライオスタット切片では、内部の角度で目をマークします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>目を鉗子でつかんで慎重に周囲の組織を公開する側に傾けてください。結合と筋肉組織の解剖はさみでカットすることによって眼を摘出します。 注意: 目も強く引っ張らない視神経に過度の圧力は網膜剥離を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) メスの先端で光の圧力を適用することによって角膜の角膜輪部に最初の穴を作る前に安定させるために、4% のホルムアルデヒドで簡潔に目を入れ。</li>
		<li>顕微鏡、解剖ハサミ鉗子で 4% のホルムアルデヒドを PBS で 2-4 時間で水没する前にレンズを削除し角膜角膜の縁に沿ってカットします。</li>
		<li>デニスソレンセンの 10% ショ糖と 25% ショ糖リン酸バッファーに順番にすすぐ。</li>
		<li>鶏の卵の白身からブタ皮膚と 30% アルブミンから 3% のゼラチンで調製した Yazulla 培地に埋め込みます。 注: プロトコルを一時停止できるここ組織預かり-20 ° C で</li>
	</ol>
</li>
	<li>
全体マウント
	<ol>
<li>メスのラットの眼瞼の後部と前部 ~0.5 cm スリットを作る。</li>
		<li>目を鉗子でつかんで慎重に周囲の組織を公開する側に傾けてください。結合と筋肉組織の解剖はさみでカットすることによって眼を摘出します。 注意: 目も強く引っ張らない視神経に過度の圧力は網膜剥離を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>メスの先端で光の圧力を適用することによって角膜の角膜輪部に最初の穴を作る前に安定させるために PBS で 4% ホルムアルデヒドに簡単に目を置きます。</li>
		<li>顕微鏡、解剖ハサミ鉗子で角膜を外し、レンズを角膜の縁に沿ってカットします。</li>
		<li>主要なテアリングを回避する小さな開口部の動きを使用して鉗子に向かって視神経網膜色素上皮細胞から網膜を区切ります。</li>
		<li>解剖はさみで無料の視神経、網膜、視神経の頭に向かって網膜周辺部から数ミリメートルの長さの 4 つのスリットを作る。</li>
		<li>スライド ガラスに網膜を広がり、5-10 分間乾燥させます。</li>
		<li>網膜上にホルムアルデヒドを滴下して 20-30 分のための 4% のホルムアルデヒドを修正します。 注意: は、ガラスから切り離すことがありますそれと網膜に直接適用されません。</li>
		<li>PBS で洗い。最適な結果を得る、洗浄直後後の免疫染色。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
低張性の分離
	<ol>
<li>メスのラットの眼瞼の後部と前部 ~0.5 cm スリットを作る。</li>
		<li>目を鉗子でつかんで慎重に周囲の組織を公開する側に傾けてください。結合と筋肉組織の解剖はさみでカットすることによって眼を摘出します。 注意: 目も強く引っ張らない視神経に過度の圧力は網膜剥離を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>メスの先端で光の圧力を適用することによって角膜の角膜輪部に最初の穴を作る。</li>
		<li>顕微鏡、解剖ハサミ鉗子で角膜を外し、レンズを角膜の縁に沿ってカットします。</li>
		<li>主要なテアリングを回避する小さな開口部の動きを使用して鉗子で視神経の頭に向かって網膜色素上皮細胞から網膜を区切ります。</li>
		<li>解剖はさみで視神経網膜を無料、24 ウェル プレートの脱イオン水 1 mL に網膜を配置、200 rpm 室温で 1 時間 1.5 mm 振動軌道で振る。 注: 以下、網膜が表示されます小さいエッジで定義されています。</li>
		<li>網膜の血管から分離細胞の残骸を切り離して考えると、室温で 30 分間別振る 200 U DNAse 1 を追加します。 注: 破片は井戸の形成が開始可能性があります。</li>
		<li>最低でも 3 回神経細胞の残骸を削除する 150-300 rpm で振とうしながら 5 分間脱イオン水ですすいでください。網膜は神経細胞残屑の除去を示すそれぞれのリンスと透明になります。<ol>
<li>明らかに透けて見える孤立した網膜血管を見る 24 ウェル プレートに見て暗い背景を使用します。</li>
			<li>(省略可能): 血管系が表示されない場合神経層 (半透明) の無料この時点で追加するか、すすぎやすく、振動速度を増加または血管に液体を吸引、ピペットを使用します。 注意: 血管系に損傷を与える可能性がありますオプションの手順のいずれか。</li>
		</ol>
</li>
		<li>室温で PBS で 4% パラホルムアルデヒドと PBS で 3 回すすぎの 1 mL の 10 分を修正します。 注: プロトコルを一時停止できるここで 4 ° C で組織預かり</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 免疫組織化学
<ol><li>
低温セクションの染色
	<ol>
<li>視神経を通って垂直断面としてゼラチン埋め込まれた網膜の 10 μ m 低温セクションを切り取り、スライド ガラスと乾燥させます (最低 1 時間) に低温セクション。</li>
		<li>PBS で 0.25% のガラス スライドを水没トリトン X-100 (PBS-T) 15 分。</li>
		<li>PDGFRβ 1: 100、1: 500 の NG2 一次抗体 PBS T + 低温セクションに 1 %bsa で希釈した点滴し、4 ° C で培養室で一晩インキュベートします。</li>
		<li>15 分 PBS T に 2 回スライド ガラスが水没し、1: 100 抗マウス Alexa Fluor 594 リンクと 1: 100 反うさぎ FITC リンク二次抗体と低温セクションに 3% BSA PBS T で希釈したを滴下します。</li>
		<li>スライド ガラスの暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>PBS T 2 × 15 分のスライド ガラスを洗います。 注: オプション: ダブル、トリプル蛍光染色、連続染色可能 2, 3 回それぞれ 2.1.6 2.1.3 から手順を繰り返すことによって。</li>
		<li>取付中含む DAPI と観察フェージング染色の低温電子顕微鏡セクションをマウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
全取り付ける染色
	<ol>
<li>全体マウントに PBS T を滴下し、15 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>離れて注ぎ、PDGFRβ 1: 100、1: 500 の NG2 一次抗体 PBS T + 1 %bsa で希釈した点滴し、4 ° C で湿った部屋で一晩インキュベートします。</li>
		<li>注ぎ、PBS-T 2 × 15 分のスライド ガラスを洗うことで点滴します。</li>
		<li>注ぐし、1: 100 反うさぎ Cy2 と 1: 100 抗マウス Cy3 リンク二次抗体と暗闇の中で室温湿室に 1 h をインキュベートする 3% BSA PBS T で希釈した上に滴下します。</li>
		<li>注ぎ、暗闇の中で 2 x 15 分で洗浄する PBS T 上に滴下します。 注: オプション: ダブル、トリプル蛍光染色、連続染色が実行できるそれぞれ 2, 3 回 2.2.2 から 2.2.5 までの手順を繰り返します。</li>
		<li>取付中含む DAPI と観察フェージング染色全体マウントをマウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
低張性の隔離された血管の染色
	<ol>
<li>1 h で 100 rpm と PBS で希釈した 10% ロバ血清 500 μ L/ウェルと部屋の温度振動低張性分離血管をブロックします。</li>
		<li>室温で一晩インキュベート、600 μ L/ウェル PDGFRβ 1: 100、1: 500 の NG2 一次抗体 PBS で 10% ロバ血清希釈の 100 rpm で振る。</li>
		<li>リンス、網膜ネットワーク PBS で 5 分の x 3 と 1: 100 抗マウス Alexa Fluor 594 リンクと 1: 100 反うさぎ FITC リンク二次抗体 PBS 揺れで 100 rpm と暗闇の中で 1 時間室温で 10% ロバ血清の希釈で孵化させなさい。</li>
		<li>PBS T 5 分リンス、暗闇の中で PBS T で 3 x 5 分すすぎに続いて 15 分 0.2 ng/mL PBS T の DAPI で孵化させなさい。</li>
		<li>プラスチックのパスツール ピペットの先端を切り取って PBS T で湿らす 4 よくガラス チェンバー スライドに網膜神経回路網を転送する使用します。 注: 湿潤のステップは、パスツール ピペットの内側に付着する網膜血管を避けるために重要です。</li>
		<li>網膜の血管を展開します。これは昆布に血管を引き起こす可能性がある、鉗子で網膜の血管を触れないでください。 注: 展開することができるチェンバー スライド、前後の傾きによってまたは網膜の血管に液体の滴吸引します。</li>
		<li>井戸からメディアを削除します。液体の表面張力は、スライドの下部に血管を平坦化されます。</li>
		<li>チェンバー スライドから井戸のプラスチックを削除する前に、顕微鏡下で正しい展開を確認します。</li>
		<li>耐フェード取付中観察とステンド グラスの血管をマウントします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+Breaking+the+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li>
<li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+and+Retinal+Pericytes%3A+Origin%2C+Function+and+Role%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20(2016).</li>
<li>Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamos%2C+D+%22Confocal+Laser+Microscopy+-+Principles+and+Applications+in+Medicine%2C+Biology%2C+and+the+Food+Sciences%22">Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences</a>. Lagali, N. , InTech. (2013).</li>
<li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiolog%22%5BJournal%5D)">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li>
<li>Henkind, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5357346">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte?</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li>
<li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li>
<li>Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li>
<li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li>
<li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li>
<li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li>
<li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li>
<li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li>
<li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489(2013).</li>
<li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li>
<li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699(2010).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

微小血管網膜血管の研究に適用できる 3 つの網膜の調製技術を提案します。以下、それぞれの方法を比較し、プロトコルで重要な手順を強調表示。
網膜は矢状セクションのカットを用いて、電子顕微鏡で、したがって、同じ網膜から多数の標本を得ることが可能です。このメソッドから生じる数字のセクションでは、抗体の特異性と滴定試験動物の不必要な犠牲を防ぐための理想的な選択。準備作業は、良い結果のために決定的です。目を引くではなく目の周りのすべての筋肉をカットする目を解剖しながら、それは重要です。力が使用される場合、網膜剥離の危険性があります。アイカップが薄いので、あまりにも長い 1 つ修正しないでください。4% のパラホルムアルデヒドを PBS で 2-4 時間で浸漬は組織を修正します。もはや固定、興味の抗原を破壊の危険性があります。最高の可能な immunostainings を生成するためにガラスに対して可能な限り平坦にする各セクションにとって重要です。セクションにはのみ、いくつか時折横のカット、血管が含まれて、ためこの組織の準備方法は、血管の断続的な可視化のみを提供しています。したがって、このメ...

網膜の血管は、これらの細胞は、血管系の整合性に大きな役割を果たす多くの研究所の焦点です。糖尿病網膜症1、虚血2緑内障3など病態ペリサイトの関数を含む血管の特徴であります。ペリサイトは内側の網膜毛細血管叢で発見されます。毛細血管叢の 2 つの層に内部の網膜を供給する網膜中心動脈の枝.内側の血管床が神経節細胞と内部の核層の間に位置しています。深い層はより濃厚で複雑と内側と外側核層4,5間ローカライズされます。さらに、網膜の一部には、放射状の脈絡毛細血管と呼ばれる 3 番目のネットワークも含まれています。これらの長い、そして稀に神経線維間でうそをつくストレート毛細血管が別の 1 つまたは他の 2 つの叢6と吻合します。毛細血管の壁内ペリサイトは基底膜に埋め込まれているし、血管内皮細胞の abluminal 側のラインします。
これまで、他の血管の細胞と区別することができますこれらのペリサイトのユニークな生物学的マーカーはありません。血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) 神経・ グリア抗原 2 (NG2) は、また他の血管細胞ですが血管に存在する一般的に使用されるマーカー。ペリサイトの同定は、形態および蛋白質の表現7で異なる周皮細胞サブセットの存在によってさらに複雑です。現在、最高の識別は、蛋白質のマーカーの組み合わせと血管壁の周皮細胞の特徴的な位置に依存します。免疫 PDGFRβ/NG2 ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の汚損のための 3 つの異なる組織準備テクニックをここで紹介します。
低温セクション、網膜と強膜は視神経を通ってカットされます。ニューロンのすべて層状構造の可視化が可能になります。網膜の異なる 10 層ヘマトキシリン ・ エオシンや蛍光核 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8などの汚れを視覚化できる核や軸索・樹状突起の構造を交換として明らかにされます。層9と代謝の要件とは異なる特定の層の厚さまたは合計の不在を決定するメソッドを提供します (例えば、網膜神経節細胞の損失は網膜虚血10、認刻極印の 1 つ 11)。横を通り過ぎるそれぞれ網膜層12,13内毛細血管叢を個別に研究することが可能となって、網膜血管は明らか。
従来より、網膜血管ネットワークの調査は、網膜全体のマウントで実行されます。このティッシュの準備と網膜はカットして花状の構造として平ら。メソッドは、全体的なアーキテクチャの網膜血管を強調表示することができます比較的高速な組織の準備法としたがってしばしばマウス網膜血管新生の調査で適用。全体に取り付けられた網膜の血管の正常な可視化は発展途上の新生児マウスとラット網膜14,15,16,17,18,で報告も19. これらの研究は新生児網膜14に比べて大人に大きいキャピラリー自由な区域でより多くの定義 pericytic 活動を明らかにします。
可視化する別の方法は、低張性分離後網膜血管です。この組織作製手法で網膜血管と神経細胞の解放されて毛細血管。孤立した網膜血管ネットワークの二次元画像のこのタイプは通常網膜のトリプシン消化20後に実行、糖尿病性網膜症の周皮細胞の損失、毛細血管などの血管異常を評価するために使用変性20,21,22。低張性分離法は、彼らは、RT-PCR および西部のしみが付く23,24,25で行われている網膜血管遺伝子やタンパク質規制対応の調査を提供しています。我々 はここで微小血管を調べるトリプシンの消化力の代替として低張性孤立した網膜血管系の浮動免疫組織化学染色プロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>豚の皮からのゲレチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白からのアルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ (DNAse) I ウシ膵臓由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>正常なロバ血清</td><td>ジャクソンImmunoResearch</td><td>017-000-121、ロット129348</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗PDGFR&β;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>フルオレセイン (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td> DMSO Anti-fading mounting medium <td>Dissolved in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-fading mounting medium</td> with <td>DAPI Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fading mounting medium with DAPI</td><td>Vector研究所</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 4 ウェルチャンバースライド</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

網膜血管は目の多くの疾患で重要な役割を果たします。免疫組織化学的染色技術網膜血管と血管ペリサイト眼科研究の中心であります。微小血管を可視化する適切な方法を選ぶことが大切です。網膜血管周皮細胞免疫組織化学的染色クライオ セクション、全体-マウント、および血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) と 2 (NG2) 神経・ グリア抗原抗体を用いた分離の低張性の血管について述べる。これは利点と網膜の微小血管の可視化の 3 つのティッシュの準備のそれぞれの欠点を強調する私たちことができます。低温セクションすべての網膜の層の transsectional 可視化がだけいくつか時折横のカット、血管を含みます。全体マウント全体の網膜血管の概要を説明しますが、血管の可視化は面倒なことができます。低張性の分離は、神経細胞の除去による全体の網膜血管を可視化するメソッドを提供しますが、これは非常に壊れやすい組織になります。

成功したプロトコルは、微小血管を可視化する 3 つの異なる網膜準備を提供します。これらの各メソッドは、PDGFRβ と NG2 陽性の共局在と血管内皮の区分の周りを包むペリサイトの固有の位置を使用します。
低温セクション、DAPI ラベル核と内側の蛍光の密度によって神経細胞の層を識別できるし、深い毛細血管叢が含まれて PDGFRβ、NG2 陽性 (図 1) を表示するペリサイトにはです。(図 1の矢印) の血管の周囲に円形または馬蹄形の陽性として血管壁内のペリサイトのユニークな位置を見ることができるまたは時折縦カット血管 (図 1の矢印)。
成体ラットのホ...

ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3 つの異なったティッシュ準備テクニックを紹介します。

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

これらの方法は、眼科の分野での、例:ペリサイトの増殖や移動などの重要な質問に答える助けとなる。これらの手順の主な利点は、さまざまな視覚化オプションを提供することです。手順を実証するのは、カリン・ドレイシグとフランク・W・ブリクスト、私たちの研究室での2つのポストドキュメントです。眼を引き起こすには、まずメスを使ってラットのまぶたに約0.5センチメートルの後部および前部スリットを作ります。鉗子で目をつかみ、周囲の組織を露出させるために慎重に側面に傾けます。結合組織と筋肉組織の解剖ハサミで切り傷を作ることによって目を引き起こす。目を4%ホルムアルデヒドとリン酸緩衝生理食塩分に1~2分間短時間入れます。メスの先端に軽い圧力をかけることで角膜の手足に穴を開ける前に、ナトリウムバッファーで短時間すすぐるみます。角膜の手足を解剖用はさみで切り、角膜とレンズを鉗子で取り除きます。残りの組織を4%ホルムアルデヒドで2〜4時間PBSに残りの組織を浸す。クライオは、10%スクロースを含むソレンソンのリン酸緩衝液に浸漬し、その後25%スクロースを浸すことによって組織を保護する。容器の底に沈んだ組織を移す。豚皮から3%ゼラチン、鶏卵白から30%アルブミンを調製したヤズラ培地に埋め込みます。次に、ゼラチン埋め込み型レチナの垂直凍結分を視神経に切断する。ガラススライドの上に凍結セクションを置き、最低1時間乾燥させます。乾いたら、スライドを0.25%Triton-X 100で15分間浸します。次に、PBSTの1:100 PDGF受容体ベータと1:500 NG2一次抗体と1%BSAの混合物を凍結切除部に滴下し、一晩摂氏4度で湿ったチャンバーに入れます。翌日、スライドをPBSTに2回15分間浸漬して切片を洗浄する。その後、1:100抗マウスアレクサFluor 594リンクと1:100の抗ウサギFITCリンク二次抗体の混合物をPBSTで希釈し、3%BSAを凍結セクションに滴下し、暗闇の中で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSTでガラススライドを15分間2回すすいでください。DAPIとカバースリップを含むアンチフェージングマウントメディアで染色されたクライオセクションをマウントします。第2のレチン組織調製技術は、全マウントである。角膜の除去に続いて、鉗子の小さな開口部の動きを使用して網膜を網膜色素上皮から視神経に向かって分離する。解剖はさみで視神経のレチナを解放し、視神経の頭部に向かって数ミリメートルの長さの3〜4つのスリットを作る。ガラススライドにレティナを広げ、5〜10分間乾燥させます。4%ホルムアルデヒドをレティナにドリップし、20〜30分間固定します。固定後、PBSでリンスします。最適な結果を得るには、リンス直後に免疫染色剤を使用してください。まず、PBSTを全マウントに滴下し、室温で15分間インキュベートします。PBSTを注ぎ、一次抗体溶液を加え、一晩摂氏4度の湿ったチャンバーにインキュベートします。翌日、一次抗体を注ぎ、PBSTに滴下し、毎回15分間2回レチナをすすいだ。2回目の洗浄を流した後、二次抗体溶液をレティナに滴下し、暗闇の中で室温で湿ったチャンバーに1時間インキュベートします。二次抗体インキュベーションに続き、PBSTで以前のように2回洗浄する。DAPIとカバースリップを含むアンチフェージングマウントメディアで染色された全マウントをマウントします。全型のレチナを取り付ける代わりに、低調性分離によって血管系の残性を分離することができる。まず、24ウェルプレートに1ミリリットルの脱イオン水にレチナを入れ、室温で1.5ミリメートルの振動軌道で200rpmで振り、次に200単位のDNAse 1を加えて、レチナル血管構造からリセド細胞の破片を解離し、室温でさらに30分間振ります。150~300rpmで揺れ、それぞれ5分間、脱イオン水でレチナを3回リンスし、神経細胞の破片を取り除きます。レチナは、神経細胞の破片の除去を示す、各すすいで、より透明になるはずです。洗い込んだ後、4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルにレチナを固定し、室温で10分間PBSを行います。PBSで3回リンスします。免疫染色に進む場合は、100rpmで振盪してPBSで1時間希釈した10%ロバ血清の500マイクロリットルで低張性単離血管系をブロックします。ブロッキング後、1:100 PDGF受容体ベータおよび10%ロバ血清およびPBSで希釈された1:500 NG2一次抗体からなる一次抗体溶液の600マイクロリットルで一晩レティナをインキュベートする。翌日、PBSでレチナルネットワークを毎回5分間3回洗い流し、1:100抗マウスアレクサフルオール594thリンクと1:100抗ウサギFITCリンク二次抗体でインキュベートし、10%ロバ血清とPBSで10%のロバ血清とPBSで希釈し、室温で100rpmで暗中に100rpmで揺れます。PBSTで5分間の洗浄に続き、0.2ナノグラム/ミリリットルDAPIとPBSTで15分間インキュベートします。光から保護しながらPBSTで5分間3回洗浄します。次に、プラスチック製のパスツールピペットの先端を切ります。ピペットチップを使用して鋭いエッジを取り除き、PBSTでパスツールピペットを湿らせ、その後、ピペットにレチナル血管系を吸引し、4ウェルガラスチャンバースライドに分配します。湿潤ステップは、パスツールピペットの内側に付着する眼管炎を避けるために重要です。チャンバースライドを前後に傾けることで、レティナル血管構造を配置します。チャンバースライドの井戸から培地を取り外します。液体の表面張力は、スライドの底に脈管を平らにします。必要に応じて、液体の滴を眼管の血管系に滴下して展開する。チャンバースライドからプラスチック井戸を取り外す前に、顕微鏡下で正しく展開することを確認してください。アンチフェージング実装媒体とカバースリップで染色された血管系を取り付けます。NG2免疫検査は、内の正の血管を明らかにする。矢印は、血管内の円形および馬蹄形の免疫反応性を示す。矢印は縦方向に切断された容器を指しています。PDGF受容体ベータ免疫体化学はNG2と同様の免疫反応性を示す。再び矢印と矢頭は血管内の免疫反応性を示す。この画像は、緑色のNG2、赤のPDGF受容体ベータ、および青色のDAPIの結合を示しています。3つの異なるフィルタを重ね合わせることにより、NG2とPDGF受容体ベータが共局化することが明らかになっている。この画像は、NG2染色を赤色で行った免疫染色型全実装製剤を示す。免疫反応性は、アブルミナルペリサイトで強烈な染色を伴う表面血管ネットワークに沿って見える。ニューロン細胞は、NG2染色された微小血管間のDAPI青色核として可視である。この画像は、緑色でNG2とPDGF受容体βで赤色で染色された低張性単離されたラットのレチナル血管ネットワークを示す。完全なネットワークはNG2免疫反応性を示した。PDGF受容体ベータ免疫反応性は細胞ソマで発見された。より高い倍率では、PDGF受容体ベータ染色が血管ネットワーク内の細胞ソマにのみ見られることは明らかであり、ペリサイト免疫反応性を示す。NG2およびPDGF受容体ベータと共にDAPI染色を含むこの高倍率画像における2つの未定義の血管壁細胞における3つのペリサイトを明らかにする。これらの手順に従って、平滑筋細胞または内皮染色のような他の免疫染色は、追加の質問に答えるために使用することができる。例えば、家管系の細胞は虚血に続いてどのように見えるのでしょうか?

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Biology

生物学

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網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

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