Name: リポポリサッカライド投与による敗血症性肺損傷における気管支肺胞洗浄エクソソーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶLPS誘導敗血症性肺損傷における気管支肺胞洗浄エクソソームの役割。マウスモデルでエクソソームを単離・精製し、気道上皮細胞との共培養で炎症応答とタイトジャンクション破壊を解析する方法です。

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著者から、利益相反の宣言されていません。

総合的なプロトコルには、敗血症の誘導の最初の日と、動物とマウス BALF からエクソソーム隔離のため 2 日目から BAL 液の分離を含む 2 日が必要です。すべての手順が検討されており、機関動物ケアおよびアトランタ VA メディカル センターで使用委員会によって承認されました。
1. マウス急性敗血症性肺傷害モデル
<ol><li>6-8 週間-を使用して古い男性野生型 c57bl/6 j マウス (重量 20 22 g) 動物のモデル、および無菌技術と機器を使用してすべての手順を実行します。オートクレーブすべて手術器具、鉗子、はさみ、121 ° C で 20 分用を含む</li>
	<li>実験的にマウスとコントロール グループをランダムに配布します。手術用ボード上でマウスを抑制します。腹腔内のルートによる大腸菌リポポリサッカライド (LPS、15 mg/kg) を持つマウスを扱います。個人体重別に適切な LPS 投与量は 0.1 mL PBS マウスあたりに希釈し、27 G の針を用いて 1 mL 注射器を使用して LPS 溶液を注入して、対照動物に PBS の相当量を注入します。</li>
	<li>適切な室温できれいなケージから成っている動物の BSL2 施設にマウスをしてください。</li>
	<li>24 h 後、CO2吸入マウスを安楽死させます。</li>
	<li>マウスの首のセンターで外科の領域を選択します。(約 5 mm) の小切開を行い、気管、気管を露出するまで鈍い鉗子を使用してへのアクセスのための筋肉を優しきます。</li>
	<li>27 G 針付きマウス BAL 液 10 mL 滅菌注射器とを撤回します。まず、優しくと気管に針を挿入、気管に 1 mL の滅菌 PBS をゆっくりと注入し、27 G 針付き 3 mL シリンジに BALF を描画します。プロシージャが完了したら、注射器や針バイオハザード シャープス コンテナーの処分します。</li>
	<li>Chauretらによって前述のように塩素、二酸化炭素、手術器具を扱う27、121 ° C で 20 分間のオートクレーブによるすべての手術器具を滅菌、</li>
</ol>2. エクソソーム分離シリアル超遠心分離とキャラクタリゼーション
<ol><li>15 mL の円錐管にマウス BAL 液を収集します。肺胞細胞を収穫するには、遠心分離機の 4 ° C での 1,000 g で 10 分間のサンプル</li>
	<li>上清を新しい 15 mL コニカル チューブに転送し、4,000 x g 細胞の残骸を削除する 4 ° C で 30 分間試料を遠心分離します。</li>
	<li>超遠心機チューブと大きい細胞の粒子を除去する 4 ° C で 10,000 x g で 60 分間遠心分離機サンプルの上澄みを収集します。</li>
	<li>上清を新しい円錐管に転送し、試料の残りのより大きい粒子を削除する 0.2 μ m シリンジ フィルターを通して。</li>
	<li>超遠心機チューブ内のサンプルを収集し、管のバランスをとる。遠心分離機のサンプル、エクソソームのペレットへの 4 ° C で 140,000 x g で 2 時間。 注: エクソソームのサイズは 20-200 nm を異なります。200 よりも大きな粒子を除去するため 0.2 μ m フィルターを使用サイズの nm。</li>
	<li>優しく培養上清を捨てます。100 μ L の PBS または溶解・ ソリューション、1.5 mL チューブに転送エクソソーム サンプルとペレットを溶解し、使用するまで-80 ° C で保存します。 メモ: 分離エクソソームを確認するには、透過型電子顕微鏡の使用をお勧めします。</li>
	<li>処理プロトコル28標準 TEM サンプルに従ってください。エクソソーム サンプルの透過型電子顕微鏡と取るイメージ スケール 200 バーを使用して分析 nm。</li>
</ol>3. miRNA と舞台 miRNA-q-RT-PCR の準備
注: Mirna の発現レベルを分析するには、miRNA q RT-PCR 法の使用をお勧めします。
<ol><li>標準 miRNAs の隔離のプロトコルに従うし、一本鎖逆転写24で浄化された Rna の同量を使用することを確認します。</li>
	<li>BAL 液中 exosomal マイクロ Rna レベルを検出する標準のリアルタイム PCR のプロトコルに従ってください。ミール 155 やミール-146a U6 SnRNA に対する特定のリアルタイム PCR のプライマーを使用します。定量的 PCR 装置と PCR の反作用を実行し、内部統制 U6 snRNA に式の値を正規化します。 注: 各グループは、帳票サンプル24で構成されています。</li>
</ol>4. エクソソームのラベリングと浄化
<ol><li>1.5 mL ポリプロピレン チューブに 100 μ L 懸濁液ソリューション エクソソーム ペレットを中断し、懸濁液溶液 100 μ L を他の管へエクソソームの染料の 0.4 μ L を追加します。</li>
	<li>すぐに色素ソリューションにソリューションのエクソソームを追加し、ピペッティングでそれを徹底的にミックスします。室温で 5 分間のサンプルを維持、光から保護します。</li>
	<li>エキソソーム スピン列を 1.5 mL 溶出チューブに入れてください。エキソソーム スピン列のセンターにソリューションの混合物を転送します。</li>
	<li>室温で 800 x g で 2 分間列をスピンします。</li>
	<li>列を破棄し、使用するまで-20 ° C で溶出サンプルを格納します。</li>
</ol>5. エクソソームを受信者の細胞によって撮影の検証
<ol><li>1 x 10 の4 8 もチェンバー スライド、37 ° c、5% CO2培養細胞で MLE 12/cell の種子します。</li>
	<li>10 μ L の蛍光ラベル エクソソームをセルに追加します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>文化メディアを削除し、pbs セルを洗う、室温で 10 分間の 1% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。</li>
	<li>DAPI をマウント中のスライドをマウントします。</li>
	<li>蛍光顕微鏡でサンプルを分析し、画像、40 倍の倍率がかかります。</li>
</ol>6. エクソソームと受信者の細胞間の相互作用の検証
<ol><li>種子 2 x 105 MLE12/ウェルおよび 5% CO237 ° C で培養細胞を適切な培地を含む 12 ウェル培養プレート。</li>
	<li>MLE12 セルにマウス BAL 液 20 μ g エクソソームを追加し、実験グループごとの複製を設定します。</li>
	<li>24 h はその後、PBS のセルを洗浄し、ウェルに 600 μ L 換散バッファーを追加します。優しくプレートを振るし、ピペットと 1.5 mL チューブで溶解サンプルを収集します。</li>
	<li>標準の総 RNA の隔離のプロトコルおよび cDNA 逆のトランスクリプション プロトコルに従う、一本鎖 cDNA の逆のトランスクリプション29を完了します。</li>
	<li>受信者セル29の mRNA 発現レベルを検出する標準のリアルタイム PCR のプロトコルに従ってください。TNF α、イルに対して特定のリアルタイム PCR のプライマーを使用して-6、および ZO 1。定量的 PCR 装置との PCR の反作用を実行し、GAPDH の内部のコントロールに式の値を正規化します。 注: 各グループは、帳票のサンプルで構成されています。</li>
</ol>

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</ol>

この作品は、RS に VA メリット レビュー 2I01BX001786 06A1 資金によって支えられました。

病気のマウス ・ モデルは、特定の遺伝子の生理機能を評価し、実験2のコストを削減する通常使用されます。急性敗血症性肺傷害を説明ここで ARDS の人間に見られる炎症性応答を模倣しています。このモデルは分子病態研究、バイオ マーカーの開発を調査し、潜在的な新しい治療法5をテストするものです。
共培養系研究生体内RNA、DNA、脂質、および in vitro システム23,30蛋白質など生体分子の移動の潜在的なメカニズムの調査のコンテキストで関連しています。機械的な理解の評価および複雑な病気22,23治療法の開発に偉大なユーティリティがこれらのプラットフォームのいくつかあります。ここで示すように、洗浄の細胞 (マクロファージ, 好中球) から...

ALI および ARDS は重度の低酸素血症の約 100 万人世界中に影響を与える非心原性肺水腫による呼吸不全の生命にかかわる形態毎年1。ARDS の病因には、感染症や吸引やさまざまな間接的な侮辱から肺に直接傷害が含まれています。最後のディケイドが ARDS の病態理解が増す、しかし、ARDS の特定のターゲットを絞った治療法がまだ2,3を開発します。
急性肺傷害のいくつかの動物モデルは人間の研究4,5実験療法を翻訳するためのブリッジを提供する開発されています。一般的に使用されるモデルには、オレイン酸や細菌、LP、ブレオマイシンのローカル インストールが含まれます。他のアプローチには、虚血再灌流、盲腸結紮穿刺、機械的換気誘発ストレッチ損傷、酸素または細菌の LPS5全身投与が含まれます。これらのモデルは臨床的仮説をテストする有用な生物学的システムを提供する、潜在的な治療法の開発。人間 ARDS をシミュレートするには、動物モデルは炎症や肺のバリア機能の欠陥と上皮と内皮細胞を急性障害を再現する必要があります。
エクソソームは分子の内容には、蛋白質、DNA、RNA および脂質が含まれています、直径 20-200 nm の膜小胞であり、分子組成振込組織微小環境で細胞間のコミュニケーションを円滑します。エクソソームは複数の種類の細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞などから分泌されるが、人間の体液に存在します。研究を示すエクソソームは感染性と無菌の炎症性疾患時に免疫細胞と間質細胞間クロストークを規制し、生理中に様々 な自然と実験的刺激で規制するその異常なリリースが表示されます。および病理学プロセス6。このような通信ネットワークは肺疾患の病態に重要な役割を果たす可能性があり、病態生理学的進行7、8に影響を与える可能性があります。として 18-22 ヌクレオチド非コード Rna、miRNAs 組織と体液、血漿、血清に存在し、翻訳後修飾レベル9,10mRNA 発現を調節します。
エクソソーム パッケージ miRNAs 複数種類の細胞の分化と機能に影響を与えるし、様々 な病気、ガン、肺疾患、肥満、糖尿病、心血管疾患11を含む関連付けられている過剰なレベル 12,13,14,,1516。受信者の細胞と exosomal の miRNAs の往復への参入は、微小環境17,18の止血を変更する細胞間のコミュニケーションを促進します。急性肺傷害、エクソソーム8を通じて広範な細胞間コミュニケーションの種類の細胞を含む複雑なプロセスです。ミール 155 とミール 146a 一般的な転写調節機構を共有し、炎症反応や免疫寛容19,20に貢献。最近の研究では、両方が exosomal miRNAs の免疫細胞21間往復経由で炎症反応を調節することを示します。しかし、変調エンドトキシンに歯槽の応答に及ぼす exosomal Mirna の分子機構は不明、間違いなく潜在的な臨床的意義と並進含意メリット詳細な調査。
炎症とがんの22,23などの複雑な環境で特定の細胞型の相互作用を定義する共培養モデルを採用されています。これらのプラットフォームは、特に構造と免疫細胞の種類の細胞間クロストークを尋問する代替方法を提供します。
内気管、LPS の噴霧、腹腔内投与または全身投与、実験的肺傷害24,25,26を誘導するために広く使用され上皮と内皮細胞の透過性を誘導するために示されています。欠陥があります。ここで敗血症モデル マウスにおける急性肺傷害を誘発するのに腹腔内の LP を使用します。LPS の腹腔内投与の 24 時間以内の炎症細胞と肺の透過性欠陥が誘導されます。さらに、バルからエクソソーム含ま miRNA 155 とミール-146a と BAL 液からエクソソームは il-6, TNF-α を含む受信者の上皮細胞で炎症性サイトカイン発現を誘導することを示す.これらのデータは、その exosomal の Mirna を示す第 1、急性敗血症性肺傷害のこのモデルのバルで分泌されるが。

<table><tbody><tr><td>リポ多糖類</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA isolation kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;(Mm00443258_m1)プライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6(Mm00446190_m1&nbsp;&nbsp;)プライマー</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )プライマー</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>minimal essential medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Trysin-EDTA solution(0.05%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Exosomes を PKH67 から PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>エキソソームスピンカラム (MW3000)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP 超遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>超透明遠心管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>アプライド・バイオシステムズ 7500 高速リアルタイムPCRシステム</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡(TEM)</td><td>日本電子株式会社</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>オリンパスBX41顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

リポポリサッカライド投与による敗血症性肺損傷における気管支肺胞洗浄エクソソーム

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

激しい肺傷害 (アリ) と急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、高い罹患率と死亡率を持ち続けている肺疾患の異種グループを表します。アリの病態は優れているが定義されます。しかし、病気の複雑な性質のため分子療法まだ開発されなければなりません。ここで炎症反応のエクソソームの役割を記述するのに急性敗血症性肺傷害のリポ多糖 (LPS) 誘発マウス モデルを使用します。このモデルを使用して、マウス腹腔内組合にさらされているが miRNA とサイトカインは、炎症反応を調節するとパッケージ化された肺から気管支肺胞洗浄 (BAL) 液のエクソソームを分泌することを表示することができました。気管支上皮細胞タイト結合蛋白質の発現するエクソソーム マクロファージからリリースが中断を示す共培養モデル システムを使用してさらに、.炎症性応答に貢献する exosomal を往復させる生得免疫構造と細胞間クロストーク 1)、構造壁と 2) これらの Mirna ターゲットの混乱を治療する新しいプラットフォームを提供することが示唆します。ALI および ARDS。

敗血症性肺傷害を誘導して、マウスは、腹腔内の LPS (15 mg/kg) と扱われました。LPS 投与 24 時間以内は、図 1 aに示すように、好中球の流入が肺に見られました。エクソソームの隔離そして浄化に続いてマウス BAL 液が描かれました。BALF エクソソームの形態は、電子顕微鏡観察 (図 1 b) によって確認されました。
選択的プロ炎症性 miRNAs miRNA 155 およびミール 146a 発現精製エクソソームから q RT-PCR 法により検出されました。PBS (ミール 155、1 ± 0.16 vs 11.6 ± 0.6; 1 ± 0.12 対 13.5 ± 1.186、ミール 146a) とコントロール マウスと比較して、組合で処理したマウスから BAL 液エクソソームのミール 155 とミール 146a...

マウス腹腔内組合は、miRNAs とパッケージ化された気管支肺胞洗浄 (BAL) 液のエクソソームを分泌します。共培養システムを用いて、BAL 液中リリース エクソソームの気管支上皮細胞におけるタイト結合蛋白質の表現を中断させ、肺損傷を強調する炎症性サイトカインの発現を示す.

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

この実験の全体的な目標は、LPS誘発性急性敗血症性肺損傷マウスモデルにおける炎症反応におけるエキソソームの役割を描写することです。したがって、この方法は、急性肺損傷および急性呼吸窮迫症候群における細胞クロストークに関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。特に、エクソソームシャトルを介した肺胞微小環境内の細胞間コミュニケーション。この技術の主な利点は、急性肺損傷を伴うエンドトキシン処理敗血症マウスに由来する高度に精製された気管支肺胞洗浄エキソソームの分離と特性評価を可能にすることです。その手順を実演するのは、Zhihong Yuan博士とChetna Bedi博士です。まず、マウスあたり0.1ミリリットルのLPSとPBSが入った27ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器をロードし、最初の6〜8週齢のオスのC57ブラック6Jマウスを手動で拘束します。24時間後、最初の動物の首の中央に5ミリメートルの切開を行い、鈍い鉗子を使用して筋肉を穏やかに分離し、気管を露出させます。次に、滅菌済みの10ミリリットル注射器に取り付けられた27ゲージの針を気管にそっと挿入し、滅菌PBSを1ミリリットル注入します。その後、すぐに10ミリリットルの注射器を、新しい27ゲージの針を備えた3ミリリットルの注射器に交換します。気管支肺胞洗浄液またはBOLFを吸引し、氷上の適切にラベル付けされた15ミリリットルの円錐管にBOLFを追加します。エクソソームを単離するには、BOLFサンプルを遠心分離し、上清を新しい15ミリリットルチューブに移します。サンプルを再度遠心分離し、上清を超遠心チューブに移して、より大きな細胞粒子を除去します。上清を新しい円錐形チューブに移し、サンプルを0.2ミクロンのシリンジフィルターにロードして、残っている大きな粒子を取り除きます。ろ過したサンプルを新しい超遠心チューブに加えて、エキソソームをペレット化します。上清を慎重に捨て、ペレットをチューブあたり100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、エキソソームサンプルを個々の1.5ミリリットルチューブに移し、マイナス80°Cで保存します。エキソソームを精製するために、サンプルごとに100マイクロリットルの懸濁液を含む1本のチューブに0.4マイクロリットルの適切なエキソソーム色素を加え、解凍したエキソソームサンプルを各色素チューブに素早く加えます。エキソソームを色素と十分に混合し、サンプルを室温で5分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーションの終了時に、サンプルごとに1つのエキソソームスピンカラムを1.5ミリリットルの錯視チューブに入れ、エキソソーム溶液を各スピンカラムの中心に移します。次に、サンプルを遠心分離し、カラムを廃棄し、言及されたサンプルを摂氏マイナス20度で保存します。レシピエント細胞によるエキソソーム取り込みを測定するために、まず、0.5ミリリットルの培地中の第4マウス肺上皮12細胞を1回1回、8ウェルチャンバースライドの各ウェルに播種し、5%二酸化炭素中で摂氏37度で16時間培養する。解凍後、精製した蛍光標識エクソソームを10マイクロリットルずつ各ウェルに加え、細胞培養物をインキュベーターに1時間戻します。インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで洗浄し、室温で10分間、各共培養物を1%パラホルムアルデヒドで固定します。培地を取り出し、DAPIを添加した培地でスライドをマウントし、蛍光顕微鏡で40倍の倍率でサンプルをイメージングします。レシピエント細胞とのエキソソーム相互作用を検証するために、適切な培地を含む12ウェル培養プレート内のウェルあたり2ミリリットルの培地にマウス肺上皮12細胞を2回10回播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で2時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、実験グループごとに上皮細胞の3つのウェルに20マイクログラムのエクソソームを追加し、細胞をインキュベーターに戻します。24時間後、培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄し、600マイクロリットルの溶解バッファーを各ウェルに穏やかに振とうします。次に、各ウェルの内容物全体を個々の1.5ミリリットルチューブに移し、標準的なリアルタイムPCRプロトコルに従ってサンプルを分析します。LPS投与後24時間以内に、LPS処理動物の肺に好中球の流入が観察されます。今示したように、それらの単離と精製の後、敗血症性肺損傷動物のBOLF中のエキソソームの存在は、透過型電子顕微鏡法によって確認することができます。選択された炎症誘発性マイクロRNAの発現は、制御されたPBS処理マウスと比較して、LPS処理動物の気管支肺胞液エキソソームで有意に増加します。LPS処理されたエキソソームは、1時間の共培養後に蛍光色素標識エクソソームとDAPI標識細胞との共局在によって証明されるように、マウス細気管支上皮細胞に取り込まれます。炎症誘発性メディエーターの発現は、対照PBS処理マウスのエキソソームと共培養した場合と比較して、LPS処理動物のエクソソームと共培養した上皮細胞で有意に増加します。さらに、LPS処理マウスのエキソソームで処理した細胞は、コントロールと比較して、Zonula occludensの発現が有意に減衰したことを示し、LPS処理したエキソソーム共培養後の細胞完全性が損なわれていないことを示している。LPSの腹腔内注射、気管支肺胞洗浄液の抽出、気管支肺胞洗浄液からのエキソソームデリゲーションなど、すべてのステップを比較的短時間で完了することができます。この手順に続いて、エクソソームや上皮細胞共培養などの他の方法を実行して、肺胞微小環境における自然細胞と構造細胞との間のクロストークに関する追加の質問に答えることができます。エクソソームシャトルを介した自然免疫細胞と構造細胞間のクロストークは、炎症反応と構造的バリアの破壊に寄与し、エクソソームマイクロRNAターゲティングが急性肺損傷および急性呼吸獅迫症候群を治療するための正常なプラットフォームを提供する可能性があることを示唆しています。このビデオを見れば、マウスに敗血症性肺損傷を誘発する方法、マウスから気管支肺胞洗浄液を分離する方法、洗浄液からエキソソームを分離する方法、細胞内クロストークを調べるための共培養モデルの使用方法についてよく理解できるはずです。LPSでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。...

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

我々は、急性肺損傷をモデル化するために、噴霧によりエアロゾル化したリポ多糖にチャレンジすることにより好中球の肺の炎症を誘導するための方法を記載している。また、肺の分離、気管挿管および気管支肺胞洗浄のための基本的な外科技術も記載されている。...

エアロゾル化リポ多糖を使用して生成肺好中球増加のための方法

麻酔したブタにおける反復肺洗浄液は、ヒト急性呼吸窮迫症候群（ARDS）の主要な側面に似た肺損傷を引き起こします。この目的のために肺を繰り返し、37℃で0.9％食塩水でlavagedされます。プロトコルの目標は、ARDSの研究のためのガス交換と血行動態の再現性の緩和です。...

急性呼吸窮迫症候群（ARDS）のモデルとして、ブタにおける洗浄によって誘発される界面活性剤枯渇

肺の健康状態は、肺の細気管支に存在する免疫細胞のタイプおよび数によって反映される。私たちは、気管支肺胞洗浄技術を説明し、非接着性細胞およびマウスの下気道からの可溶性因子の単離および研究を可能にする。...

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

ここでは、直接気管内リポ多糖類の含有によってマウスの急性肺損傷を誘発し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄液、および肺組織のFACS分析を行うステップバイステップの手順です。最小限の侵襲性、簡単な処理、良好な再現性、および疾患の重症度の滴定は、このアプローチの利点です。...

直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

オゾンと細菌性内毒素を組み合わせたマウスは、好中球を含む広域細胞死を示す。細胞骨格ラメリポディアの破壊、気管支-肺胞洗浄における複雑なV...

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

本研究では、非侵襲的な気管内挿入技術が、基本的な喉頭鏡を用いてラットでALIを発生させることが示され、肺へのLPSの正確な供給が保証されています。LPSは喉頭鏡を用いた気管内チューブ から 点滴されます。肺損傷の規模は複数の時点で評価されます。...

齧歯類の急性肺損傷を誘発するための非侵襲的気管内リポ多糖投与

このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。...

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

学ぶLPS誘導敗血症性肺損傷における気管支肺胞洗浄エクソソームの役割。マウスモデルでエクソソームを単離・精製し、気道上皮細胞との共培養で炎症応答とタイトジャンクション破壊を解析する方法です。

リポポリサッカライド投与による敗血症性肺損傷における気管支肺胞洗浄エクソソーム

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