Name: 生鮮・冷凍の消化試験片から細胞レベル下の分別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ 細胞質と核タンパク質を分離する細胞分画プロトコル。生鮮および冷凍のヒト腸生検体に適用可能で、タンパク質局在解析や免疫沈降研究を支援します。再現性のある結果が得られます。

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著者は、ビデオ録画や編集の Ander ロペスとみれん Telletxea の支援を認めます。ACR は、Ikerbasque ・ フェローシップ ・隣人・ デ ・ Celiacos マドリード (ACM) から研究プロジェクトによって資金を供給します。JRB はプロジェクト ISCIII-PI16/00258 によって資金を供給、共同欧州連合 ERDF/ESF「ヨーロッパをさせる方法」によって資金を供給されます。バスク保健省の研究プロジェクト助成 2015111068 によって資金を供給されます。IRG と AJM それぞれ UPV/EHU とバスク語教育部門からまた、博士課程フェローシップ助成金によってサポートされます。

本研究はラスクルーセス大学病院倫理委員会によって承認された、すべての科目や両親からインフォームド コンセントを得た後分析を行った。
1. 生検コレクション
注: 患者の遠位十二指腸生検重量 2 〜 10 mg 間の範囲の通常の診断内視鏡生検の管理中に取得されます。生検組織は、異なる細胞など上皮、免疫および血管内皮細胞から成る複雑な組織です。臨床消化器内科内視鏡検査を実行する確立された臨床ガイドラインに従う。
<ol><li>内視鏡検査後だけ滅菌フィルター ペーパーに生検を配置します。</li>
	<li>1.5 mL チューブに生検を転送し、PBS でそれらを浸し、cryotube に鉗子を使用します。</li>
	<li>研究室に到着するまで、氷の上の管を保ちます。<ol>
<li>すぐに新鮮な生検の処理を開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結生検、フラッシュ チューブを含む生検を凍結し、使用するまで液体窒素で格納します。 注: 1 冷たい補われたバッファーが追加されるまで凍結サンプルを保つために重要です。</li>
</ol>2. バッファー準備
注: 始める前に、バッファーを次のとおり補足します。
<ol><li>1 mM DTT (最終濃度) を追加し、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル (最終濃度 x 1) 低張バッファー 1 および高張にバッファー 2 (表 1)。<ol>
<li>1 サンプルあたり 2 バッファーのバッファー 1、150 μ L の 1.5 mL を準備します。DTT は、サンプルの酸化を防ぐ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>既に補われたバッファー 1 0.1% の最終濃度 1% 洗剤 (ノニル phenoxypolyethoxylethanol) を追加することによって核洗浄バッファーを準備します。1 mL のサンプルあたり核洗浄バッファーを準備します。</li>
</ol>3. 生検均質化
<ol><li>
新鮮な生検
	<ol>
<li>電動ミキサーで使い捨ての杵を配置します。杵が管の底に達することを確認します。</li>
		<li>Cryotube から、生検を取り出し、ピペット チップを 1.5 mL チューブに配置。</li>
		<li>1.5 mL チューブに補われたバッファー 1 の 200 μ L を追加します。</li>
		<li>杵で生検を均質化組織は完全に崩壊するまで氷の上保管してください。</li>
		<li>すべてのバイオプシーが均質化した後は、手順 4 に進みます。 注: 使い捨てすりこぎは、バイオプシーの間変更する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
冷凍生検 注意: 慎重に液体窒素を取り扱い皮膚や目に液体窒素との接触は、凍結重傷を引き起こす可能性があります。液体窒素を使用するときに常に手や目を保護します。<ol>
<li>いくつかの液体窒素を窒素タンクから取得した cryotubes を保存するボックスで取る。</li>
		<li>生検は、窒素タンクと液体窒素でボックスに、cryotube を配置します。すべての生検のためには、この手順を繰り返します。</li>
		<li>1.5 mL チューブに、cryotube から生検を転送します。 注: 生検は凍結チューブに添付されます。それは管から接続解除されますので滅菌ピペット チップで生検をプッシュします。</li>
		<li>補われたバッファー 1 の 200 μ L を追加します。</li>
		<li>乳棒と乳鉢を使用して、組織は完全に崩壊するまで、すべてのプロシージャ全体で 4 ° C の温度を維持する組織をホモジナイズしてください。 注: バッファーを追加する前に解凍生検をてはいけないです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細胞質の分離
<ol><li>10 分間氷の上の均質化の生検を孵化させなさい。</li>
	<li>各サンプルを最終濃度 0.05% に 1% 洗剤 (ノニル phenoxypolyethoxylethanol) の 10 μ L を追加します。 注: セルにうねり、浸透圧換散によってバースト中性洗剤は細胞膜を破壊します。</li>
	<li>氷で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>簡単に渦と 4 ° C で 400 x g で 2 分間遠心します。</li>
	<li>ボルテックス後、上澄みを除去し、新しいきれいな 1.5 mL チューブ; に転送これは細胞質画分になります。ペレットは捨てないでください。</li>
</ol>5. 核隔離
<ol><li>核洗浄バッファーの 200 μ L で前の手順からペレットを再懸濁します。</li>
	<li>400 x g と 4 ° C で 2 分間チューブを遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、さらに 2 回洗濯の手順を繰り返します。 注: 核の細胞質の汚染は、洗浄が削除されます。</li>
	<li>第 3 洗浄後バッファー 2 の 100 μ L にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>また 30 分の 4 ° C でサンプルを積極的に振る、氷と渦 5 分ごとにサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>後揺れ、トップ スピードで 10 分間のサンプルを遠心分離機 (> 12,000 g x) および 4 ° C</li>
	<li>ボルテックス後、新しいきれいな 1.5 に上清を移します。mL のチューブ。これは、核分画になります。</li>
</ol>6. プロテインの定量
注: 定量化ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キットとタンパク質です。分数の蛋白質の濃度が範囲 0.5 ~ 5 μ g/μ L、核の一部分に低く (2 mg 生検から得られた蛋白質濃度の表 2を参照)。
<ol><li>次のウシ血清アルブミン (BSA) 量 (μ g)12の標準曲線の準備: 0-0.5-1-2-3-4-5-6。</li>
	<li>サンプルあたり BCA ファイナルミックスの 100 μ L を使用するために必要な試薬を準備します。</li>
	<li>96 ウェル プレートに各蛋白分画の 2 μ L をピペット BCA ミックスを追加して、読書のための製造元の指示に従ってください。</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
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<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明したプロトコルは腸生検の核および細胞質分別のため使用されます。浄化された蛋白質が変性していないとだけでなく、免疫沈降、電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA) などのネイティブ折り畳まれたタンパク質を必要とするアッセイにも図 2と3に示されて西部のしみの分析で使用できますかネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ)。
この方法は、核膜に影響を与えずに細胞膜を破裂する浸透圧溶解とともに組織の力学的均質化に依存します。結果は、ダウン ストリームの解析に使用する細胞質、核タンパク質のきれいな分別です。蛋白質およびホスファターゼ阻害剤の添加によるプロセス中にタンパク質の分解を制御することが重要です。さらに、抽出されたタンパク質は、下流の機能アッセイに使用するが場合も、変性およびサンプルの分解を避けるために重要です。4 ° C でプロセスを実行する必要があります、PMSF はバッファーにも追加する必要があります。
このプロ...

蛋白質はセル内のほぼすべての生物学的機能に参加し、構成、量や場所の変化は、病原性のシナリオにつながることができます。組織サンプルの分別方法は病気の複雑さを軽減する有用なアプローチ関連タンパク質解析。いくつかの研究蛋白質ローカライズ情報を使用または特定の細胞内コンパートメントからタンパク質を豊かにそのままな蛋白質の再現可能な分別のためのプロトコルは特定の生物的質問に答えるために役立ちます。タンパク質の細胞内局在を決定し、彼らのコンパートメントの再配布または基底での相互作用を監視病態の疾患の識別に役立つ、関連する機能の違い1,2。したがって、このメソッドは、再現性をもって分別腸組織生検、新鮮、冷凍、細胞質と核の細胞内コンパートメントを目指しています。
腸生検内視鏡手順3 (図 1) 日常的に得られる、タンパク質定量や免疫沈降法研究の効果的に使用できます。疾患病態4に直接かかわることができる蛋白質、腸上皮組織試料に含まれるので腸生検サンプル、腸疾患固有の成功の識別のための非常に貴重な情報源蛋白質。タンパク質解析のための有用な資源であり、シンプルで再現性のある試料は制限量を使用して細胞コンパートメント情報を提供するためにキー問題臨床情報と共にストアド冷凍、患者組織サンプルを凍結組織5。
細胞分画の分離のためのいくつかの市販キットがありますが、これらはより高価で、一般的に時間がかかるここで提示されたプロトコルよりも。多段勾配遠心法に基づいてプロトコルおよび連続的な勾配はまた以前使用された異なったティッシュ6、7の多様な細胞コンパートメントの分別のため。連続的な勾配の一貫性を維持することは、しばしば困難な作業です。膜の連続溶解に基づく類似したプロトコルが以前に記載されているが、彼らは一般的に 3 つ以上のバッファーを必要し、時間に手が長く8 。
組織サンプルを分留するとき覚えておいてその組織培養細胞の存在も重要な蛋白質の抽出に進む、サンプル プレゼント細胞間や細胞-マトリックスの対話。細胞と細胞外基質タンパク質の質に影響を与えることがなく適切な内訳を腸組織タンパク質分離9で重要な要因となります。このプロトコルでセルとセル行列連絡先最初壊れている、セルを解放し、個々 のセルに到達するバッファーを許可します。タンパク質コンパートメント分別に混合を避けるためには、細胞や原子膜の完全性を変えることがなく連絡先の内訳があります。
による小腸粘膜10様々 なプロテアーゼの濃縮、抽出中にタンパク質の分解を制御することが重要です。潜在的なタンパク質の分解を抑えるタンパク質抽出バッファーに複数のプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。さらに、抽出機能アッセイに使用する場合は、このタンパク質活動11の損失が発生、タンパク質やタンパク質の変性を避けるために不可欠です。このため、プロトコルは 4 ° C で行われた、新鮮な特異フッ化物 (PMSF) が 0.1 mM を使って、さらにタンパク質分解を阻害する直前の最終濃度でバッファーに追加されます。
セル分別の最初のステップは、組織の混乱とセル換散です。前述のように、目的は細胞とそれらを最小限のダメージでこじ開けるを細かく分けたです。腸の組織サンプルを均質化する必要がありますと、細胞が細胞膜の最大破壊を達成するために分離します。このプロトコルでは数秒以内に高速ボルテックス アクションによる均質化は腸の組織を分割するのにモーターを備えられた杵ミキサーを使用します。均質化後、細胞に細胞膜を破裂が、核をそのまま維持、非変化洗剤 (ノニル phenoxypolyethoxylethanol) と核を分離する短い渦の加え、続いて低張バッファーで孵化します。細胞質分画。細胞核は細胞質を除去した後揺れで高張バッファーどっと。
ここで紹介した方法は、内視鏡手術と重 2 と 10 mg の間の範囲の間に得られた生鮮・冷凍の腸生検の細胞レベル下の分別のための適切なメソッドです。プロトコルは簡単で再現性のある、基本的な実験装置および時間の下で試薬を使用して実行可能性があります。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sigma</td><td>Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>CA-630</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>BCAアッセイ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>23227</td><td>タンパク質定量キット</td></tr><tr><td>使い捨てプラスチック乳棒</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>シャッカー</td><td>IKA</td><td>MS3 ベーシック</td><td></td></tr></tbody></table>

生鮮・冷凍の消化試験片から細胞レベル下の分別

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

このプロトコルの目的は特定の蛋白質または異なる組織状態 (すなわち、健全な蛋白質の複合体の局在解析用核と細胞質コンパートメントに内視鏡検査によって得られる人間の腸組織を分別するには対病)。このメソッドは両方生鮮・冷凍の腸組織サンプルの分別のため便利簡単にアクセスできるすべての研究所、いない時間がかかるです。

図 1は、ヘマトキシリン エオシン染色腸生検部そのまま絨毛と地下構造を示しています。
このプロトコルを使用して核および細胞質分別の代表の結果は、図 2および3に示します。冷凍 (Fz) フレッシュ (Fh)、図 2に示すように実験で生検はここで提示されたプロトコルを次を同時に分別された、西部のしみは、各サンプルの 20 μ g を用いて行われました。各画分および生検でタンパク質濃度が表 2に示す、タンパク質の濃度は非常に新鮮な凍結組織間で異なるありません。2 mg 生検から抽出したタンパク質の収量は周り 3-4 μ g/μ L 細胞質画分の核分画の約 1.5 μ g/μ L。分数の純度を確認するは、HSP90 とチューブリンは細胞質コ...

ここでは、人間および冷凍腸生検で細胞質および核蛋白質の細胞レベル下の分離の簡単な細胞分画を実行するプロトコルを提案する.

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

次のプロトコルの目標は、凍結または新鮮な胃腸標本から細胞内画分を生成することです。タンパク質は、細胞内のほぼすべての生物学的機能に関与しています。どのようなバリエーションでも、それらはある場所で抽出され、病原性のシナリオにつながる可能性があります。一部の研究では、タンパク質の局在評価を利用したり、特定の細胞コンパートメントからタンパク質に侵入する必要があります。したがって、この点では、無傷のタンパク質の再現性のある分画が重要です。腸管生検サンプルは、最近、内視鏡検査の手順で取得可能になり、タンパク質の定量や免疫沈降研究に効果的に使用できます。臨床腸サンプルは、組織および疾患特異的タンパク質を効果的に同定するための重要なリソースです。この方法の名前は、内視鏡検査によって得られたヒト腸組織を核および細胞質コンパートメントに分画し、特定のタンパク質またはタンパク質複合体の局在分析を行うことです。この方法は、両方の分画に役立ちます。まず、私たちの凍結腸内細菌症が起こります。凍結組織法では、抽出後すぐにサンプルを凍結し、使用するまで液体窒素で保存します。冷温均質化バッファーを添加するまで、サンプルを凍結状態に保つことが重要です。新鮮なサンプルの場合は、生検を1.5 mLマイクロチューブに移し、手順が開始されるまで氷上に置いておきます。凍結した組織サンプルは通常、クライオチューブの壁に付着し、組織は滅菌ピペットチップを使用して放出してから、円錐形の1.5 mLマイクロチューブに移すことができます。DDTとホスファターゼ阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤を添加したバッファー1200 mLを、サンプルを含むマイクロチューブに加えます。組織が完全に破壊されるまで容器でサンプルを均質化し、氷上に保ちます。サンプルを氷上で10分間インキュベートします。細胞膜を破壊するために、各サンプルに10 mLの1%界面活性剤を最終濃度0.05%まで加えます。氷上で5分間インキュベートします。短時間ボルテックスし、400 gで4度で2分間遠心分離します。細胞質タンパク質画分を含む上清を取り除き、きれいなチューブに移します。ペレットを捨てないでください。DDTおよびホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を添加した200mLの緩衝液2にペレットを再懸濁します。400 gで2分間遠心分離します。上澄みを捨てて、洗濯手順をさらに2回繰り返します。3回目の洗浄後、ペレットを100mLの緩衝液2に再懸濁します。4度で30分間激しく振ってください。最高速度で4度で10分間遠心分離します。核タンパク質画分を含む上清をきれいなチューブに移します。細胞質画分と核画分は、定量および下流実験の準備が整いました。腸粘膜にはいくつかのプロテアーゼが豊富に含まれているため、タンパク質の分解を最小限に抑えるために抽出中にタンパク質の分解を制御する必要があり、複数のプロテアーゼ阻害剤をタンパク質抽出バッファーに含める必要があります。さらに、抽出物は追加のアッセイに使用されます。タンパク質の変性やタンパク質分解を避けることが不可欠です。これはタンパク質活性の損失を引き起こすためです。組織中に存在する細胞-細胞および細胞-マトリックスの接触の結果として、細胞培養で日常的に使用されるタンパク質抽出プロトコルでは、いくつかの修飾を実施する必要があります。タンパク質の品質に影響を与えずに経細胞マトリックスから細胞を分離することは、腸管組織タンパク質を効率的に単離するための重要な要素です。左側の表は、新鮮および凍結の 2 mL 生検サンプルから得られた各画分のタンパク質濃度を示しています。濃度はマイクログラム/マイクロリットルで示されます。この実験では、新鮮サンプルと凍結サンプルをプロトコルに従って同時に分画しました。そして、各サンプルの20 mgを使用してウェスタンブロットを行いました。フラクションの純度を確認するために、HSP90とチューブリンを細胞質コントロールとして、HDAC1とH3を核コントロールとして使用しました。観察できるように、HSP90とチューブリンは主に細胞質に位置し、HDAC1とH3は核内に位置し、2つの画分の間には非常に残留した混合があります。このプロトコルが細胞死に影響を与えるかどうかを確認するために、CASP3も検出しました。どちらのサンプルもCASP3の染色が非常に最小限であり、生検を瞬間凍結した後でもこの手順が細胞死経路に影響を与えないことを確認しています。この実験で使用した凍結サンプルは、腸の炎症性疾患を持つ個人からのものであり、予想通り、このサンプルの細胞質にpSTAT1が現れ、分画後もタンパク質修飾が維持されていることが確認され、下流の機能解析に使用できます。凍結生検の結果の再現性をこの図に示します。フラクションは、最小限のコンパートメントタンパク質混合でクリーンです。これらのプロトコルでは、新鮮生検と凍結生検を同等に使用することができ、図1および図2に示すように、凍結生検はクリーンで再現性のある結果をもたらします。ここで説明するプロトコルは、可能なタンパク質画分を生成するように設計されています。しかし、組織のサイズや状態など、サンプル内の本質的な変動性により、タンパク質の量やフラクションの分布量に偏差が生じる可能性があります。

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接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

このビデオでは、新鮮な凍結神経膠腫組織から単一核を分離するプロトコルについて説明しています。単離された単核は、一核RNA(snRNA)シーケンシングやsnATAC(Single-nuclei Assay for Transposase-Accessible...

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マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

ここでは、凍結胃、小腸、および結腸組織産生細胞から初代線維芽細胞/筋線維芽細胞(MF)培養を分離し、確立するためのプロトコルが提示されます。これは、MF表現型を持つ細胞です。これらの細胞はCD90、α-SMA、ビメンチンを発現します。MFは、酵素活性やサイトカイン産生など、さまざまな機能アッセイに使用できます。...

人間の冷凍消化管標本からCD 90 +線維芽細胞/筋線維芽細胞の単離

このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA...

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937...

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。...

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。...

単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。...

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのための固形腫瘍標本からの核の分離に信頼性が高く最適化されたアプローチを提供し、組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離された核の評価に関する推奨事項を含みます。...

マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)

腸の操作によって生成された術後イレウスのマウスモデルについて説明します。胃腸トランジット機能、病理学的変化、および免疫細胞の活性化は、手術の24時間後に評価されました。...

術後イレウスマウスモデル

学ぶ 細胞質と核タンパク質を分離する細胞分画プロトコル。生鮮および冷凍のヒト腸生検体に適用可能で、タンパク質局在解析や免疫沈降研究を支援します。再現性のある結果が得られます。

生鮮・冷凍の消化試験片から細胞レベル下の分別

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