Name: 作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いたPlasmodium falciparumの条件付きノックダウン変異体作出法。glmSベースの遺伝子編集によりタンパク質機能を解明し、マラリア研究の新たな治療戦略開発に貢献する。

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PUF1 Cas9 と pL6 プラスミドを共有、技術支援のためジョージアの大学 (UGA) 生体顕微鏡コア Muthugapatti Kandasamy とホセ フアン ・ ロペス ・ ルビオ監督に感謝します。この作品は v. m. v. m.、および米国国立衛生ダイム財団 (バジル ・ オコナー スターター学者研究賞) の 3 月から助成金に UGA スタートアップ資金を付与円弧財団賞 D.W.C. と H.M.K.、によって支えられた (R00AI099156 とR01AI130139) 参加して (T32AI060546) H.M.K. に

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</ol>

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マラリアに CRISPR/Cas9 の実装が両方の効率を高め、寄生虫のゲノム、遺伝子操作の以前の方法と比較してを変更するために必要な時間の量を減少します。この包括的なプロトコルでは、マラリアに CRISPR/Cas9 を使用して条件付き変異体を生成するために必要な手順について説明します。ここにメソッドは、具体的には HAglmS変異体の世代向け、この戦略多様なニーズ、遺伝子、遺伝子ノックアウトおよび点突然変異の導入へのタグ付けを含むために適応させることができます。
このプロトコルの重要な初期ステップは gRNA シーケンスの選択です。ときに、gRNA を選択すると、gRNA が座っている、どのように効率的なだ、オフターゲット効果の可能性があるかどうかなどを検討するいくつかのポイントがあります。GRNA シーケンスは変更、理想的には 200 塩基以内のサイトにできるだけ近くする必要があります。修理テンプレートを使ってタグを統合せずにそのゲノムを解決する寄生虫の可能性を減らします。ここで、gRNA を検索するためのツールだった CH...

マラリアは、マラリア原虫属原虫によって引き起こされる壊滅的な病気です。マラリア、ほとんど致命的な人間のマラリア原虫の 51歳未満の子供を中心に、年間約 445,000 死亡を原因します。原虫媒介蚊と脊椎動物のホストを含む複雑なライフ サイクルがあります。人間最初に感染感染した蚊は吸血します。その後、寄生虫はどこに成長、成長して約 1 週間分割肝を侵入します。このプロセスの後、寄生虫は赤い血球 (赤血球) の無性複製を受ける血流に解放されます。赤血球内寄生虫の成長はマラリア2に関連付けられている臨床症状の直接責任があります。
最近まで、トランスジェニックマラリアの生産は、何ヶ月かかったし、高い故障率があった医薬品の選択のいくつかのラウンドを含む、骨の折れるプロセスをだった。この時間のかかる手順 relieson 関心領域とそのゲノムをも修復する寄生虫の内因性の能力ランダム DNA の世代改相同修理3,4,5,6.最近では、クラスター化された定期的に空間回文繰り返し/Cas9 (CRISPR/Cas9) ゲノム編集活用されている正常にマラリア7,8。マラリア研究のこの新しい技術の導入は、これらの致命的な原虫の生物学の理解を進めるために重要されています。CRISPR/Cas9 ガイド Rna (gRNAs) 興味の遺伝子に相同性のある遺伝子の特定の目標が可能です。GRNA/Cas9 複雑な認識、gRNA、遺伝子、Cas9 は、生物9,10の修復メカニズムの開始を強制二重鎖切断を紹介します。マラリア非相同末端結合を介して DNA 切断修復する機械に欠けている、のでそれは相同組換え機構を利用し、Cas9/gRNA 誘導を修復する transfected 相同 DNA テンプレートを統合二重鎖切断11,12。
ここでは、プロトコルを提案マラリアでノックダウン変異体条件の世代の CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用しています。PfHsp70x の条件付きでノックダウン蛋白質のレベルにglmSリボザイムの使用するプロトコルを示します (PF3D7_0831700)、シャペロンによってエクスポートされたマラリアのホストに赤血球13,14。GlmSリボザイムはグルコサミン (これは細胞のグルコサミン-6-リン酸に変換する) 処理によるタンパク質14の削減につながる、その関連付けられている mRNA を切断するアクティブになります。このプロトコルは、不安定化ドメインまたは RNA アプタマー4,5,15などの他の条件のノックダウン ツールを活用する簡単に適合できます。我々 のプロトコルの詳細コーディング シーケンス シーケンスが並ぶヘマグルチニン (HA) タグとglmSリボザイムから成る修理プラスミドの世代のある PfHsp70x オープンリーディング フレーム (ORF) と 3' UTR に相同性です。ドライブ式、gRNA の 2 番目のプラスミッドの世代についても述べる。これら 2 種のプラスミド、Cas9 の式を駆動する第三と一緒に、赤血球にトランスフェクションし、マラリア寄生虫のゲノムを変更するために使用します。最後に、我々 はポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を記述する-ベース タグとglmSリボザイムの統合を確認する手法です。このプロトコルは、変更または強化してマラリア原虫の生物学に新しい洞察力を生成する任意のマラリア遺伝子の完全なノックアウトの小回りです。

<table><tbody><tr><td>遺伝子パルサー Xcell エレクトロポレーター</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>私たちは、個別に包装されたものを購入</td></tr>します <tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Akhil Vaidyaラボからの贈り物</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem.パラシトール。2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td> <td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td> <td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td> <td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td> <td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td> <td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td> <td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td> <td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL ステリトップボトルトップフィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU10RE</td> あなたの<td>ニーズに合った任意のサイズを使用できます</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<サブ>2</サブ>シ</td><td>グマ-アルドリッチ</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Generated by the Muralidharan Lab</td><td></td> n/<td></td></tr><tr><td></td>a<td>pHA-glmS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>ヒポキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン試薬</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>チミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr> によって生成された <tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>Muralidharan Lab</td><td></td><td></td>によって生成された</tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td> あなたは、寄生虫が最高のヒト赤血球州間血液銀行、Incで<td>成長するものを見つけるためにいくつかのバッチを試してみたいと思うでしょう</td></tr><tr><td></td><td></td><td>電子メールまたは注文のために直接それらを呼び出します</td><td>私たちは通常、O +血液</td></tr><tr><td>3D7寄生虫ライン</td>を使用します <td>リクエストに応じて利用可能</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>リソジェニーブロス(LB)</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1426-2</td><td>あなたはあなた自身のものを作ることができます、それは正確にこの</td></tr><tr><td>Ampicilin</td>フィ<td>ッシャーBP1760-25</td><td>を使用する必要はありません 私たちは水で100mg / mlで1000Xストックを作り、-20Cで保存</td><td></td></tr>します <tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>博士ダニエル・ゴールドバーグの研究室</td><td>セントルイスのワシントン大学</td><td>あなたは西部のしみのためのあなたの好みのローディングコントロールを使用することができます。これはちょうど私達が私達の実験室でラット</td></tr><tr><td>の抗HAのクローン3F10、モノクローナル</td><td>ロシュによってなされ、シグマ</td><td>によって</td>販売される <td>11867423001 あなたの好みの抗HA抗体</td></tr><tr><td>0.6 mLの管</td>を使用することができます <td>フィ</td><td>ッシャーAB0350</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーヘルスケア* プロトコル* ヘマ3 *手動染色システム (固定剤+溶液IおよびII)</td> フィ<td>ッシャー22-122-911</td><td>あなたはまた、ギムサの汚れ</td><td></td></tr><tr><td>を使用することができますFisherfines プレミアム フロスト マイクロスコープ スライド - サイズ: 3 x 1 インチ</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに crispr/cas9 遺伝子の編集

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

マラリア罹患率と死亡率の世界の重要な原因であります。主に熱帯および亜熱帯地域に住んでいる人に影響を与える、この病気は、原虫の感染が原因です。マラリアと闘うためにより効果的な薬の開発は、この複雑な寄生虫の生物学の私達の理解を改善することによって加速することができます。これらの寄生虫の遺伝子操作の生物学を理解する鍵は、します。しかし、歴史的にマラリアのゲノムが難しかった操作します。最近では、容易に蛋白質のタグ付け、条件付きタンパク質ノックダウンの発生と遺伝子の削除を可能にするマラリア原虫に CRISPR/Cas9 ゲノム編集を利用されています。CRISPR/Cas9 ゲノム編集はマラリア研究の分野を進めるための強力なツールであると証明しました。ここで、 glmSを生成するための CRISPR/Cas9 手法について述べる-基づくマラリアでノックダウン変異体条件付き。このメソッドは、適応性の高いタンパク質タグを含む、遺伝子操作、遺伝子のノックアウトの他のタイプです。

シールドの突然変異の例と同様、このメソッドで使用されるプラスミドの模式図は、図 1のとおりです。トランスフェクション後突然変異体の寄生虫を識別する方法の例として図 2に HAglmSコンストラクトの統合をチェックするため Pcr の結果が表示されます。クローン板の代表的な画像は、寄生虫の存在下で培地の色の変化を示すため、図 3に示すが。蛍光抗体法と西部のしみが付く実験からの結果は、HA タグとglmSの機能を示す図 4に示す-寄生虫の蛋白質の削減をしました。図 5は、寄生虫のゲノムを変更し、実行可能な突然変異体を取得する PCR の製品の短いホモロジー腕の無力を示しています。
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GlmSを生成する手法について述べる-熱帯熱マラリア原虫CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用して条件付きノックダウン変異体を用いた。

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

この方法は、条件付きノックダウンを通じてタンパク質機能を明らかにすることによって、ヒトマラリア寄生虫P.Falciparumの生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、以前の方法と比較して、比較的簡単に条件付き変異体を生成できることです。まず、チョップチョップに行き、Fasta Target'Under Targetを選択し、遺伝子の3つのプライム読み取りフレームの3つのプライムエンドから200塩基対をペーストし、遺伝子の3つのプライムUTRの開始から200塩基対をペーストします。[P.Falciparum'] で[CRISPR/Cas9'Using'Next]を選択し、[ターゲットサイトを検索]をクリックし、提示されたオプションからgRNAシーケンスを選択し、変更部位に最も近く、ターゲット外サイトが最も少ない最も効率的なgRNAを優先します。gRNA配列とその逆補体をポリアクリルアミドゲル電気泳動精製オリゴとして購入します。PfH-sp70xを標的とするgRNA配列は、テキストプロトコルで見つけることができます。pMK-U6、pUF1-Cas9、およびpHA-glmS DNAをそれぞれ40マイクログラムを無菌1.5ミリメートル遠心分離管に加えます。水中の酢酸大臼歯ナトリウム3モルのDNAの体積の10分の1をチューブに加え、渦を使用してよく混ぜます。その後、チューブに100パーセントのエタノールの2.5倍の体積を加え、少なくとも30秒間渦を使用してよく混ぜます。チューブを氷の上に置くか、マイナス20度で30分間置きます。次いで、チューブを摂氏4度で30分間18、300倍Gで遠心する。遠心分離後、ペレットを邪魔することなくチューブから上清を慎重に取り除きます。70%のエタノールの3倍の体積をチューブに加え、渦を使用して簡単に混ぜます。チューブを摂氏4度で30分間18、300倍Gで遠心する。再度、ペレットを邪魔することなくチューブから上清を慎重に取り除きます。チューブを開けたままにして、ペレットを15分間空気乾燥させます。沈殿したDNAは、トランスフェクションに必要になるまでマイナス20度で保管してください。Rbcsをトランスフェクトするには、テキストプロトコルに記載されているように、1Xサイトミックスバッファと不完全で完全なRPMIを準備します。フィルターは0.22ミクロンフィルターを使用してバッファーを殺菌する。DNAと渦に380マイクロリットルの1Xサイトミックスを加え、溶解する。DNAを1Xサイトミックス中に10分間溶解させ、3分ごとに10秒間渦を起こさせる。滅菌、15ミリリットルの円錐管では、不完全なRPMI内の300マイクロリットルの孤立したヒトRBCを、1Xサイトミックスの4ミリリットルと組み合わせます。RbCsを870倍Gで3分間遠心する。その後、RBCペレットから上清を除去します。DNA-サイトミックス混合物でRBCペレットを再懸濁し、0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。テキストプロトコルにリストされている条件を使用して、RBCをポレートします。エレクトロポレーションの後、キュヴェットから完全なRPMIの5ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に内容物を移す。チューブを摂氏20度で3分間870倍Gで遠心分離する。その後、上清をデカントします。さて、完全なRPMIの4ミリリットルでペレットを再中断し、6ウェル組織培養プレートの1つの井戸に移す。移されたRBCsに高いシゾント培養物の400マイクロリットルを加え、すべての培養物を3%の酸素、3%のCO2、94%の窒素の下で摂氏37度に維持します。翌日、完全なRPMIの4ミリリットルで培養を洗います。培養物を870倍Gで3分間遠心する。上清を吸引する。完全なRPMIの4ミリリットルで培養を再中断する。48時間後、完全なRPMIの4ミリリットルで培養物を洗う。次いで、1つのマイクロモルDSM1を含む完全なRPMIで培養を再中断し、Cas9プラスミドを選択する。この時点の後、培養培地を、48時間ごとに新鮮な完全RPMIと1マイクロモルDSM1に交換します。血の塗り傷によって寄生虫が見えなくなるまで、完全なRPMIで毎日培養物を洗浄し続けます。血液スミアを作るために、ピペット150マイクロリットルの培養物を0.6ミリリットル遠心分離管に入る。1で遠心分離により細胞をペレット化した後、Gを700回30秒間、上清を吸引した。ピペットを使用してペレット化した細胞をガラススライドに移します。第1のスライドに45度の角度で保持された第2のガラススライドを使用して、血滴を塗りつぶす。メーカーのプロトコルに従って市販の染色キットを使用してスライドを染色します。100倍の油浸しの目的を使用して寄生虫を表示します。トランスフェクション後5日間から、培養培地中で再懸濁したRBCで2ミリリットルの培養液を除去する。2%のヘマトクリットで新鮮な培地と血液の2ミリリットルを追加します。薄い血液塗抹標本によって決定されるように、寄生虫が再び現れるまで、週に一度この方法で新鮮な血液を追加します。200マイクロリットル当たり0.5寄生虫の最終濃度を達成するために、寄生虫培養の連続希釈を行う。96ウェル組織培養プレートのウェルに希釈培養液200マイクロリットルを加えます。寄生虫が井戸内で検出されるまでクローニングプレートを維持します。48時間ごとに、96ウェルプレートの培地を新鮮な培地に交換します。週に1回、クローニングプレートを開始してから5日後に開始し、各ウェルから100マイクロリットルを取り除き、新鮮な媒体と血液の100マイクロリットルを追加します。寄生虫を含むウェルを特定するには、96ウェルプレートを約20分間45度の角度で配置し、血液がプレート内の角度で沈着するようにします。その後、ライトボックスの上に96ウェルプレートを置きます。寄生虫を含むウェルには、寄生虫による培地の酸性化により、寄生虫を含まないウェルのピンク色の培地と比較して黄色の培地が含まれていることに注意してください。血清ピペットを使用して、寄生虫含有井戸の内容物を24ウェル組織培養プレートに移動させて、寄生虫の増殖を可能にする。PCR 分析を使用して、これらのクローンの寄生虫ラインを確認して、正しい統合を確認します。免疫蛍光アッセイの結果をここに示し、PfH-sp70xの正常なHAタグ付けを示す。PfH-sp70x glmS寄生虫を固定し、核マーカーとしてDAPIと、ならびにHAに対する抗体を染色した。膜関連ヒスチジンリッチタンパク質1は、宿主RBCにエクスポートするタンパク質のマーカーである。グルコサミン処理後のPfH-sp70xタンパク質レベルのウェスタンブロット分析をここに示す。予想通り、タンパク質レベルは治療期間中に減少する。この技術は、寄生虫学の分野の研究者がマラリア原虫の生物学における根本的な疑問を調査する道を開きます。P.Falciparumは血液媒介病原体であり、この手順を実行している間は適切な個人用保護具を着用する必要があることを覚えておくことが重要です。

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遺伝学

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学ぶCRISPR/Cas9を用いたPlasmodium falciparumの条件付きノックダウン変異体作出法。glmSベースの遺伝子編集によりタンパク質機能を解明し、マラリア研究の新たな治療戦略開発に貢献する。

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