AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析
2018年8月22日
このプロトコルは、アフィニティ キャピラリー電気泳動キャピラリー電気泳動と荷電配位子の高速バインド スクリーニングによる蛋白質のサンプルの特性を兼ね備えています。天然変性タンパク質などの柔軟な構造を持つタンパク質は、異なる conformers のバインドの違いを決定するそれをお勧めします。
この方法は、金属鉄の結合による構造変化など、天然変性タンパク質のテクトニクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、必要な機器が非常に少なく、結果が非常に迅速に得られることです。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるMatthias Steinです。
まず、ガラスプレート上のガラスカッターを使用して、ポリアミドの外部コーティングと内径50ミクロンの裸の溶融シリカキャピラリーを33センチメートルと30センチメートルの長さに切断します。CGE実験ではキャピラリーの一端から24.5センチメートルの距離、ACE実験ではキャピラリーの一端から21.5センチメートルの距離で、幅1センチメートルの検出ウィンドウの中央をペンでマークします。ブロートーチを使用して、各マークの前後0.5センチメートルでポリアミド外部コーティングを焼き払います。
同様に、ブロートーチを使用して、毛細血管の両端にあるコーティングを1センチメートル取り除きます。次に、エタノールと軟組織を使用して、毛細血管の端と検出ウィンドウを清掃します。キャピラリーをCEシステムに取り付け、検出ウィンドウをコンセントの近くに設置します。
溶液を調製した後、テキストプロトコルに従って、250マイクロモルの塩化カルシウム溶液を使用して10ミリリットルの注射器を満たします。次に、0.2ミクロンのPVDFフィルターをシリンジに取り付け、2ミリリットルの溶液をフィルターに押し込んで廃棄します。シリンジに残っている塩化カルシウムを使用して、最大許容容量まで10バイアルを満たします。
各バイアルを250マイクロモルの塩化カルシウム溶液インレットバイアルとしてラベル付けします。次に、塩化カルシウム溶液を使用して、10バイアルを半分まで満たします。それぞれを250マイクロモルの塩化カルシウム溶液出口バイアルとしてマークします。
次に、他の金属塩含有溶液を使用して、同様の方法でバイアルを充填します。さらに、インレットバイアルとアウトレットバイアルの各ペアについて、30マイクロモルのTris Bufferを使用して、インレットバイアルとアウトレットバイアルの同様のセットを調製します。60マイクロモルのアセトアニリドEOFマーカーで、10バイアルを充填します。
次に、1ミリグラム/ミリグラムのサンプル溶液を使用して、1つのバイアルを充填します。分析を準備した後、テキストプロトコルに従って、CGE実験用のサンプル溶液を流体力学的に注入し、入口で0.1バールを4分間適用して分離を実行します。次に、キャピラリーの両端に負の16.5キロボルトと2.0バールの圧力を25分間印加します。
リガンドを使用しない測定法を調製した後、まず0.1モルのEDTA溶液を使用してキャピラリーを2.5 barで1分間すすぎ、リガンドを用いた測定法を調製します。次に、脱イオン水を使用してキャピラリーをすすぎます。次に、リガンド溶液を使用してキャピラリーを平衡化し、2.5バールで1.5分間すすぎます。
次に、アセトアニリド溶液を0.05バールで6秒間注入し、入口と出口のバイアルを緩衝バイアルを含むリガンドに変更します。0.05バールを2.4秒間塗布して、アセトアニリド溶液をキャピラリーの先端からさらに押し込みます。10.0キロボルトを6分間印加し、200ナノメートルの波長で資産のアセトアニリドピークを検出します。
キャピラリーをEDTA脱イオン水とリガンド溶液ですすいだ後、前と同様にタンパク質サンプルを注入し、入口と出口のバイアルを新しいリガンド含有緩衝バイアルに交換します。あるいは、リガンドの有無にかかわらず測定を繰り返します。次に、アルカリ土類配位子溶液を使用して方法を繰り返します。
最後に、次の解決策を使用して同じ方法を実行します。次に、さまざまなタンパク質金属イオン相互作用の電荷サイズ比の変化を計算します。ここに示されているのは、CGE実験中に得られたAtHIRD11サンプルのエレクトロフェログラムです。
ペプチドサイズは左から右に増加します。ピーク番号 4 は質量が最も大きく、無傷のタンパク質を示します。小さい方のピーク(2つと3つ)は、不純物が小さいことを表します。
この図は、ACE実験中のアセトアニリドのエレクトロフェログラムを表しています。アセトアニリド溶液は、不純物を含まないはずであるため、高いピークが1つだけを示します。ピーク最大値の検出時間は、電気浸透流の移動時間を示し、相互作用の計算に使用されます。
ACE実験中のAtHIRD11サンプルのこのエレクトロフェログラムは、SDSおよび金属イオンの非存在下で行われました。CGEエレクトロフェログラムからの2つの不純物の他に、タンパク質自体に関連する少なくとも5つのピークが存在します。ここでは、ピーク 6 のさまざまな金属イオンの存在下で測定された移動時間シフトのグラフィカル評価を示します。
これは、計算値 Delta R over RF で表されます。各結果は、その値と、タンパク質金属イオン複合体の電荷の全体的な変化によって示されるその符号によって、シフトがどれほど強く発生したかを示しています。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、CGEインタラクションを含めて8時間で1人のインタラクションパートナーに対して行うことができます。この手順を試行する際は、分解生成物が時間の経過とともに増加する可能性があるため、長時間の測定のためにタンパク質溶液を変更すること、およびより正確な結果を得るためにTris Buffer溶液を変更することを覚えておくことが重要です。
このビデオを見れば、キャピラリーの切断方法とクリーニング方法、および内因性変性タンパク質の結合挙動を評価するためのアフィニティーキャピラリー電気泳動法の設定方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、キャピラリーゲル電気泳動によるタンパク質試料の特性評価と、アフィニティーキャピラリー電気泳動による電荷を持つリガンドの高速結合スクリーニングを組み合わせて行います。これは、本質性不規則タンパク質などの柔軟な構造を持つタンパク質において、さまざまなコンフォーマー間の結合の違いを評価するのに特に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- 電気泳動
- タンパク質特性解析
背景
- 内在的に無秩序なタンパク質は、柔軟な構造を示します。
- これらの結合特性を理解することは、さまざまな生物学的プロセスにおいて極めて重要です。
- キャピラリー電気泳動法により、迅速な解析が可能になります。
- この手法は必要となる装置が最小限であるため、多くの研究室で導入が可能です。
研究目的
- タンパク質試料を効果的に特性解析すること。
- 電荷を持つリガンドを迅速にスクリーニングすること。
- リガンド結合による構造変化を調査すること。
使用した手法
- タンパク質キャラクタリゼーションのためのキャピラリーゲル電気泳動（CGE）。
- リガンドスクリーニングのためのアフィニティーキャピラリー電気泳動（ACE）。
- 特定の寸法を持つ溶融シリカキャピラリーの調製。
- 実験用にキャピラリーを加工するためのガスバーナーの使用。
主な結果
- この手法により、最小限の設備で迅速に結果を得ることが可能です。
- 内在性無秩序タンパク質の解析における有効性が実証されています。
- リガンド結合に伴う構造変化の理解を促進します。
- タンパク質相互作用に関する今後の研究に向けた信頼性の高いプロトコルを提供します。
結論
- このプロトコールは、タンパク質-リガンド相互作用を研究する研究者にとって有用なツールとなります。
- これにより、柔軟なタンパク質構造への理解が深まります。
- 今後の応用として、タンパク質ダイナミクスに関するより広範な研究などが考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
本質的に無秩序なタンパク質（IDP）は、植物のストレス応答経路において重要な役割を果たしており、農業バイオテクノロジーにおけるターゲットバリデーションには、これらの特性評価が不可欠です。キャピラリーゲル電気泳動（CGE）とアフィニティーキャピラリー電気泳動（ACE）を組み合わせることで、コンフォメーション変化や金属イオン結合挙動を、少量のサンプルで迅速に評価でき、初期探索段階におけるメカニズムのデリスキングを支援します。このアプローチは、環境ストレスシグナリングが関与する疾患関連システムにおいて、IDPとリガンドの相互作用をスクリーニングするための予測的な信頼性を提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：天然変性タンパク質（IDP）の金属イオンに対するコンフォーマー特異的な結合シフトを解明することで、治療仮説を検証します。
- 運用的価値：最小限のサンプル量と試薬消費で、リガンド誘導性の構造変化を迅速にスクリーニングすることを可能にします。
- 予測的価値：モビリティシフト解析を通じて、特異的結合と非特異的な干渉を区別し、標的に対する信頼性を裏付けます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： リガンド結合親和性の順位付けを可能にする、定量的従属変数測定値（移行時間のシフト）を提供します。
- 運用の価値： キャピラリーの自動洗浄および平衡化ステップにより、アッセイの標準化を促進します。
- 拡張性： 同一キャピラリー内での連続的なバッファー交換を用いた、マルチプレックス・リガンドスクリーニングに対応しています。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的な連続性：in vitroの結合データを植物のストレス応答経路へと結びつけ、乾燥や塩類ストレスモデルにおける表現型スクリーニングに役立てます。
- メカニズム的なリスク低減：観察された効果が直接的な金属結合によるものか、あるいは二次的な修飾によるものかを明確にし、標的バリデーションにおける偽陽性を減少させます。
- 前臨床モデルの妥当性：酸化ストレスおよび浸透圧ストレスのメカニズムを研究するための、疾患に関連したシステムとしてAtHIRD11の使用を支持します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの検証からリード化合物の同定に至る創薬のコンティニュアム（連続体）に適合し、特にストレスシグナル伝達経路における金属調節によるIDP相互作用のスクリーニングに有用です。
- 探索生物学：金属イオンがIDPのコンフォメーションおよび電荷状態に及ぼす影響を単離することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：制御されたバッファー条件下でのリガンド結合を評価するための、再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分析：Delta R over RF値の算出を可能にし、複数の金属リガンドにおける結合誘起の電荷サイズシフトを定量化します。
- トランスレーショナルリサーチ：IDPのコンフォメーション状態がストレス耐性表現型と相関するバイオマーカー探索の取り組みと整合します。
- 企業での再利用：キャピラリーベースのプラットフォームは、金属イオン以外の他の電荷リガンドにも適応可能であり、長期的な有用性を高めます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 異なるコンフォーマー集団とそのリガンド特異的な応答を解明することで、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用の価値： 標準化されたキャピラリーの調製、洗浄、および平衡化プロトコルを通じて、再現性を確保する。
- 戦略的価値： 非結合リガンドを迅速に特定することで、hit-to-leadキャンペーンにおけるリソースを節約し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みのリガンド結合プロファイルに基づき、IDPターゲットのリスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- キャピラリーの切断、コーティングの除去、および検出ウィンドウの調整を含む、キャピラリー電気泳動装置のセットアップに関する専門知識が必要です。
- 流体動学的注入および高電圧分離（最大16.5 kVまで）が可能なCEシステムの利用が前提となります。
- 再現性のある移動時間の測定を確実にするため、緩衝液条件（例：Tris、EDTA、リガンド溶液）のチーム間での標準化が必要です。
- 他のタンパク質系に適応させる場合は、試料濃度、リガンドのインキュベーション時間、およびキャピラリーの平衡化ステップの最適化が必要になる場合があります。
- 実用的な制限：結合部位の数を決定することができないため、詳細な化学量論的分析は制限されます。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Preparation of Capillaries
1:45
Vial Preparation and Affinity Capillary Electrophoretic Separation
3:34
Affinity Capillary Electrophoretic Analysis - Preparation for ACE Methods
5:20
Results: Characterization of AtHIRD11 by Affinity Capillary Electrophoresis and Capillary Gel Electrophoresis
6:59
Conclusion
