Name: ラッパムシの再生の研究のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ単細胞レベルでの再生と創傷治癒のメカニズムをStentor coeruleusを用いて解明する方法。このプロトコルは細胞培養の確立、再生の誘導、および分析の詳細な手順を提供し、細胞生物学研究の基盤となる。

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この作品は、NIH グラント R01 GM113602 (WFM) と NSF 1144247 (AL) によって支持されました。我々 は、有益な議論では、これらのプロトコルのいくつかの初期のバージョンを開発するため、マーク Slabodnick とナタリー カークランドを認めます。原稿の批判的な読み、カリーナ Perlaza とグレイソン ・ ルイスに感謝します。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ラッパムシを養殖の課題の数を示します。多数のセルを必要とする実験を実行するまず、ラッパムシ濃度 20 セル/mL を超えると不健康になる文化としてラッパムシ文化の多数を維持するためにであります。第二に、しばしばラッパムシ文化を汚染できる生物はラッパムシより分割し、(一般的な汚染物質はワムシ) 文化を圧倒します。したがって、顕微鏡下で培養を定期的に検査し、汚染物質を除去する必要は。時折、新しい文化は、汚染された文化から手動で救出された細胞の数が少ないから開始する必要があります。これは健康ラッパムシ文化を維持するために必要な時間が増加します。第三に、単一のセルを 400 mL 文化に進出と、ラッパムシ細胞周期は 3-5 日ために、少なくとも 1 ヶ月を必要です。第四に、他のモデルとは異なりと嚢胞フォームに繊毛虫ラッパムシ稀に凍結することはできません。
ラッパムシを養殖の重要な側面は、適切な食品の有機体の選択です。ラッパムシを培養するためのさまざまな方法が説明しました。それらの 1 つは、ラッパムシを供給するバクテリアを培養するスキムミルクを使用するように提案します。このような手法は養殖ラッパムシ; 効果的です。しかし、ゲノム技術のアプリケーションでは、未定義の餌生物からゲノムの読み取りによる混乱を避けるために純粋なサンプルが必要です。現在のプロトコルを使用して、ラッパムシを大量に育てることができる、彼らの食糧、クラミドモナスが配列されているので食品有機体からの遺伝子汚染の存在することができます検出および制御します。未知の理由のため歯石を前にラッパムシを見つけた彼に戻って彼の在庫を補充するために持っていた。現在のプロトコルでは、長年ラッパムシを維持できました。
ラッパムシ再生実験は一般に簡単ですが、留意すべきいくつかの重要な詳細があります。ラッパムシを切断に関してセクション 2 分で半分のセルを習得できます。ラッパムシのより高度な手術の手順をマスターすると、1 週間練習が必要があります。一方、スクロース処理が次に実行されるときの 10-30 s インキュベーション時間を増やす蔗糖あるいは尿素治療 (セクション 3)、イメージングの初めにほとんどの細胞はまだ自分たちの membranellar のバンドがある場合を実行します。それは細胞死になりますので 3 分インキュベーションを超えてスクロース処理の時間を増やさないでください。
ラッパムシの画像再生時間の長い期間にわたって大型細胞をイメージする方法が必要です。セクション 4 で詳細なイメージング法は、正立型顕微鏡でのみ使用できます。倒立顕微鏡が利用できる代わりに、スライドまたは小型チャンバーの coverslip のセルが配置できます。1 つの方法は、蒸発を防ぐために別の coverslip でワセリンとカバーの商工会議所を作成します。1 × 1 cm2のシリコン スペーサーの正方形で希望のサイズの穴を開けると穴を作るで、個々 のセルの商工会議所または、可能 (材料表)、観察にスペーサーを配置すること、商工会議所のセルを置くこと、と別の coverslip の商工会議所をカバーします。ラッパムシは、再生の各段階の特徴を観察する向きが正しいされていない場合、イメージング、携帯契約させるしっかりとプレートをタップします。細胞の再生の段階を識別するために拡張を見る (完全な拡張は約 45 秒)。間違った方向のセルでは、タップを繰り返します。図 1と図 6に示すように画像が撮影されたステレオ ズーム顕微鏡;ただし、詳細すべての実験は、実体顕微鏡を切り裂く X 5 を使用して実行できます。
養殖やラッパムシをイメージング以外の別の挑戦再生、特に段階を識別するために必要な時間の量の追跡であります。再生細胞がはっきりと見える口腔原基の領域と完全に指向の場合、ステージの同定は数秒をかかります。場合によっては、ただし、ラッパムシセルがので識別するより多くの時間を割いて、再生段階の明確な割り当てを防止する方向で。再生細胞が待機するオブザーバーを必要とするステージングの時間精度の減少、すべての再生細胞の定量を遅れる可能性がありますステージとイメージを再作成後にセルに移動に必要な時間のかなりの量新しい向き。したがって、この実験は時間と労力がかかりました。これらの理由から、ラッパムシ細胞を検出し、ビデオ顕微鏡検査データの再生の段階を割り当てるのための自動方法を開発する非常に望ましいでしょう。これらはまたより多くの再現実験に、サンプル サイズ、および人間バイアスの除去で増加します。
高感度の genomic および proteomic 方法の出現は、リーチに単一細胞の研究を入れてし始めています。このような単一細胞解析のラッパムシセルの巨大なサイズ概念実証実験のため、望ましいテストの対象になります。可能にするそのような実験のためラッパムシの養殖が、基本で、ここで説明する方法より高度な単一セル技術の更なる発展に役割を果たすべきので。

細胞は、酵素ではなく非常に複雑な機械要素を慎重に適切なサイズにスケールおよび明確に定義された位置に配置がシンプルなバッグではありません。個々 の細胞の形態形成は、細胞・発生生物学の重要なプロセスを表しますが、その分子機構は不明な1,2。いくつかの培養細胞塊に似ている、その単細胞生物に、非常に複雑なのアーキテクチャ、繊毛虫3,4に見られる複雑な皮質パターンに代表される持っていることができます。
おそらく高度な構造セルの最も極端な例は、巨大な heterotrichous の繊毛虫テトラヒメナゾウリムシのの遠縁ラッパムシ、です。ラッパムシ1 mm 長いは、セル全体の長さが実行される微小管リボンの並列スタック主催繊毛の行交互青色色素の以上 100 の縦ストライプで覆われます。セルはトランペット形 (図 1)、membranellar バンドとその前方の端と後部で基板にセルをアタッチ ホールドファスト口腔装置 (OA)。クリア前後極性に加えて、セルは間隔毛様体行徐々 に時計回りの方向に増加するように独特のキラル パターニングも示しています。これは、結果、狭い行が最も幅の広い行およびセル表面のこの地域を満たす不連続に前方構造別セル5、接ぎ木の 2 番目のセットの形成を誘導することができますストライプのコントラストの軌跡として知られ、正式のオーガナイザーと同等となっています。したがって、発生生物学のすべての主要プロセスは、ラッパムシの類似をある: axiation、パターン形成と誘導。胚、ラッパムシは異なる細胞の間、これらのプロセスが運命の違いによって駆動される、彼らは単一のセル内の異なる領域の運命の違いによって駆動される必要があります。ラッパムシの内の領域の違いを定義するものは謎です。
ラッパムシの任意の部分が途中で切れている場合、セルの行方不明の部分は時間の問題で正常な細胞を生成する再生成できます。セルがある場合で、各部分の半分、あるいははるかに小さい部分にカット普通しかし小さい細胞に再編成し、セル部品6、7の間に適切な比例を復元します。小さな断片、1/64th元のセルのサイズが小さいが均整通常細胞として再生して、フル サイズ6にすることができます。ラッパムシは、こうしての通常の組織または個体レベルで適用される手術方法を使用して細胞器官サイズ スケーリングと細胞成長調節機構を研究するユニークな機会を示します。
ラッパムシ手術操作の広い範囲から再生成することができますのプロパティの 1 つは8の全体のゲノムの約 50,000 枚とシングル着生大核 (図 1) が含まれていることです。細胞断片にゾウリムシの少なくとも 1 つのノードが含まれている限り、それは完全に再生成する能力を持ってください。ラッパムシの再生能力の基になる別のプロパティは、その驚異的な創傷治癒能力です。多くの細胞のタイプが9自分の傷の治癒が可能、ラッパムシは物理的な摂動の異常な範囲から回復することができます。以前ラッパムシ10で細胞質流動を可視化する方法とともに、抜本的な摂動からラッパムシ復旧の例は報告されなかった。これらのメソッドによりどのように負傷とそれに続く再生の影響の研究、細胞の物理的な状態。
ラッパムシの巨大なサイズ、異常な再生能力と、それが多細胞の胚 (主催者、axiation、パターニングなど) に見られる発達現象の多くをマニフェスト実際集めて中に多く発達生物学者トーマス ・ ハント ・ モーガンの7を含む最後の世紀の変わり目。50 年代、60 年代の間には、顕微鏡下の方法は、この単一 celled の有機体11の再生・形成過程の驚くべき配列を紹介されて。ただし、ラッパムシ最近開発された分子生物学モデル システムとしてのみ。過去数年、ラッパムシのゲノムは配列された、8を組み立て、餌で RNAi を用いた遺伝子発現を摂動する術が開発した12。
ラッパムシは現代分子生物学のみのモデル生物にした理由の一つは最近成長の長い細胞周期 (3 ~ 5 日) による大規模な文化の難しさがあった。ただし、現代の genomic および proteomic 方法ラッパムシ単細胞のボリュームは単一の分析のために開発された超高感度の方法に頼ることがなく、これらのメソッドは、十分な彼らには使用より少ない材料が必要ラッパムシよりはるかに小さいされているセル。プロトコルのセクション 1 は、単一のラッパムシセルから大規模な文化を確立するための手順を詳しく説明します。セルを切断して得られる細胞片から大規模な文化を確立する同じ方法を使用することができます。セクション 1 は、時間の長い期間にわたって健康ラッパムシ文化を維持するためのガイドラインを提供します。プロトコルのセクション 2 は、ガラス針で細胞を手動で切断することによって細胞の再生を誘導するための方法論を提供します。プロトコルのセクション 3 は特定のセル構造体 (membranellar バンドと口腔装置) の再生を誘導する 2 つの方法に捧げられて: 続いて、これらの構造の脱落につながる蔗糖あるいは尿素とセルを扱う、再生。プロトコルのセクション 4 では、時間の長い期間にわたって個々 の再生細胞のイメージング法を詳しく説明します。セクション 4 は、再生と再生のダイナミクスの解析のヒントの段階の説明で終わります。

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus 生きた文化</td><td>カロライナ生物供給</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii 寒天</td><td>カロライナ生物供給</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>低温殺菌された湧き水、1クォートボトル</td><td>カロライナ生物供給</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース、1500 cP</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>パイレックス ガラス スポット プレート</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>広口ガラス瓶 スクリューキャップ付き、60 mL</td><td>カロライナ バイオロジカル サプライ</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>ガラス蓋付き 2 カップ ガラス容器</td><td>パイレックス</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell シリコン シート素材</td><td>グレース バイオ ラボ</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリー クラーク</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>カバー ガラス</td><td>フィッシャー finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP 増殖培地、Chlamydomonas 培養用に最適化</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>シリコンスペーサー、CultureWell シリコンシート、厚さ 0.25mm /13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン、ワセリン、ホワイト</td><td>スペクトル</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管. OD:1.2 mm、ID:0.9 mm、長さ:10 cm。</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー P-87</td><td>サッターインスツルメント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステミ 2000 実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクシオズーム V16、ステレオズーム顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ラッパムシの再生の研究のための方法

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

セルは外部摂動から回復するためのパーツを再生することができる必要があります。単細胞の繊毛虫ラッパムシ創傷治癒研究に優秀なモデル生物とそれに続く細胞の再生です。ラッパムシゲノム RNAi などの現代分子生物学方法と共に最近では、利用可能になった。これらのツールは、分子レベルで単一細胞の再生を検討することが可能。プロトコルの最初のセクションは、単一細胞または細胞の断片、ラッパムシ文化を維持するための一般的なガイドラインに沿ってからの培養細胞確立ラッパムシをカバーしています。ラッパムシを大量に養殖生化学、シーケンシング、および質量分析のような貴重なツールを使用することができます。プロトコルの後続のセクションはカバーラッパムシの再生を誘導するさまざまなアプローチです。ガラス針で細胞を手動で切断には、セルの前にある特定の構造の再生を勉強できます蔗糖あるいは尿素とセルを扱う大細胞部品の再生を勉強することができます。イメージング細胞再生の方法は、ステージングおよび再生のダイナミクスを分析するためのルーブリックと共に提供されます。再生の全体のプロセスは 3 つの段階に分かれています。進行の段階を経て細胞の人口の動態を可視化、再生タイミングで不均一性を発揮します。

ラッパムシ文化は確実に確立し、個々 のセルまたはプロトコルのセクション 1 を使用してセルのフラグメントから維持されます。ビデオ 1に大きい健全な文化の代表的な例を示します。
再生の時間コースラッパムシステップ 3.1、イメージングとセクション 4 (図 7) で説明する分析方法に記載されている再生を開始するためショ糖治療法を使用して測定しました。このプロットは、任意の特定のステージに到達する細胞の人口によって撮影時間 1 時間広がりがあることを示します。このタイプの解析は、細胞の再生の人口の再生過程における的不均一性の研究をことができます。
(図 4および図 6) ショ糖治療の数十の後これまで観察されている再生タイミングの概要は以下です。ステージ 1 は、ラッパムシセル (この段階はショ糖ウォッシュ アウトした直後に開始)、membranellar 帯なし涙のようです。このステージ 3 6 h. ステージ 2 は membranellar バンド表示 (スクロース処理後 3-6 時間) の成長と続きます。3-4 秀ステージ 3 は経口原基が membranellar バンド (スクロース処理後 6-8 時間) の後部の端に表示され、セルの前の終わりの方の両方の構造を移動するときこの段階続きます。この段階は、1-2 時間続きます。Membranellar バンドと口腔装置細胞の前端に達する、これは再生の完了を示した。セルは、特徴的なラッパムシラッパのような形状を採用しています。セルは、スクロース処理後 8-9 h を完全に再生されたのでした。
<img alt="膜バンド、口腔装置、食物液胞、大核が標識されたゾウリムシ図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1。ラッパムシのスナップショット。Membranellar バンドと口腔装置は細胞の前方の端に表示されます。止め金はセルの後部端に。ラッパムシ大核が着生します。よく供給ラッパムシは大抵クラミドモナスを含む緑の食胞。スケール バーは 0.5 mm です<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="顕微鏡の解剖セットアップ;生物学研究で観察するためのステント標本によるスライドガラス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2。ラッパムシ切断設定します。セル切断、市販解離性ステレオ顕微鏡を用いた細胞を見ながらガラス針を手動で操作することによって実行されます。ティッシュ ペーパーの目的より良いセルを表示する白い背景を提供することです。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="有糸分裂過程の段階を示すA-Fと標識された分裂細胞の顕微鏡シーケンス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3。ガラス針でラッパムシをカットする方法を示すビデオ 3 のスナップショット。(A) Aラッパムシ針がそれに触れる前にすぐに。(B) Aラッパムシは針とガラス スライド間優しく圧迫。(C) 契約ラッパムシ針の力に反応しています。(D) Aラッパムシ軽く針の側面とセルを押すカットされています。(E) Aラッパムシは今 2 つのカットが、区切られていません。(F) 2 つのラッパムシのフラグメント。スケール バーは 0.25 mm です<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="スクロース/尿素ショックステップ、遠心分離管、セルステージによるステント再生プロセス図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4。セクション 3 とプロトコルのセクション 4 のスケマティック可視化。ショ糖や尿素処理や細胞の再生の観察を行うための図解プロトコルです。下部のパネルに示されている時刻は、洗って 1 の先頭から測定されます。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="顕微鏡の解剖セットアップ、9ウェルスポットプレート、微小液滴反応の分析、光学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5。正立型顕微鏡を用いた再生のイメージングおよび/または直接観察のためセットアップします。それぞれ 4 μ L の液滴は、coverslip からぶら下がって、再生を受けている 1 つのセルがあります。スポット ガラスの井戸の水は、水滴の蒸発を制限します。このセットアップは、次の並列で複数の細胞を再生できます。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="植物細胞構造解析;顕微鏡画像A-E;細胞形態の変化を強調します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6。ラッパムシの membranellar バンドと口腔装置再生の各段階でスナップショット。(A) ステージ 1 はティア ドロップのような細胞の形態と membranellar バンドの不在によって特徴付けられます。(B) 第 2 段階は、membranellar バンド、継続的に打つ繊毛ベースの構造の外観が特徴です。パネル B の白い破線が付いている Membranellar バンド - D (C と D) ステージ 3 は経口原基 (矢印でマーク) の出現によって特徴付けられます。経口原基は membranellar バンドの後端で、陥入のように見えます。口腔の原基は、口腔装置になること、セルの前方に向かって移動されます。セルは特性ラッパムシラッパのような形状を採用し、口腔装置 (矢印でマーク) がセルの前方終わりに拡大している (E) 再生が完了します。スケール バーは 0.25 mm です<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="細胞ステージ分布棒グラフ、ショ糖ショック後の時間、9時間にわたる4つのステージを表示します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 図 7。ボックス プロット表示をスタック スクロース処理後の再生のすべての段階における細胞の割合がどのように変化する時間をかけています。プロットは、再生細胞の人口内の再生段階のタイミングで不均一性を示しています。「登録終了」は、再生完了を示します。セル数: 28。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="室内実験における光合成研究のための緑藻培養ビーカー" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> ビデオ 1。健全なラッパムシ文化の例。一般的に、文化は集中して、文化の分割お勧めします。<a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="顕微鏡下に落とします。液体表面張力研究;顕微鏡法;教育分析。" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> ビデオ 2。セルロースと減速しラッパムシ。<a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="細いワイヤー上の液滴の位置を強調表示するマイクロ流体セットアップの顕微鏡画像。" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> 動画 3.切削ラッパムシ。個々 のセルは、セルを介してガラス針を押すことによって顕微鏡を切り裂くステレオの下の複数の部分に手動でカットすることができます。<a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>文化の問題</td>
			<td>可能な治療</td>
			<td>可能な限り予防</td>
		</tr>
<tr>
<td>文化は、ワムシや他の大規模な生物によって圧倒されます。</td>
			<td>新しい培養皿にできるだけ多くラッパムシを削除します。セルを 3 回洗います。</td>
			<td>商業製造者から購入する場合でも、メッセージを受信するとき、ラッパムシを徹底的に洗います。</td>
		</tr>
<tr>
<td>文化は、真菌や他の小さい有機体によって圧倒されます。</td>
			<td>角を識別するが、少なくともラッパムシ。その地域で多くラッパムシを削除せず、可能な限りとして多くのメディアを削除し、新しい PSW で追加します。ミックス優しくしかし徹底的 distrubute に侵入した微生物。次の授乳をスキップして、ラッパムシはそれらを食べる。</td>
			<td>文化を定期的に観察し、新鮮な PSW のメディアを交換することによって小さい汚染物質を削除します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ラッパムシは互いの上に置くこと。</td>
			<td>濃度は細胞/ml 未満 20 文化を分割します。</td>
			<td>多くの文化を分割します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ラッパムシ細胞交尾します。</td>
			<td>5 日ではなく 4 日ごとをフィードします。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>文化は、暗い廃棄物のたくさんを持っています。</td>
			<td>多くの暗い材料、セルを削除せずに、できるだけ、ラッパムシ廃棄物として削除します。ラッパムシは、暗い材料に添付されている場合、は、廃棄物からラッパムシセル、セルを削除せず廃棄物をメディアを取り外します上下ピペットします。または、それらのラッパムシを削除し、それに応じてフィードより少ない。</td>
			<td>フィードのラッパムシ以下の食品文化の 100 mL あたり 1 mL。</td>
		</tr>
<tr>
<td>不健康な探して (胞/肥大化または丸みを帯びた)ラッパムシ。
</td>
			<td>ラッパムシ細胞の多くを削除せず可能な限りとして多くのメディアを削除し、新しい PSW を追加します。</td>
			<td>定期的にメディアを交換します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。ラッパムシを培養するためのトラブルシューティング ガイド。

巨大な繊毛虫ラッパムシは、創傷治癒と再生を研究する優れたシステムです。単一細胞または細胞断片からラッパムシ細胞培養の確立、切断細胞による再生を誘導する、化学的に membranellar バンドと口腔装置、イメージング、およびセルの分析の再生を誘導するための手順を提案します。再生。

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

このプロトコルの全体的な目標は、単一細胞レベルでの再生を研究するためのモデル生物として使用するためにStentorを成長させることです。この方法は、細胞が離散的な部分からどのように構造を構築するかなど、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。Stentorの主な利点は、再生可能な単一細胞であることと、手術を行うのに十分な大きさであることです。一般的に、このプロトコルの難しい部分は、人々が細胞を個人としてではなく培養物として扱うことに慣れていることです。まず、5倍の倍率の斜め光を使用して、実体顕微鏡でStentorサンプルを含むペトリ皿を検索します。なお、Stentor細胞は、基質に付着するとトランペットのような形状を呈します。非接着性である間、遊泳中のStentor細胞は外観があまり伸びていません。1ミリリットルのピペットを使用して、個々のStentor細胞を、少なくとも100マイクロリットルの市販の低温殺菌湧き水が入ったガラススポットプレートのウェルに移します。次に、Stentor細胞を除去せずに井戸内の水の約90%を取り除き、500マイクロリットルの新鮮な低温殺菌された湧き水を井戸に3回加えて細胞を洗浄します。細胞を給餌するために、まず、Chlamydomonas培養物から1ミリリットルのアリコートを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、室温で3分間、2, 095gで遠心分離する。ペレットを1ミリリットルの低温殺菌された湧き水に再懸濁して2回目の遠心分離を行い、続いて500マイクロリットルの低温殺菌された湧き水に再懸濁します。クローン性Stentor培養が必要な場合は、培養物あたり500マイクロリットルの馴化培地をガラススポットプレートの個々のウェルに移し、1つのStentor細胞を培地の各ウェルに移します。各Stentor培養物に調製したChlamydomonasの5マイクロリットルを48時間ごとに供給し、培養物を日陰の領域に保ちます。各給餌前に新しいStentor細胞の数を数え、それに応じて送達されるChlamydomonasの量を調整します。96時間ごとに、培地を数回静かにピペットで動かして、Stentorを各ウェルのメニスカスから取り外し、1ミリリットルのピペットを使用して、細胞を除去せずにウェルから培地を慎重に吸引します。次に、500マイクロリットルの新鮮な調整済み培地を各ウェルに加えます。少なくとも1つのウェルの細胞数が20を超える場合は、オートクレーブ滅菌された広口ガラス瓶に20ミリリットルの低温殺菌された湧き水を加え、実証されたように各ウェルの底からStentor細胞を慎重に分離します。1ミリリットルのピペットですべてのStentor細胞を採取し、細胞をガラス瓶に静かに移します。Stentor密度をミリリットルあたり約20細胞に保ち、準備されたChlamydomonasの200から1, 000マイクロリットルをStentor細胞に供給するために、48時間ごとに瓶に新鮮な低温殺菌された湧き水を追加します。培養量が瓶の容量の約90%に達したら、瓶の全内容物を2カップのガラス容器に移し、大量のStentor培養物に培養物100ミリリットルあたり2ミリリットルの調製されたクラミドモナを供給し、4〜5日ごとに低温殺菌された湧き水を培養物に追加して、Stentor密度を1ミリリットルあたり約20細胞に保ちます。週に一度、1ミリリットルのピペットを使用して、ワムシ、真菌、およびその他の増殖について5倍解剖顕微鏡で培養物を検査し、異常形状で無色のStentor細胞とともに汚染微生物を除去します。ガラス容器が約90%満たされたら、培養物を分割し、25ミリリットルの低温殺菌された湧き水を培養物に加え、50ミリリットルのピペットを使用して、示されているようにステンターをガラスから取り外します。次に、培養物の約50%を新しい2カップのガラス容器に移します。細胞の分裂による再生を誘導するには、まず針引き機を使って毛細管から数本の針を作製します。次に、トランペットの形がはっきりしていて、鮮やかな青緑色で、大きな液胞がない健康なステンターを2マイクロリットルの液滴に1つ集めます。液滴をスライドに置き、2マイクロリットルの4%メチルセルロースでステンターの動きを遅くします。液滴を解剖顕微鏡の下に置き、ガラス針を切断面とできるだけ平行に保持して、針の破損を防ぎます。収縮したStentorを針の側面でそっと押して、細胞の前端を細胞の後端から分割します。両方のフラグメントに少なくとも 1 つの大核ノードがあることを確認し、フラグメントをガラススポットプレートの個々のウェルに移動します。膜バンドおよび口腔装置の再生を誘導するには、1ミリリットルの培養培地中の30〜60個のステンター細胞を微量遠心チューブに移し、200マイクロリットルのピペットを使用して、1回の125マイクロリットルの容量ドローでチューブからすべての細胞を回収します。新たに調製した25%スクロース500マイクロリットルのチューブに細胞を分注し、ストップウォッチを開始します。ラック内のチューブ内の細胞を1分間フリック回転させた後、200マイクロリットルの1回のドローですべての細胞を採取し、ストップウォッチが2分間のショ糖処理を表示するまでピペットチップに細胞を保持します。次に、Stentorを1ミリリットルの低温殺菌された湧き水が入ったマイクロ遠心チューブに噴射し、3回のフリックスピンウォッシュを行います。再生をイメージするには、ガラススポットプレートの1つのウェルに100マイクロリットルの低温殺菌された湧き水を加え、20マイクロリットルのピペットチップを使用して、4マイクロリットルの培養培地に1つのStentor細胞を採取します。液滴を22 x 22平方ミリメートルのカバースリップの中央に堆積させ、前の液滴の周りにさらに4つの液滴を配置します。カバースリップを裏返し、低温殺菌された湧き水でウェルの上にそっと置きます。次に、再生中の細胞を光学顕微鏡で適切な時間分解能でイメージングします。スクロースの洗い流しの直後に起こる再生の第1段階では、Stentor細胞は膜バンドのない涙滴のように見えます。3〜6時間後、膜バンドが現れます。このステージ、ステージ2は、さらに3〜4時間続きます。ステージ3は、口腔原基が膜バンドの後端に現れ、両方の構造が細胞の前端に向かって動き始めるときに発生します。このステージは1〜2時間続きます。膜バンドと口腔装置の両方が細胞の前端に達すると、再生が完了し、細胞は特徴的なステンタートランペットのような形状になります。各再生ステージの各時点におけるセルの割合を積み上げ箱ひげ図にプロットします。細胞切断およびショ糖処理後の再生時間を測定すると、細胞集団が特定の段階に到達するまでに1時間にわたる広がりがあることが明らかになり、再生細胞の特定の集団内の再生プロセスの時間的不均一性が実証されます。このビデオを見た後、Stentorを培養し、再生を開始し、それを定量化する方法についてよく理解しているはずです。この手順を試みるときは、忍耐強くあることを忘れないでください。Stentorは培養で分裂するのに3〜5日かかり、Stentorの再生段階を特定するには練習が必要です。この技術は、細胞生物学の研究者がStentorで再生を探求するための道を開くでしょう。

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ラッパムシの再生の研究のための方法

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