Name: 糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ糸球体疾患のマウスモデルにおける腎機能評価プロトコル。尿中アルブミン・クレアチニン比測定、組織学的分析、電子顕微鏡による構造観察、糸球体分離法を含む包括的な腎臓ワークアップ手法を解説します。

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この作品は、英国心臓財団、リチャード ・ ブライト VEGF 研究トラストと MRC によって支持されました。

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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、糸球体疾患、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量の有効化のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。腎臓の全体 (uACR および血漿クレアチニン測定)、透磁率の評価を含む、糸球体の機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にする各メソッドで重要な手順の透磁率個々 の球体 (糸球体 LpA/V は私)、構造変化 (PAS、ブルー、Trichrome、EM)、蛋白質のローカリゼーション (IF) と糸球体の遺伝子発現 (RT-PCR および西部にしみが付くこと) の検討。これらのメソッドは、腎疾患のマウスモデルの糸球体の機能を完全に把握するための鍵です。
GFB の透水性を評価する際、多くの研究は効果的な対策17,18として従来 uACR または 24 h アルブミン排泄率を使用するオプトインしています。これらのテクニックは、全体として GFB 透過性の評価をできるように、個々 の糸球体透過性評価と球体の間で変動のためそれはできません。以前の研究は、糸球体の LpA の測定を発見した/Vi GFB 透磁率5,9への変更のより敏感な指標となります。確かに、本稿で示した代表的な結果で 14 週に投稿 VEGF-A KO の誘導、VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b マウス VEGF-A KO マウス; と比較して有意に低い uACRただし、この結果、糸球体の LpA に反映されません GFB 透磁率 (図 1および図 2)5V私計測、VEGF-A165b は大幅防ぐない増加/。これは腎臓の透水性と個々 の糸球体の透過性の両方を評価するために複数のアッセイを使用しての重要性を示しています。さらに、糸球体の LpA/V私oncometric アッセイは、同じ腎臓から個々 の糸球体の透過性が大きく異なることが、特に疾患モデル5,10,を示唆しています。19. 糸球体 LpA を測定する 1 つの制限/V私はそれすることができますのみ; 実験的なエンドポイントで実行されることしたがって、正規 uACR 測定実験のエンドポイントの指示を与える必要があります。
機能の表現型を評価するとともに本法はまた構造と微細構造の表現の評価を推奨します。これを行うことができます PAS、ヒアリンなど汚れやシルバーの汚れの選択を使用して各糸球体形態のさまざまな側面を評価します。これはしばしばマウス モデルの場合、糸球体疾患の急性のモデルでは、訓練された腎病理医でない限り、これらの汚れを使用して任意の主要な構造異常を検出することは困難することができます。したがって、EM の遂行が糸球体基底膜、内皮 fenestrae サイズと数、およびポドサイト特性などのパラメーターの定量化を可能にする GFB の微細構造を評価するために示唆されました。そのような測定を実行する最小限のトレーニングを必要とするでき、疾患モデルで影響を受けるセル-型/構造決定する捜査官。例では代表的な結果に VEGF-A KO マウスが発見された糸球体疾患の軽度のモデルであること、したがって、主要な構造異常が存在しない PAS 染色時に。ただし、ポドサイト固有 VEGF-A KO でした変化を誘発する糸球体基底膜、足細胞、内皮細胞糸球体の超構造5を調べるとき。残念なことに、EM 法に記載されているため、腎臓の準備 GFB19の透磁率に重大な影響があることも知られている内皮の糖衣の検出を有効にしません。糖衣の深さを正確に測定するために腎臓はずの内皮糖衣 1% アルシアン ブルーと 2.5% グルタルアルデヒド灌流固定 Olteanら19で説明されているようです。
機能的及び構造的表現型が評価され、一度異なる遺伝子および細道の式/アクティベーション パターン、糸球体では特に評価できます。事前の超構造評価の種類/糸球体構造関係、ポドサイトまたは内皮特異遺伝子/経路を検討すべきかどうかを示すセルに関するいくつかの情報を与えることができます。たとえば、VEGF-A KO マウスから代表的な結果、内皮 fenestrae 数の減少は、(図 3 D) を認められた;したがって、VEGF の経路に関与すると知られている血管内皮マーカーの糸球体蛋白発現を検討しました。VEGFR 2 (図 4 b)5。糸球体のタンパクの発現、に加えて局在も場合を使用して視覚化することができます。張ら20による調査で、ポドサイト固有 GLUT1 の発現は、共同 podocin と増加の GLUT1 をローカライズする場合、足で確認されました。
糸球体の機能を評価するために文献の提示の方法と比較して糸球体疾患のマウスモデルの腎機能を評価するために本稿で説明した方法を使用できますから完全に評価する糸球体の表現型複数の側面。このメソッドを使用して、研究者はモデルの腎臓の表現型を決定し、表現型を開発する理由とメカニズムを評価することができます。病気のメカニズムに重要な情報は、これらのモデルの潜在的な治療手段を調べる場合に必要です。このメソッドは、疾患表現型と潜在的な治療の評価における糸球体機能に将来の調査に簡単に適用できます。
結論としては、このジェネリックと適応プロトコルは、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量の有効化、糸球体疾患のマウスモデルの仕事アップにおける腎臓をについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

ひと腎臓疾患を模倣するマウスモデルの使用はますます一般的になっています。マウスのようなモデルは、自然発症高血圧ラット (SHR)1, ストレプトゾトシン (STZ) など自発的なモデル-誘発糖尿病ラットとマウス2と db/db タイプ II 糖尿病マウス3、遺伝子組み換えモデルプライマリ ポドサイト固有焦点区域糸球体硬化症 (FSGS) モデル4、ポドサイト固有血管内皮増殖因子 (VEGF A) ノックアウト (KO VEGF-A) モデル5とアルポート症候群モデルの6、および取得5/6 腎7など片側尿管閉塞 (UUO) モデル8モデル。これらのモデルにおける腎糸球体機能のさまざまな側面を評価するためにいくつかのテクニックがあります。本方法の目的は、包括的な作業を完全に糸球体の機能を評価するために腎臓病のマウス ・ モデルで実行する必要がありますを示すことです。
このメソッドを使用しての背後にある理論的根拠は、複数の側面から評価される完全に糸球体の表現が可能です。これは糸球体の透過性、タンパク質と水と糸球体の構造異常と Mrna やタンパク質の正常な糸球体機能のために不可欠の式/スプライシングの変化の両方評価含まれています。このメソッドを使用して、研究者はモデルの腎臓の表現型を決定し、表現型を開発する理由とメカニズムを評価することができます。これは、これらのモデルの潜在的な治療上の道を調べるときに必要なある病気のメカニズムに重要な情報です。
文学、尿中アルブミンの増加レベルで決まる糸球体疾患のマウスモデルで提示される一般的な現象です。しかし、糸球体の機能を決定する単一のメソッドが常に効果的なないことを示唆する証拠があります。尿中アルブミン排泄率または尿中アルブミン クレアチニン比 (uACR) 測定は、総腎機能および個々 の糸球体にだけ情報を提供します。以前の研究では同じ腎臓5,9,10から異なる糸球体透過性が変化する場合を示しています。さらに、個々 の糸球体の透過性の評価は、糸球体機能を評価するためのより敏感な方法個々 の糸球体の水の透過性を測る手法 (LpA/V は私) uACR9の測定よりも糸球体機能の変化により敏感になることを示しています。この試金は、蛋白尿、c57BL/6 背景11などに耐性のあるマウス モデルで有益です。メソッド本稿の利点は、それが水に個々 の糸球体透過性と同様、両方のアルブミン総腎透磁率を調べることです。
糸球体の構造異常の検討はしばしば電池など過ヨウ素酸シッフ (PAS)、ヒアリン、汚れや銀汚れによって評価されます。これらは、スコアリング法による腎疾患のレベルを評価する訓練された腎病理医を有効にします。すべての良い方法の糸球体のマクロ構造の変更がで常に観察されていませんが、急性腎障害は12をモデル化します。このメソッドは、上記の腎組織学手法を実施に加えで、糸球体の超構造する必要があります電子顕微鏡 (EM) で評価されるも提案します。染色糸球体は通常光学顕微鏡の下で比較的普通に見ることができます。ただし、EM、糸球体基底膜 (GBM) 幅の小さな変化で評価にポドサイト足プロセス卑下、内皮のピンホールとサブ ポドサイト領域カバレッジに分析されます。したがって、糸球体超構造と微細構造の両方が糸球体障害のメカニズムを決定する評価が不可欠です。
糸球体の構造異常を評価するとともに、さらに糸球体疾患のメカニズムを解明する mRNA とタンパク質の発現とスプライシングと同様にタンパク質の活性化 (例えば、リン酸化)、変更を検討すべき。糸球体疾患を見るときとか、例えば、KO/オーバー-expressing ポドサイト固有 VEGF-A KO マウス5のような糸球体の細胞で遺伝子はタンパクと mRNA の変化が内にのみ検討が重要なとき、糸球体細胞、腎全体ではないです。このプロトコルでは、糸球体マウス腎皮質から分離されたタンパク質・ RNA、分離法について説明します。これは疾患モデルの糸球体における蛋白質/mRNA 不全の特定の分析をことができます。
このプロトコルでは、糸球体疾患、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量の有効化のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

<table><tbody><tr><td>メタボリックケージ</td><td>ハーバード装置</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水 (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>マウスアルブミンELISA定量セット</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA基板溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano または同等の</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater 安定化溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% プレキャストタンパク質ゲル</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli サンプルバッファー</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>ミニトランスブロットセル</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris ランニングバッファー</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>クレアチニン コンパニオン</td><td>エクソセル</td><td>1012 ストリッププレート</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 採血チューブ</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G ニードル</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ガラスバイアル</td><td>トーマス サイエンティフィ</td>ック <td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 10 ml ポリプロピレン チューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml チューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てティッシュモールド</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>マウス外科用解剖キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td><td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J.生理用</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼ふるい</td><td>コールパー</td><td>マーWZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色システム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>メルクミリポア</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>ポリプレップスライドシ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>埋込媒体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite 樹脂</td><td>寒天</td><td>Scientific CY212</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>寒天 Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>寒天 Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>例:957000H</td><td></td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>ネフリン (1243-1256) 抗体</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>抗ポドシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 二次抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ベクターラボ</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40細胞溶解バッファー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021 Inhibitor Halt</td><td></td></tr><tr><td>Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP標識二次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF Western Blotting Fisher</td><td></td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV REVERSE TRANSCRIPTASE</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>ランダムプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC ウォーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>蛍光灯ミスクロスコープ</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 解析ソフトウェア</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR サーモサイクラー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM 顕微鏡</td><td>ブリタニカ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

ひと腎臓疾患を模倣するマウスモデルの使用はますます一般的になっています。我々 の研究は糖尿病性腎症とポドサイト固有 VEGF A ノックアウト マウスを用いて糸球体機能の評価に焦点を当ててください。したがって、このプロトコルは、糸球体疾患、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量を有効にすることのこれらのマウスのモデルを評価するために我々 の研究室で使用される完全腎臓仕事アップについて説明します。糸球体の機能を評価するために文献の提示の方法と比較して本稿で説明したメソッドを使用して有効複数の側面から評価される完全に糸球体の表現型にします。このメソッドを使用して、研究者はモデルの腎臓の表現型を決定し、表現型を開発する理由とメカニズムを評価できます。病気のメカニズムに重要な情報は、これらのモデルの潜在的な治療手段を調べる場合に必要です。構造・超構造検討と同様、尿中アルブミン ・ クレアチニン比および個々 の糸球体水透磁率の測定による糸球体濾過障壁の詳細な機能評価を可能にする方法過ヨウ素酸シッフ染色、電子顕微鏡を使用しています。さらに、mRNA やタンパク質のレベルで遺伝子の調節不全の分析には、糸球体の機能の解明ができます。このプロトコルは、糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用できる汎用が適応できる方法を紹介します。

尿は、野生型 (WT)、誘導ポドサイト固有 VEGF A ノックアウト (VEGF-A KO)、VEGF-A 島 X Neph VEGF165b マウスから代謝ケージを使用して収集した (表現、球体のヒト VEGF A165b アイソ フォーム VEGF-A KO マウス、構成方法)。VEGF-A KO のドキシサイクリン誘導後 0、4、10、14 週で尿中アルブミン クレアチニン比の測定、VEGF-A の KO マウスは WT 濾胞と比較して 10 週間によって進歩的な蛋白尿を開発しました。絶対値は、図 2 a、および図 2 bに各マウスの値の基準に正規化で見ることができます。しかし、VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウス (図 2) で蛋白尿は認めその VEGF の165を示す b は蛋白尿5モデルの保護。
糸球体 LpAV は私は WT、VEGF-A の島、VEGF-A X Neph の VEGF-A165b 腎臓からふるわれた個々 の糸球体で測定しました。例、糸球体のキャッチ方法と収縮の観察 8 %bsa を用いで3 a を図に表示される場合。この収縮し、糸球体の LpA を調べるため/V私の各糸球体 (図 3 b)。VEGF の KO マウスは、大幅に増加した糸球体 LpA/V私14 週間でポスト WT 制御糸球体と比較して VEGF KO 誘導。VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウス、高められた糸球体 LpA で下が 14 週5で VEGF A165b の過剰発現によって妨げられていない私V/。
PAS 染色腎臓皮質セクションの VEGF-A 島導入後 14 週 VEGF-A KO または VEGF-A X Neph の VEGF-A の165b マウス (図 4 a) 糸球体構造的な異常を明らかにしなかった。ただし、EM を介して糸球体微細構造の分析、VEGF-A の KO マウスいた増加の GBM 幅を開発、fenestrae 内皮細胞の数を減少、SPS カバレッジを減少、平均ポドサイトのスリット幅を増加 (図 4-4 階).平均ポドサイト足は、スリットの変わらずに残った (図 3B と 3 G) の幅と数を処理します。VEGF-A165b VEGF-A KO マウスでの過剰発現は、GBM への変更を防止し、スリット幅 (図 4 ・ 4 f)。ただし、VEGF-A165b には、変更された fenestrae 数と SPS カバレッジ (図 4 および 4E)5の影響はなかった。
RT-PCR ふるわれた腎糸球体から抽出した RNA 上で実行は、ヒト VEGF A165b mRNA がのみに存在する (図 5 a) VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b マウスを明らかにしました。VEGFR 2 糸球体蛋白発現は VEGF-A165b (の過剰発現によって防がれた VEGF-A KO マウスで減少する発見されたふるわれた腎糸球体および西部にしみが付くことによって蛋白質のレベルを評価するからタンパク質を抽出する場合図 5B , 5 C)5。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> 図 1。糸球体透過性 (LpA) リグの図式設定します。(A)糸球体がキャッチ安定性のためのマウントの上にクランプする(B)マイクロ ピペット吸引を使用してホルダー内に。(C)長方形 microslide。(D)ビデオ カメラで顕微鏡の 4 X の目的。(E) 1 %bsa 溶液 37 ° C に加温(F) 8 %bsa 溶液 37 ° C に加温(G)リモート タップ ベアリング 2 perifusate を含む行、急速な perifusate 交換を許可します。(H)し、糸球体を bathes microslide に向かって perifusate のルートです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> 図 2。尿中アルブミン クレアチニン比。(A) WT、VEGF-A の島、VEGF-A X Neph の VEGF-A の165b マウスにおける VEGF-A の KO の誘導後 0、4、10、14 週間で uACR 値。(B)同じ uACR 値はそれぞれ個々 のマウスの基準値 (週 0) に正規化します。UACR 大幅増加 VEGF-A KO マウス週 10 と 14 WT 濾胞と比較して VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウスができなかった (* p &lt; 0.05;二元、ペアの比較のための補正n = 4-12 マウス時間ポイントごと誤差範囲: [SEM] 平均値の標準誤差)。この図は、スティーブンスら5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> 図 3。糸球体の水透過性の測定。(A)吸引; を介してマイクロ ピペットで糸球体をキャッチperifusate が 1 %bsa (Ai) から 8 %bsa (Aii) に切り替わるし、糸球体の収縮が観察されます。(B) 8 %bsa スイッチ前後の測定値決定される糸球体 LpA/V は私。(C) VEGF-A KO マウスを開発する高められた糸球体 LpA/V私14 週間でポスト VEGF-A KO WT コントロールと比較しての誘導。これは大幅 VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウスで妨げられない (* p &lt; 0.05;一方通行 ANOVA、ボンフェローニ補正の組み合わせの比較n = 4-9 マウス, 15-30, 糸球体;誤差範囲: SEM)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> 図 4。糸球体の構造解析。(A) PAS 陽性腎皮質は WT、VEGF-A の島、VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウス (Ai - iii) から糸球体の構造的な異常を示さなかった。EM は、VEGF-A 島糸球体 (Aiv - vi) の超構造異常を明らかにしました。(B)グループ間平均 FPW は変更しませんでした。(C)は糸球体基底膜増加 VEGF-A 島糸球体における VEGF A165b (D) fenestrae は VEGF-A165* (E) 、SPS 報道によって不変に残った VEGF-A 島糸球体の減少によって防がれました。いたも VEGF A165b (F)スリット幅平均は VEGF-A 島糸球体で増加したがそのまま残った、VEGF-A 島糸球体の減少を変更されなかった VEGF-A165b (G)スリット数によって防がれました。3 つのグループの間 (* p &lt; 0.05;一方通行 ANOVA、ボンフェローニ補正の組み合わせの比較n = 3 のマウス, 9 糸球体;誤差範囲: SEM)。この図は、スティーブンスら5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> 図 5。 マーカーの mRNA および蛋白質の表現。(A) RT-PCR ヒト VEGF A165b mRNA 発現のみ VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b マウスからふるわれた球体で明らかにされたことを示した。(B)西部にしみが付くことを示した VEGFR 2 発現 VEGF-A 島糸球体でダウン規制 VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b 糸球体で防がれた (* p &lt; 0.05;一方通行 ANOVA、ボンフェローニ補正の組み合わせの比較n = 3-6 マウス;誤差範囲: SEM)。この図は、スティーブンスら5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、糸球体疾患のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

この方法は、糸球体の機能的および構造的な表現型に関する糸球体疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、腎臓病理の機構分析を可能にします。この技術の主な利点は、糸球体疾患のすべての評価モデルに適応できることです。尿中アルブミンクレアチニン比を評価するには、6〜8週齢の雄マウス1匹を、水と濃縮ダイエット食品が入った代謝マウスケージに静かな部屋に置きます。6時間後、マウスを通常の飼育箱に戻し、各ケージから最低50マイクロリットルのベースライン尿サンプルを採取し、尿収集を週1回から月1回に繰り返します。実験のエンドポイントでは、各動物の腹部から腎臓を採取し、氷冷PBSで臓器を洗浄します。皮質糸球体を調べるには、腎臓皮質の1つの極を取り外して1立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。深部の傍状糸球体を調べるには、髄質の小さな部分を取り出して1立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。次に、組織の各切片からの断片を、5ミリリットルの2.5%グルタルアルデヒド溶液を含む個々の電子顕微鏡バイアルに入れ、サンプルを摂氏4度で保存します。皮質および傍糸球体の組織学のために、腎臓の上部3分の1を5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で24時間取り外して固定します。次に、固定組織を5ミリリットルの70%エタノールに24時間移してから、パラフィンに包埋します。皮質および髄質糸球体の免疫フルオロ化学分析では、腎臓の3分の1を組織型に入れ、組織を最適な切断温度の化合物に浸します。次に、化合物が凍結するまで型をドライアイスの上に置き、サンプルが切片になるまで摂氏80度で保存します。タンパク質分析では、3 x 2立方ミリメートルの腎臓皮質片を0.5ミリリットルのプラスチックチューブに入れ、サンプルを液体窒素でスナップ凍結して摂氏80度で保存します。RNA解析のための組織を長期間保存するには、先ほど示したように3×2立方ミリメートルの腎臓片を急速凍結した後、5容量のRNase安定化溶液を加えて80°Cで保存します。糸球体を分離するには、残りの腎臓組織をスライスし、組織片を1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加した5ミリリットルの哺乳類リンガー溶液に氷上に置いて、すぐにふるいにかけます。糸球体を分離するには、ガラスビーカーに上向きのミクロンの細孔サイズのふるいを積み重ね、腎臓スライスを上部の425ミクロンの細孔サイズのふるいに置きます。次に、シリンジプランジャーと1%BSAを添加した新鮮な氷で冷たく冷たい哺乳類のリンガー溶液を使用して、腎臓組織を最初のふるいでつぶします。腎臓のかけらが押し出されたら、上部のふるいを取り外し、腎臓の破片を順番に各ふるいに押し続けます。100ミクロンと70ミクロンのふるいだけが残ったら、最後の2つのふるいによって保持された糸球体収穫物を、氷上に1%BSAを補充した10ミリリットルの新鮮な哺乳類のリンガー溶液を含む50ミリリットルの円錐管に移します。糸球体懸濁液3ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブ2本に分割し、遠心分離により糸球体をペレット化します。上清を取り除いた後、糸球体を液体窒素で急速凍結し、摂氏80度で保存して、後でタンパク質とRNAを抽出します。次に、残りの糸球体溶液を摂氏37度の水浴に入れ、光学顕微鏡ステージ上の糸球体透水性リグに注入します。無傷の個々の糸球体を捕捉したら、マイクロピペットでボーマン嚢と管状断片を遊離し、記録を開始し、1%BSAを添加した新鮮なリンガー溶液で糸球体を灌流します。30秒後、灌流液を濃縮された8%BSAリンガー溶液に切り替えます。10秒間の灌流後、灌流液を1%BSAリンガー溶液に戻し、録音を停止します。糸球体細胞と残留マトリックスを詳細に可視化するには、パラフィンを包埋した固定した腎皮質サンプルを摂氏37度で1時間乾燥させた後、キシレンとエタノールを連続して浸漬して脱パラフィンします。サンプルを蒸留水で5分間再水和し、ヒュームキャビネット内の過ヨウ素酸溶液でスライドをインキュベートします。5分後、100ミリリットルの蒸留水で5分間の洗浄を3回行い、スライドをすすぎ、続いてシフ試薬で15分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、スライドを流水で5分間洗い、ヘマトキシリンで3秒間対比染色した後、流水でさらに15分間十分にすすぎます。次に、上昇エタノール浸漬と2回連続して3分間キシレン浸漬でスライドを脱水します。自然乾燥後、スライドをキシレンベースの封入剤にセットし、光学顕微鏡で400倍の倍率で糸球体構造を評価することができます。血管内皮増殖因子(VEGF-A)ノックアウトマウスは、野生型同腹仔対照群と比較して10週間までに進行性アルブミン尿を発症しますが、VEGF165bを過剰発現するノックアウト動物はこの状態から保護されています。VEGF-Aノックアウトマウスは、野生型コントロールと比較して糸球体水透過性が有意に増加しており、これはVEGF-A165bの過剰発現によって部分的に救出されます。VEGF-Aノックアウトマウスの腎皮質切片の過ヨウ素酸シッフ染色は、光学顕微鏡分析による糸球体の構造異常を明らかにしません。しかし、電子顕微鏡分析では、ノックアウトマウスは、糸球体基底膜幅の増加、内皮フェネストラの数の減少、サブポドサイトスペースカバレッジの減少、および平均足細胞スリット幅の増加を示しますが、スリットの平均数は変化しませんでした。VEGF-Aノックアウト動物におけるVEGF165bの過剰発現は、糸球体基底膜とスリット幅の変化を救済します。ただし、VEGF165bの過剰発現は、変化したフェネストラ数やサブポドサイト空間の被覆率に影響を与えません。ふるいにかけた糸球体から抽出されたRNAは、VEGF165b過剰発現ノックアウトマウスにおけるヒトVEGF165b mRNA発現を確認し、VEGF-AノックアウトマウスにおけるVEGFR2の発現減少と相関し、動物のノックにおけるVEGF165b過剰発現によって救出されます。このビデオを見た後、アルブミンと水の両方に対する糸球体透過性の評価を含む、糸球体疾患のマウスモデルの評価のための完全な腎臓精密検査を完了する方法を十分に理解しているはずです。

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医学

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