糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

このプロトコルでは、糸球体疾患のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

この方法は、糸球体の機能的および構造的な表現型に関する糸球体疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、腎臓病理の機構分析を可能にします。この技術の主な利点は、糸球体疾患のすべての評価モデルに適応できることです。尿中アルブミンクレアチニン比を評価するには、6〜8週齢の雄マウス1匹を、水と濃縮ダイエット食品が入った代謝マウスケージに静かな部屋に置きます。

6時間後、マウスを通常の飼育箱に戻し、各ケージから最低50マイクロリットルのベースライン尿サンプルを採取し、尿収集を週1回から月1回に繰り返します。実験のエンドポイントでは、各動物の腹部から腎臓を採取し、氷冷PBSで臓器を洗浄します。皮質糸球体を調べるには、腎臓皮質の1つの極を取り外して1立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。

深部の傍状糸球体を調べるには、髄質の小さな部分を取り出して1立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。次に、組織の各切片からの断片を、5ミリリットルの2.5%グルタルアルデヒド溶液を含む個々の電子顕微鏡バイアルに入れ、サンプルを摂氏4度で保存します。皮質および傍糸球体の組織学のために、腎臓の上部3分の1を5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で24時間取り外して固定します。

次に、固定組織を5ミリリットルの70%エタノールに24時間移してから、パラフィンに包埋します。皮質および髄質糸球体の免疫フルオロ化学分析では、腎臓の3分の1を組織型に入れ、組織を最適な切断温度の化合物に浸します。次に、化合物が凍結するまで型をドライアイスの上に置き、サンプルが切片になるまで摂氏80度で保存します。

タンパク質分析では、3 x 2立方ミリメートルの腎臓皮質片を0.5ミリリットルのプラスチックチューブに入れ、サンプルを液体窒素でスナップ凍結して摂氏80度で保存します。RNA解析のための組織を長期間保存するには、先ほど示したように3×2立方ミリメートルの腎臓片を急速凍結した後、5容量のRNase安定化溶液を加えて80°Cで保存します。糸球体を分離するには、残りの腎臓組織をスライスし、組織片を1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加した5ミリリットルの哺乳類リンガー溶液に氷上に置いて、すぐにふるいにかけます。

糸球体を分離するには、ガラスビーカーに上向きのミクロンの細孔サイズのふるいを積み重ね、腎臓スライスを上部の425ミクロンの細孔サイズのふるいに置きます。次に、シリンジプランジャーと1%BSAを添加した新鮮な氷で冷たく冷たい哺乳類のリンガー溶液を使用して、腎臓組織を最初のふるいでつぶします。腎臓のかけらが押し出されたら、上部のふるいを取り外し、腎臓の破片を順番に各ふるいに押し続けます。

100ミクロンと70ミクロンのふるいだけが残ったら、最後の2つのふるいによって保持された糸球体収穫物を、氷上に1%BSAを補充した10ミリリットルの新鮮な哺乳類のリンガー溶液を含む50ミリリットルの円錐管に移します。糸球体懸濁液3ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブ2本に分割し、遠心分離により糸球体をペレット化します。上清を取り除いた後、糸球体を液体窒素で急速凍結し、摂氏80度で保存して、後でタンパク質とRNAを抽出します。

次に、残りの糸球体溶液を摂氏37度の水浴に入れ、光学顕微鏡ステージ上の糸球体透水性リグに注入します。無傷の個々の糸球体を捕捉したら、マイクロピペットでボーマン嚢と管状断片を遊離し、記録を開始し、1%BSAを添加した新鮮なリンガー溶液で糸球体を灌流します。30秒後、灌流液を濃縮された8%BSAリンガー溶液に切り替えます。

10秒間の灌流後、灌流液を1%BSAリンガー溶液に戻し、録音を停止します。糸球体細胞と残留マトリックスを詳細に可視化するには、パラフィンを包埋した固定した腎皮質サンプルを摂氏37度で1時間乾燥させた後、キシレンとエタノールを連続して浸漬して脱パラフィンします。サンプルを蒸留水で5分間再水和し、ヒュームキャビネット内の過ヨウ素酸溶液でスライドをインキュベー

5分後、100ミリリットルの蒸留水で5分間の洗浄を3回行い、スライドをすすぎ、続いてシフ試薬で15分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、スライドを流水で5分間洗い、ヘマトキシリンで3秒間対比染色した後、流水でさらに15分間十分にすすぎます。次に、上昇エタノール浸漬と2回連続して3分間キシレン浸漬でスライドを脱水します。

自然乾燥後、スライドをキシレンベースの封入剤にセットし、光学顕微鏡で400倍の倍率で糸球体構造を評価することができます。血管内皮増殖因子(VEGF-A)ノックアウトマウスは、野生型同腹仔対照群と比較して10週間までに進行性アルブミン尿を発症しますが、VEGF165bを過剰発現するノックアウト動物はこの状態から保護されています。VEGF-Aノックアウトマウスは、野生型コントロールと比較して糸球体水透過性が有意に増加しており、これはVEGF-A165bの過剰発現によって部分的に救出されます。

VEGF-Aノックアウトマウスの腎皮質切片の過ヨウ素酸シッフ染色は、光学顕微鏡分析による糸球体の構造異常を明らかにしません。しかし、電子顕微鏡分析では、ノックアウトマウスは、糸球体基底膜幅の増加、内皮フェネストラの数の減少、サブポドサイトスペースカバレッジの減少、および平均足細胞スリット幅の増加を示しますが、スリットの平均数は変化しませんでした。VEGF-Aノックアウト動物におけるVEGF165bの過剰発現は、糸球体基底膜とスリット幅の変化を救済します。

ただし、VEGF165bの過剰発現は、変化したフェネストラ数やサブポドサイト空間の被覆率に影響を与えません。ふるいにかけた糸球体から抽出されたRNAは、VEGF165b過剰発現ノックアウトマウスにおけるヒトVEGF165b mRNA発現を確認し、VEGF-AノックアウトマウスにおけるVEGFR2の発現減少と相関し、動物のノックにおけるVEGF165b過剰発現によって救出されます。このビデオを見た後、アルブミンと水の両方に対する糸球体透過性の評価を含む、糸球体疾患のマウスモデルの評価のための完全な腎臓精密検査を完了する方法を十分に理解しているはずです。