コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化
2018年7月12日
ゼブラフィッシュが自然なコレラをホストし、要約し、トランス ミッションに植民地から全体の感染サイクルを研究する使用ことができます。ここでは、植民地化レベルのコレラを評価し、下痢ゼブラフィッシュを定量化する方法を示します。
この方法は、コレラ菌がどのようにしてクワイエットコーストにコロニーを形成し、腸内細菌叢と競合してニッチを確立するかなど、コレラ菌分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、魚が天然のコレラ菌の宿主であるため、コレラ菌の完全なライフサイクルを研究できることです。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるDhrubajyoti Nagと、私の研究室の博士課程の学生であるPaul Breenです。
V.choleraeの培養物を調製した後、ゼブラフィッシュに浸漬して接種します。まず、200ミリリットルの滅菌感染水が入った400ミリリットルのビーカーに4匹または5匹のゼブラフィッシュを入れます。次に、1ミリリットルのコレラ菌培養物を添加して、目的の感染濃度にします。
次に、ビーカーを穴あき蓋で覆います。すべてのビーカーを準備した後、摂氏28度に設定されたガラス製のフロントインキュベーターに移します一時的な曝露の場合、約6時間後、ビーカーの水を魚網に注ぎ、魚を集めます。感染した水は、バクテリアを殺すために漂白剤で処分する必要があります。
次に、魚を200ミリリットルの滅菌感染水に5分間入れます。5分後、この水を魚網に通し、水を漂白剤で処分します。今、魚は200ミリリットルの滅菌感染水で新しいきれいなビーカーに入ることができます。
実験が目的のエンドポイントに達したら、診断目的で感染水の15ミリリットルのサンプルを採取します。その後、魚を採取し、感染した水を適切に処理します。腹側を上に向け、下顎を通るピンと肛門のすぐ後方にある別のピンで体を固定します。
両方のピンを本体から離す角度にします。次に、70%エタノールで魚の腹面を拭き取ります。次に、メスとバンナスのハサミを70%エタノールと炎を使用して滅菌します。
次に、メスを使用して、鱗を貫通する腹に小さな縦方向の切開を行いますが、皮膚と同じ深さまでしか切りません。次に、はさみで、切開部を体の長さに沿って慎重に伸ばし、皮膚レベルより深く切らないように切り込みます。肛門を切ることは避けてください。
次に、頭に向かって横方向に2つの切り込みを入れて、開口部を広げます。次に、横方向の切開部の両側の皮膚を解剖面に固定し、ピンを体から離して角度をつけます。腸管は非常に細くて淡い管として見えるはずです。
次に、2対の火炎滅菌鉗子を使用して、非常に壊れやすい腸管全体を慎重に取り除きます。組織をガラスビーズと1ミリリットルのコールドバッファーを含むヒト化チューブに移します。次に、テキストプロトコルに記載されているように組織を均質化し、腸のコロニー形成レベルを定量化します。
次に、腸内ホモジネートとバッファーを段階希釈します。魚ごとに、1ミリリットルの容量で5つまたは6つの10倍希釈液を準備します。チューブをボルテックスして混合します。
次いで、ストレプトマイシンおよびX−galを含有するLB寒天プレート上で各希釈液の100〜200マイクロリットルをプレート化する。プレートを摂氏30度で16〜18時間インキュベートします。一晩のインキュベーション後、プレート上のV.choleraeコロニーを数えます。
これらの細菌は通常、X-galを含むLB培地に淡い青色のコロニーを生成します。複数のコロニー形態が観察される場合は、それぞれの異なる形態のいくつかのコロニーを異なるTCBSプレートにパッチします。TCBSでは、V.choleraeは、不透明な中心と半透明の周辺を持つ、大きくてわずかに平らになった黄色のコロニーを生成します。
魚の下痢におけるムチンレベルを決定するには、96ウェルプレートでアッセイを行います。3回で、ブランクを含む各テスト条件の感染水100マイクロリットルをウェルにロードします。次に、50マイクロリットルの新鮮な0.1%過ヨウ素酸溶液を各テストウェルに混合します。
ピペッティングを使用して混合します。次に、プレートをプラスチックでしっかりと包み、プレートを摂氏37度で1〜1時間半インキュベートします。インキュベーション後、プレートを室温まで冷却します。
各ウェルに100マイクロリットルのフクシン溶液を加え、ピペッティングで混合します。次に、プレートを再び包み、室温でロッカーに置きます。約20分で、プレートリーダーを使用して560ナノメートルのプレートを読み取ります。
溶液中のムチンによって引き起こされる反応を定量化します。魚の下痢のタンパク質レベルを測定するには、ブラッドフォードアッセイを使用します。BSAスタンダードの1つを66マイクロリットル、または感染水66マイクロリットルを、使い捨てキュベット内のブラッドフォードアッセイ試薬1, 000マイクロリットルと混合します。
次に、サンプルを室温で2分間インキュベートします。次に、分光光度計で660ナノメートルの吸光度を読み取ります。下痢の量の簡単な指標は、600ナノメートルで測定された水中の濁度です。
水をよく混ぜ、使い捨てキュベットに1ミリリットルを加えて測定します。ベースラインのブランク測定には、清潔な感染水を使用してください。排泄されたコレラ菌も測定できます。
これは、接種後にきれいな水に移動させた魚で行うことができます。前述のように、タンク水のアリコートを段階希釈します。次に、希釈液を選択培地に播種し、プレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。
後で、前に説明したようにコロニーを数え、CFUを決定します。200ミリリットルの水に収容されたゼブラフィッシュの群れに、500万CFUのパンデミックコレラを接種しました。バクテリアが蔓延した水に6時間浸かった後、魚はきれいな水に18時間移動します。
その後、空気腸を採取しました。各魚は、推定100, 000〜1, 000, 000のコレラ菌細胞を保有していました。感染水は他のアッセイに使用しました。
感染線量が高かったほど、ムチンレベルは高かった。魚がコレラ菌に感染したとき、水のOD600は有意に高かった。最後に、感染した魚の水中の総タンパク質レベルは、感染していない魚の水中で観察されたもののほぼ2倍でした。
このビデオを見れば、成魚のゼブラフィッシュにコレラ菌を感染させる方法と、感染によって誘発される下痢を定量化する方法についてよく理解できるはずです。この手順に続いて、以前に感染した魚によるナイーブ魚の感染を評価するために、感染アッセイなどの他の方法を実行することができます。
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概要
ゼブラフィッシュは V. cholerae の自然宿主として機能するため、研究者は定着から伝播に至るまでの一連の感染サイクルを研究することができます。本記事では、ゼブラフィッシュにおける V. cholerae の定着レベルの評価および下痢の定量化する方法について概説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 感染症
- 動物モデル
背景
- ゼブラフィッシュはV. cholerae感染を研究するための有効なモデルである。
- 本手法により、腸内細菌叢における定着と競合の観察が可能となる。
- V. choleraeのライフサイクルを理解することは、介入策の開発において極めて重要である。
- 本研究は、自然宿主における感染動態に関する知見を提供する。
研究目的
- ゼブラフィッシュにおけるV. choleraeの定着を研究する方法を実演する。
- ゼブラフィッシュの健康に対するV. choleraeの影響を定量化する。
- V. choleraeと腸内細菌叢の相互作用を探索する。
使用方法
- V. cholerae培養液の調製。
- 滅菌感染水への浸漬によるゼブラフィッシュへの接種。
- 感染に用いるV. choleraeの特定濃度の使用。
- ゼブラフィッシュにおける定着レベルおよび下痢のモニタリング。
主な結果
- ゼブラフィッシュにおけるV. choleraeの定着に成功したことが実証されました。
- 下痢の定量化により、感染の重症度に関する知見が得られました。
- 本手法により、感染プロセスの詳細な観察が可能になります。
- これらの知見は、V. choleraeのライフサイクルおよび宿主との相互作用の理解に寄与します。
結論
- ゼブラフィッシュは、V. cholerae感染症の研究における有用なモデル動物です。
- 本手法は、vibrio cholerae研究分野における重要な課題の解決に寄与します。
- 得られた知見は、コレラに対する将来的な治療戦略に役立つ可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
この手法により、バイオ医薬品の研究者は天然の脊椎動物ホストにおけるホスト-病原体相互作用をモデル化することができ、抗感染戦略の標的バリデーションを支援します。定着と下痢を機能的なリードアウトとして定量化することで、Vibrio choleraeの毒性や腸内持続性を標的とする化合物のメカニズム的なリスク低減が可能になります。ゼブラフィッシュシステムは、腸管病原体の探索から前臨床評価まで、トランスレーショナルな連続性を提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： V. choleraeの定着因子および毒性メカニズムに関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 生理学的に適切な文脈において、宿主内での生存に必要な遺伝子の重要性を評価するための再現可能なシステムを提供する。
- 戦略的価値： 分子機能と感染における表現型結果を関連付けることで、ターゲットの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定量的なCFUおよびムチン読み取り値を生成し、抗病原性化合物の用量反応スクリーニングを可能にする。
- 運用的価値： ゼブラフィッシュコホート全体における感染および下痢の定量化を標準化し、アッセイの再現性を確保する。
- 戦略的価値： 病原体負荷および宿主反応に対する化合物の影響について、中スループットの評価を容易にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 腸管病原性のトランスレーショナルバイオマーカーとして、疾患に関連する下痢の排泄量をモデル化します。
- 運用の価値： 排泄された細菌を縦断的にサンプリングすることで、治療後の伝播能を評価することが可能です。
- 戦略的価値： 標的への結合（ターゲットエンゲージメント）と、定着および下痢の減少を相関させることで、リスク調整に基づいた開発進展の意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、定着レベルがターゲットエンゲージメントの指標となり、下痢の定量化が機能的有効性を反映する、初期探索から前臨床までのワークフローに適応します。
- 探索生物学：測定可能な腸管内負荷および宿主応答を通じて、毒性因子の仮説検証を可能にする。
- スクリーニング：標準化されたCFU平板培養およびムチン定量により、化合物スクリーニングのためのアッセイ準備を可能にする。
- 分析学：感染条件を比較するための定量的従属変数（CFU、OD600、タンパク質レベル）を提供する。
- トランスレーショナルリサーチ：定着の減少と下痢の軽減を関連付け、前臨床段階における連続性をサポートする。
- エンタープライズ再利用：自然宿主モデルにおいて複数の抗感染症候補を評価するための、再利用可能なプラットフォームを確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：病原体量および宿主の病理学的変化を直接測定することにより、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値：感染、組織採取、および生化学的アッセイの標準化されたプロトコルにより、再現性を確保する。
- 戦略的価値：ターゲットの阻害と伝播能力の低下を関連付けることで、go/no-go判断に有用な情報を提供する。
- ポートフォリオへの影響：定着および下痢のエンドポイントに基づいた、リスク調整後の候補物質の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュの取り扱い、感染手順、および腸管の解剖に関する専門知識が必要です。
- CFU測定およびアッセイの読み取りのため、インキュベーター、プレート塗抹器具、分光光度計へのアクセスが必要です。
- 実験全体を通して、感染濃度、曝露時間、および水質条件を標準化する必要があります。
- V. cholerae以外の他の腸管病原体にモデルを拡張する場合、適応に関する検討が必要です。
- 魚の個体差や、解剖時の腸管の脆弱性などの実用的な制限が含まれます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:40
Inoculating Zebrafish with V. cholerae
1:49
Collecting Intestines and Assessing Bacterial Colonization
4:27
Metrics for Fish Diarrhea: Mucin Levels, Protein Levels, A600 and Excreted Bacteria
6:43
Results: Colonization and Diarrhea, 18 h After a 6 h Infection Period
7:35
Conclusion
