蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル
February 13th, 2019
未熟と大人の蚊殺虫剤、adulticides と endectocides の新しいクラスとして開発のために化学物質の毒性を評価するためのプロトコルを説明します。プロトコルは、高スループットのシングル ポイント線量と線量応答測定接触毒性法や摂取を介して後続の評価で複数の化学のテストを有効にします。
この方法は、殺虫剤発見およびベクトル制御フィールドの主要な質問に答える上で役立ちます。例えば、蚊の幼虫や成人の集団に対する製剤化されていない化学はどれほど有毒ですか?化学は幼虫や殺菌剤として開発の可能性を持っていますか?
そして、最も効果的な配達ルートは何でしょうか?この技術の主な利点は、配合されていない化学の毒性を評価するために使用できること、ベクター蚊の複数の種に対する化学の毒性、および高スループット容量で何百もの化合物を評価するためにスケールアップできることです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の科学技術者であるJasleen Kaurです。
まず、24ウェル組織培養プレートのウェルにラベルを付けます。分析バランスを使用して、試験化合物の重量を量ります。その後、1.5mLチューブ内の滅菌二重蒸留水中の化合物を溶解し、80mMストック溶液を得た。
次に、二重蒸留水を用いてストック溶液を連続して希釈し、所望の濃度の作業ストック溶液を調製する。注意して幼虫は、過剰な水の除去中に、および試験化学が幼虫への物理的な損傷を避けるために追加されたときに、井戸に追加され、幼虫を取る必要があります。傷害は死亡率を増加させ、したがって偽陽性の結果を生じるか、またはアッセイを無効にする。
広いボアプラスチックトランスファーピペットを使用して、5つの3分の1のインスター幼虫をプレートの各ウェルに移します。その後、1 mLピペットを使用して水を静かに取り除き、望ましい量の二重蒸留水に交換します。幼虫が乾燥しないように、速やかに水を取り除くときに幼虫に触れないように注意し、プラスチックウェルの反対側にピペットを入れて試験化学を静かに加えます。
各ウェルに適切な量のテスト溶液を追加し、プレートを穏やかに回転させて均一な混合を保証します。相対湿度75~85%で摂氏25度で12時間の明暗サイクルを維持する成長室にプレートを置きます。幼虫の動きを確認するには、プレートを軽くタップします。
動きが見られない場合は、幼虫に無菌爪楊枝でそっと触れます。応答が気付かなければ幼虫を死んだとスコアし、スコアシートを使用して、テキストプロトコルに記載されている時点で各井戸の死んだ幼虫の総数を記録します。20リットルのプラスチックケージに3〜5日齢の成虫の雌の蚊を培養します。
9オンスの紙コップに、試験化合物の名前と濃度をラベル付けします。次に、20mLガラスバイアルにアセトン中の試験化合物の10mg/mLストック溶液を調製する。次いで、ストック溶液を連続的に希釈し、所望の働き濃度を得る。
1つのmLガラスの注射器をアセトンで洗浄します。次に、適切な濃度で試験溶液を充填します。0.25uLのボリュームを提供するように調整されたマイクロアプリケータでシリンジを固定します。
次に、アスピレーターを使用して、ケージから10、3〜5日齢の成虫の雌の蚊を取り除きます。摂氏4度で5分間麻酔します。その後、蚊をシャーレに移します。
皿を氷の上に10分間置きます。死亡率に寄与する可能性のある成体の蚊に損傷を与えないように、冷蔵庫で5分以上麻酔したり、氷の上に10以上固定したりしないようにし、蚊の取り扱いを最小限に抑えます。冷たいプレートと移動可能なステージを備えたマイクロマニピュレーターにアクセスできる場合、蚊の取り扱いをさらに最小限に抑えることができます。
細かいピンセットを使って、各蚊を皿から取り除きます。注射器のマイクロアプリケーターは、後胸部に0.25uLの試験溶液を適用し、次に、解剖顕微鏡の下で、蚊を氷の上のラベル付き紙コップに移します。カップを10×10cmのメッシュスクエアとゴムバンドで密封し、次いで成長室に移し、先に述べたように死んだ蚊の数を記録します。
約150匹から5日齢の成虫の雌の蚊を吸引器で採取し、別のケージに移します。給餌アッセイの1~24時間前に糖の供給源を取り除きます。試験用化合物の80mMストック溶液を水中に用意します。
次いで、それを水で逐次希釈し、所望の濃度の作業ストック溶液を得た。所望の試験濃度を得るために、1.5mLチューブ内のデシブリンウサギの血液の960uLに各希釈の40uLを加え、ピペットで混合する。フィーディングユニットにメンバーフィルターを置き、ゴムリングで密封します。
次に、ピペットを使用して、送達装置の裏側に位置する送達口を通して、検査液を用いて血液の1mLを移動させる。給電ユニットを加熱ユニットに取り付けます。次いで、作りたての10%乳酸溶液で膜表面を優しく綿棒で切り取る。
ケージに給餌ユニットを置きます。ケージを暗い布で覆い、蚊に1時間餌を与えます。蚊が餌を与えた後、ケージを冷蔵庫に5分間摂氏4度に入れて蚊を麻酔します。
次に、ケージ内の蚊の総数を数えて記録します。腹部を調べることによって、完全および部分的に供給された雌の蚊の総数を数え、記録する。1回の投与量につき最低50個の血液を与えられた蚊を得るべきである。
餌を与えていない蚊を取り除く。次に、ケージを成長チャンバーに移し、スコアシートを使用して、適切な時点で死んだ蚊の数を記録します。3日目の血液後の授乳中に、ケージに卵カップを72時間置きます。
解剖顕微鏡を使用して、治療ごとに産生される卵の総数を数えます。幼虫接触アッセイを行い、ドーパミン受容体拮抗薬であるアミトリプチリンが経時経過に伴う幼虫死亡率に及ぼす影響を評価した。データは、LC50値が実験の経時経過とともに減少することを明らかにした。
成虫の雌蚊の死亡率に対するアミトリプチリンの効果を、ビフィントリンと比較し、2つの陰性対照を示した。アセトン処理および未治療の陰性対照と比較して、アミトリプチリンとビフィンの両方が各実験時点で有意な死亡率を誘発した。3種類の異なる用量のアミトリプチリンが雌の蚊の胎児性と死亡率に及ぼす影響を評価するために定量的な摂食アッセイを行った。
データは、血液供給コントロールと比較して、最も高用量でアミトリプティリン供給蚊の胎児性に統計的に有意な差を明らかにしなかった。一度習得したら、ここで述べたアッセイのどれでも、適切に行えば、一人の個体によって約2時間で完了することができる。この手順を試みる間、生物を穏やかに扱うことを忘れないでください、そして局所適用中および幼虫または成人のアッセイの得点の間に一貫性があるべきである。
この手順に従って、吸収を介して毒性を評価するバイオアッセイ、蚊のタルシ、CDCボトルアッセイ、WHOチューブアッセイを介して、非配合化学の有効性に関する追加の質問に答えるために、または製剤化された製品、および接触殺虫剤または空間スプレーとしての開発の可能性を示す他の方法を行うことができる。
概要
この記事は、未熟な蚊と成虫の蚊に対する様々な化学物質の毒性を評価するためのプロトコルを提示し、新しい幼虫殺虫剤と成虫殺虫剤の開発を目指しています。これらの方法により、接触または摂取による毒性を決定するための高スループット試験と用量反応評価が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 殺虫剤の開発
- ベクター制御
- 毒性学
背景
- 未調製の化学物質の毒性を理解することは蚊の制御にとって重要です。
- 高スループット試験により、複数の化合物を効率的に評価できます。
- プロトコルは被験者への物理的損傷を最小限に抑えるように設計されています。
- 化学物質の試験のための異なる投与経路が探求されています。
研究の目的
- 蚊の個体群に対する様々な化学物質の毒性を評価すること。
- 潜在的な幼虫殺虫剤と成虫殺虫剤を特定すること。
- これらの化学物質の最も効果的な投与方法を決定すること。
使用された方法
- 試験化合物の母液と段階希釈の調製。
- 幼虫アッセイのための24ウェル組織培養プレートの使用。
- マイクロアプリケータを用いた成虫蚊への試験溶液の適用。
- 試験溶液と混合した脱フィブリン化ウサキ血液を用いた摂取アッセイ。
主な結果
- プロトコルは幼虫と成虫の蚊の死亡率の効果的な評価を示しました。
- データは試験化合物の時間経過による毒性レベルの変動を示しました。
- アミトリプチリンとビフェントリンの比較により、死亡率に有意な差が示されました。
- 高スループット能力により、多数の化合物の評価が可能になりました。
結論
- 開発されたプロトコルは殺虫剤の開発とベクター制御研究に価値があります。
- 結果は新しい蚊制御戦略の開発を導くことができます。
- これらの化学物質の長期的な影響を探るためにさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage evaluation of novel insecticidal chemistries against key mosquito vectors, supporting target validation and lead identification in vector control programs. By providing standardized, high-throughput assays for larval and adult toxicity via contact and ingestion routes, it facilitates mechanistic de-risking and predictive confidence in compound prioritization. The approach aids in triaging compounds for further development as larvicides or adulticides, reducing late-stage attrition in pesticide discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of toxicological hypotheses and pathway clarification for novel chemistries against mosquito vectors.
- Operational Value: Supports functional target validation through dose-response mortality assays in Aedes aegypti, Anopheles gambiae, and Culex quinquefasciatus.
- Strategic Value: Provides predictive confidence for portfolio triage by identifying compounds with larvicidal or adulticidal potential early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible toxicity endpoints.
- Operational Value: Enables assay standardization and scalability, allowing evaluation of hundreds of compounds in high-throughput format.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse for iterative compound testing across delivery routes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system testing using primary vector species of Zika, dengue, yellow fever, and malaria.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent mortality and fecundity readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying toxicity and sublethal effects such as fecundity reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hit evaluation to lead optimization, particularly for vector control programs seeking novel modes of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying toxicity across species and exposure routes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs (LC50, mortality rates) for reliable compound evaluation in 24-well and feeding assay formats.
- Analytics: Generates dose-response data and time-course mortality profiles that enable cross-compound comparison and structure-activity relationship initiation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through standardized adult feeding assays and fecundity assessments in disease-relevant mosquito models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for iterative testing of unformulated chemistries across multiple projects and vector species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in toxicity profiling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across larval contact, adult topical, and blood-feeding assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in insecticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on species-specific toxicity and delivery route efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, handling, and assay techniques to avoid artifacts from physical damage.
- Needs analytical balances, micro-applicators, growth chambers with controlled temperature/humidity, and dosing equipment for precise compound delivery.
- Demands cross-team standardization in larval staging, adult age synchronization, and scoring criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to alternative mosquito species or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as solvent compatibility (e.g., acetone for topical applications) and the need to minimize organism stress during handling.
