Name: ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学ぶバイサルファイトシーケンスとバイオインフォマティクス解析パイプラインを用いたミトコンドリアDNAメチル化の正確な定量法。BamH1消化によるリニア化が精度向上に不可欠で、ミトエピジェネティクス研究に有用です。

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ノボ ノルディスク基礎基本的な代謝研究センターは、ノボ ノルディスク財団から制限のない寄付によって部分的に資金を供給したコペンハーゲン大学で独立したセンターです。

1 制限酵素処理
<ol><li>病原位置 14258 人間のミトコンドリア dna を切る制限の酵素と全人間 DNA を扱うことによってミトコンドリア Dna をリニア化します。 注: マウス DNA を以下のように同一の条件の下で制限酵素 BglII を使用します。</li>
	<li>それぞれのサンプルがミトコンドリア Dna メチル化は、評価に 1 つ 0.2 mL 反応管を準備、(蛍光分析による定量化) 次ミックス: 3 μ g ゲノム DNA を追加の 15 μ L バッファー 3、3 μ L 病原とを 150 μ L の水</li>
	<li>37 ° C で 4 時間サーマルサイクラーにチューブを配置します。</li>
</ol>2. 重亜硫酸塩の変換
<ol><li>病原治療 DNA 亜硫酸水素ナトリウム29を他の場所で説明されているように変換します。</li>
	<li>各変換反応 20 μ L の容量で 200-500 ng 病原治療 DNA を使用します。DNA の回復は 50-70% であります。</li>
	<li>10 μ L の溶出バッファーの重亜硫酸塩の変換された DNA を溶出します。</li>
	<li>蛍光分析による単一座礁させた DNA を定量化します。</li>
	<li>省略可能: プロトコルの残りを進む前に-20 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換を格納します。長期保存用保存-80 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換</li>
</ol>3. 重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計
<ol><li>オンライン ツール Methprimer30と BiSearch31,32を使用して重亜硫酸塩の配列のプライマーを設計します。 注: Methprimer と BiSearch を許可するゲノム配列のプライマー結合塩基配列を検索する、シトシン、チミン、後重亜硫酸塩の処置と同様に変換されます。</li>
	<li>最適な増幅用プライマーの CpG のジヌクレオチドを回避し、100-300 bp 間増幅サイズをデザインします。</li>
	<li>設計されたプライマーを関数 BiSearch のプライマー検索を使用してミトコンドリア DNA を特定を確認します。既に設計されていた重亜硫酸塩の変換プライマーを挿入、重亜硫酸塩ボックスをチェックして、参照ゲノムと PCR パラメーターを含めます。 注: 可能な PCR の製品の一覧が表示されます。</li>
	<li>上の 1-5 のプライマー シーケンスをコピーし、オリゴヌクレオチド合成用注文フォームに貼り付けます。 注: 人間のリスト、表 1に実験室で検証されているマウス mtDNA のプライマー シーケンスが表示されます。</li>
	<li>重亜硫酸塩を使用してテスト プライマー PCR 次 agarose のゲルの電気泳動のステップ 4 で説明したように変換。テストおよび個別にすべてのプライマー対を最適化し、正しい私アンプリコン サイズ agarose のゲルに表示されることを確認します。 注: 多重プライマーが必要な場合追加 1 つに複数のプライマー PCR の反作用が単一し、PCR の製品 agarose のゲルの電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動法、類似の製品を区別するなどより resolutive 法に可視化サイズ。</li>
</ol>4. 重亜硫酸塩 PCR およびゲルの抽出の変換
<ol><li>興味の地域を増幅するには、ホット スタート Taq ポリメラーゼを用いた PCR を実行します。ミックス 100 ng 変換 DNA、500 μ M と反感覚プライマー、1 μ L dNTP ミックス (各 dNTP の 10 μ M)、およびポリメラーゼ 7.5 U/総量が 50 μ L の反応で簡単に言えば、以下の条件で PCR を実行: 95 ° C で 5 分間 (60 秒 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 サイクル10 分 72 ° c.別々 にどちらかのプライマーを使用または多重化します。</li>
	<li>省略可能: プライマーを多重化、200 ng を使用変換 DNA および次のサイクリング条件: 5 分 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 サイクル10 分 72 ° c. 注: 温度はプライマーの溶ける温度に応じて異なる場合があります。</li>
	<li>100 ボルトで 2% アガロースゲル電気泳動のゲルに主題の PCR の製品。</li>
	<li>穏やかな紫外線の下でメスと PCR の製品を抽出し、マイクロ チューブに追加。Pcr は DNA の損傷を避けるために過剰な紫外線には公開されません。30 以上の露光時間を避ける s。</li>
	<li>3を前述のようにゲルの浄化を使用して PCR の製品を浄化します。</li>
	<li>4.5 の手順から精製した DNA の定量化法を使用して。ステップ 5 または-20 ° C でストアのサンプルに進みます</li>
</ol>5. ライブラリの準備をシーケンス処理重亜硫酸塩
<ol><li>重亜硫酸塩の変換された PCR の製品のライブラリの準備を実行します。 オプション: この段階で PCR の製品を多重化します。</li>
	<li>最後修復まで 100 を使用してを実行 PCR の製品の ng。0.2 mL チューブで 55.5 μ L PCR の製品に 3 μ L 終わり準備酵素と 6.5 μ L 終わり修復反応バッファー (10 倍) を追加します。孵化後 65 ° C で 30 分に 20 の ° C で 30 分間熱 cycler でチューブを置き、</li>
	<li>15 μ L ブラント/TA リガーゼ ミックス、2.5 μ L と終わり修理 DNA を混合することによりシーケンス アダプターを縛るアダプターと 1 μ L 結紮エンハンサー。使用して場合 &lt; 入力として 100 ng の PCR の製品を希釈アダプター 10 倍。</li>
	<li>サーマルサイクラーにミックス (ステップ 5.3) を置き、20 ° C で 15 分間加温熱 cycler を一時停止し、ユーザー 3 μ l 添加チューブに酵素。ミックスし、サーマルサイクラーに戻って、チューブを置き、37 ° C で 15 分間加温</li>
	<li>サイズは、PCR の製品のサイズによって DNA にビーズの比を変化させた固体可逆的相固定 (スプリング) ビーズを使用してアダプター結紮 DNA を選択します。</li>
	<li>ステップ 5.4 と 55 μ L 再停止 SPRI ビーズからアダプター結紮 DNA に 13.5 μ L H2O を追加します。マグネット スタンドに 5 分と場所の管の室温で孵化させなさい。ソリューションが明確な上清を新しいチューブに転送し、ビーズを含むチューブを破棄します。 メモ: 上清に含まれるアダプター結紮 DNA と大きい不要なフラグメントは破棄されたビーズにバインドされます。</li>
	<li>ステップ 5.6 から上澄みを 25 μ L 再停止 SPRI ビーズを追加、ミックス、室温で 5 分間インキュベートします。マグネット スタンドにチューブを置き、解決策が明確なときに上澄みを廃棄します。 注: 破棄された上澄みの不要な DNA はアダプター結紮 DNA がビーズにバインドされているに対しに含まれています。</li>
	<li>チューブは、マグネット スタンドには、ビーズを洗浄する (新鮮な) 200 μ L 80% エタノールを追加します。孵化 30 s と削除および破棄上清。2 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
	<li>空気乾燥ビーズ チューブ中 5 分オープンふた付きのマグネット スタンドです。</li>
	<li>磁石からチューブを削除、23 μ L の溶出バッファーで DNA を溶出してミックスします。2 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>マグネット スタンドにチューブを置き、明確なソリューションでは、2 μ L 前 PCR 増幅 (ステップ 5.14) のための 96 ウェル PCR プレートに転送します。</li>
	<li>残り約 21 μ L を新しい 0.2 mL チューブ pcr (ステップ 5.17) に転送します。 注: するビーズは、次のステップの酵素反応を抑制することが、すべてのビーズを転送しないようにしてください。</li>
	<li>5.14 のステップまたは-20 ° C でストアのサンプルに進みます</li>
	<li>アダプター結紮 DNA を増幅するために必要なサイクルの数を推定する RT qPCR による事前 PCR 増幅を実行します。反応あたり 96 ウェル PCR で次プレート含む 2 μ L の DNA (ステップ 5.11) 追加: 0.4 μ L インデックス プライマー、0.4 μ L 普遍的な PCR プライマー、7.2 μ L H2O、10 μ L RT qPCR マスター ミックス。</li>
	<li>リアルタイム PCR マシンでプレートを置き、プレートを次の条件に対象: 30 98 ° c s (10 秒 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 サイクル5 分 65 ° C</li>
	<li>1 つの Ct 値の中古増幅 Rt-qpcr PCR の反作用のリニア フェーズの終了に対応する Ct 値を差し引くことによって各サンプルに必要な増幅サイクル数を推定します。</li>
	<li>混合することによってステップ 5.12 からアダプター結紮 DNA を増幅する: 21 μ L の DNA、25 μ L の PCR マスター ミックス、1 μ L インデックス プライマー、1 μ L の普遍的な PCR のプライマー、2 μ L H2o.熱 cycler で各サンプルを次の条件に対象: 30 98 ° c s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C)<img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg">サイクルの [ステップ 5.16 から計算される Ct];5 分 65 ° C 注: はのみを可能にする多重サンプルあたり 1 つのインデックスのプライマーを使用してください。インデックスは、PCR の間に挿入されます。</li>
	<li>増幅された DNA SPRI ビーズを浄化し、22 μ L の溶出バッファーで溶出します。</li>
	<li>ゲル電気泳動法または代替法によるライブラリの品質を制御します。正しいライブラリ ピーク サイズ (PCR の製品のサイズおよびアダプター) を探します。</li>
	<li>塗抹標本によるライブラリ製品の平均塩基対サイズを予測: 高度なグローバル設定で塗抹標本分析の下で「テーブル」をダブルクリックします。100-1000 bp から地域を定義し、 [ok]をクリックします。地域の表で、[定義された領域が表示され、ライブラリの平均サイズ (bp) が計算されます。</li>
	<li>蛍光分析によるライブラリを定量化します。ステップ 6 または-20 ° C にてストア ライブラリに進みます</li>
</ol>6. 次世代シーケンシング
<ol><li>数式を使用してライブラリの nM 濃度を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>同じ nM 濃度など 2 nM にライブラリを希釈 (4 を選択する nM、2 nM、1 nM、または 0.5 nM ライブラリ濃度に応じて)。2 nM ライブラリのプールを達成するためにすべてのライブラリをプールします。</li>
	<li>変性し、シーケンス楽器ガイドに従ってライブラリを希釈します。一言で言えば: 2 nM プールを 0.2 N 水酸化ナトリウムを追加することによって変性し、5 分 Dilute 22 の最終希釈する変性のプールの室温で孵化させなさい。変性し、12:05 の最終希釈する市販コントロール ライブラリを希釈します。新しいチューブ 20 : 05 コントロール ライブラリと 22 プールを混ぜます。 注: 重亜硫酸塩の変換は、非常に低い複雑さを紹介します。20% コントロール ライブラリ スパイクより良い品質になります。</li>
	<li>ディープ シーケンス器具を使用して 150 bp ペアエンド シーケンスを実行します。</li>
</ol>7. 解析 - 見積もりのメチル化レベル
<ol><li>(ここで、sample1_R1.fastq.gz と sample1_R2.fastq.gz と呼ばれる) .fastq ファイルを生成、関心の全体のゲノムのビスマルクのインデックスを生成する (ここではbismarkIndexと呼ばれるフォルダー) しているのゲノム配列を fasta で利用可能に形式 (ここでいるという名前のフォルダー)。</li>
	<li>アダプターおよびプライマーによって導入された先入観を削除する読み取り前処理: Trim_galore33] ツールを使用します。前方および逆引きの両方の読み取りの 5' 末端からヌクレオチドの 2 つを削除します。 trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o--trim1 - ペア/sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz。</li>
	<li>ビスマルク34を使用して全体のゲノムにあらかじめ処理された読み取りを配置します。 ビスマルク - 蟻 - bam o/./bismarkIndex/-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz。 注: 別アライナを使用する場合は、一意に配置することはできません読み取りが破棄されることを確認します。</li>
	<li>抽出読み取り M、ここでSamtools35を使用して染色体へのマッピング samtools ソート l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools インデックス sample1_sorted.bam samtools -u sample1_sorted.bam いるを表示 |samtools ソート-n-o BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>メチル化情報を抽出します。 bismark_methylation_extractor -p-CX ― cytosine_report ― ― 包括的な genome_folder./いる./sample1_chrM.bam</li>
	<li>さらなる分析のため、.bedGraph や、.cov CX_report.txt ファイルを使用します。Sample1_chrM.CX_report.txt ファイルを使用して、可視化とテストします。</li>
	<li>複数の領域を尋問し、プライマーのバイアスは、マッピング中に生成された M バイアス プロットで表示ことがある場合、前処理の段階でさらにクリッピングを実行します。詳細についてはビスマルクのマニュアルを参照してください。</li>
</ol>8. 解析 - 違いのテスト
<ol><li>CX_report.txt ファイルがすべて C M 染色体上の 7 列、染色体 (ここでいる)、位置、ストランド、メチル化された読み取りの数、非メチル化読み取り、C コンテキストおよび周囲のシーケンスの数含まれていることを確認します。</li>
	<li>CX_report は、そのままの状態でいるをカバーして、サブセットは増幅される領域をチェックしてください。</li>
	<li>個々 の c さんのフィッシャーの正確なテストまたは地域全体の符号テストなどのサンプル間の差は非パラメトリック テストを使用します。 注: 定量化頻繁に近くなります 0% メチル化、正規性の仮定が適切な理由であります。</li>
	<li>同様に、可視化、分位数を視覚化または二項割合の信頼区間を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li>
<li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58(2013).</li>
<li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166(2017).</li>
<li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li>
<li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li>
<li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse%2C+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li>
<li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+1%2C+cytosine+methylation%2C+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li>
<li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li>
<li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855(2013).</li>
<li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li>
<li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li>
<li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li>
<li>Byun, H. -M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1(2013).</li>
<li>Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment%3A+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li>
<li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739(2015).</li>
<li>Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li>
<li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li>
<li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation%2C+not+CpG+methylation%2C+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177(2017).</li>
<li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+cellr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279(2013).</li>
<li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytidylic+acid%3A+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li>
<li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/levels-and-distribution-of-5-methylcytosine-in-chordate-dna/oclc/15059352">Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA</a>. , 1-201 (1985).</li>
<li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li>
<li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li>
<li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li>
<li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethPrimer%3A+designing+primers+for+methylation+PCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li>
<li>Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiSearch%3A+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9(2005).</li>
<li>Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BiSearch+web+server%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431(2006).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</a> (2018).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin%3A+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li>
<li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li>
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著者は宣言する競合金融興味を持ってないです。

ここでは、ミトコンドリア Dna のメチル化を尋問するとりわけ設計されている重亜硫酸塩シーケンス プロトコルを提供します。重亜硫酸塩の配列使用プロトコルの DNA との違いは NUMT シーケンスから偽陽性発生して事前の制限の酵素の消化手順とバイオ情報解析の活用にあります。
ミトコンドリア Dna メチル化を調査するとき、重亜硫酸塩の配列のアーティファクトを除去するためのプロトコルを提供しています。無病誤診につながる重亜硫酸塩の配列アイテムは、以前に報告された37でした。DNA, プロテイナーゼ K をされているアクセサリ蛋白質の不十分な除去は、37をについて説明します。不完全な変性または部分的な reannealing につながる不完全な変換の可能性がある37単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスを下げることによって。後アーティファクト mtDNA のプレイで二次構造がシトシンへのアクセスを損なうかもしれない。我々 の知る限り、ミ...

ミトコンドリアのゲノムは約 16.5 キロ ベース (kb) の円形、二本鎖構造長い、重いと光の鎖を構成します。ミトコンドリアゲノムは母性継承、各セル内の複数のコピーに存在し、呼吸鎖複合体1の基本的なコンポーネントをエンコードします。同様に核ゲノムとは異なり、細菌のゲノムに、ミトコンドリアのゲノムは組織された多数の二次および第三構造などコイルとスーパーの構造2、アクセス困難なシーケンス処理中に表示することができます。実験3。
核内 DNA のメチル化、遺伝子発現の調節に特に多数のプロセスの役割を果たしている広範囲に研究エピジェネティックなマークです。哺乳類のゲノムの DNA のメチル化は deoxycytidines、主に CG ジヌクレオチド (CpG) のピリミジン環の 5 の位置に主に発生します。シトシンのメチル化は、DNA 塩基4体細胞と合計の ~ 1% のゲノムのすべての CpG の 70% で発見されます。DNA メチル化はまた公認会計士、CpT、クリック単価などの非 CpG のコンテキストに記載されているし、胚性幹細胞5,6,7ですべてのメチル化シトシンの 25% までの値と、核の DNA にさまざまな量で存在します。
核ゲノムのシトシンのメチル化は、広く、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の存在はまだ論争を呼びます。最初研究調査ミトコンドリア Dna メチル化は、核の DNA8と比較して低いレベルで培養細胞でミトコンドリア Dna のメチル化が検出されたで行われました。人間とマウスの細胞でミトコンドリア Dna のメチル化は低レベル (2-5%) も検出されました。メチル化 DNA 免疫沈降 (MeDIP) を定量的 PCR によって続いたなど 5 メチルシトシン キャプチャに頼るの試金を使用して、ミトコンドリア Dna メチル化様々 なマウスと人間にも認められた、細胞ライン9,10, 11,12。5-メチルシトシン ELISA の試金の質量に対する抗体を用いて、DNA のメチル化の実質的なレベルが検出された精製ミトコンドリア分画13,14,15,16します。 ただし、前述の調査の試金のほとんどは DNA メチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供するために設計されていない技術を使用します。
非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA コンテキスト17を変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用する「重亜硫酸塩の配列」という手法により定量的および resolutive の DNA メチル化解析が可能します。.重亜硫酸塩の配列を使用して、研究の方角は、さまざまなレベルにおけるシトシンのメチル化の有無を検出しました。人間18,19,20,21,22,23マウス24で検出された 16S 領域や、12 D ループ領域のメチル化 mtDNA組織・細胞研究にわたって合計シトシンの 1 ~ 20% の魅力的な変動でただし、します。
これらの数多くの研究と比較して私たちのグループからを含むのみいくつかの研究がミトコンドリア Dna メチル化3,25,26,27の存在を論じられるまたはの生物学的妥当性を疑問視ミトコンドリア Dna (2%) 以下のレベル28の非常に低レベル。最近、ミトコンドリア全重亜硫酸塩の配列3の潜在的な重亜硫酸塩の配列項目の観測を報告しました。我々 はそれによりメチル化レベルを過大評価してミトコンドリア DNA の二次構造は重亜硫酸塩の配列で、偽陽性につながる証拠を提供しました。MtDNA の重亜硫酸塩の変換のアーティファクトを防ぐためにプロトコルを示します。このプロトコルは、ミトコンドリア Dna の二次構造を混乱させると次の重亜硫酸塩の配列プロトコルの重亜硫酸塩へのフル アクセスを許可する DNA の簡単な酵素の消化力を使用します。さらに、重亜硫酸塩の配列の解析に伴うバイオ情報パイプラインを提供します。

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>#R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNAメチル化-ライトニングキット</td><td>Zymo Research</td><td>#D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>高感度DNAチップ</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 高感度 dsDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 試薬キット v2 300 cycles</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 リアルタイムPCR検出システム</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 蛍光光度計</td><td>Thermo Fisher Scientific</td># <td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア dna のメチル化の正確な検出のための方法論

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

DNA のメチル化の定量は、重亜硫酸塩の配列は、非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA のコンテキストでを変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用を使用して達成することができます。重亜硫酸塩の配列をすることができます (PCR を使用して) を対象とした全ゲノム上で実行やシトシンのメチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供します。特に二次構造の核およびミトコンドリア DNA の異なる性質を考えると、ミトコンドリア Dna のシトシンのメチル化を調査するための重亜硫酸塩の配列方法の adaptions が行われなければなりません。MtDNA の二次および第三構造は確かに不完全な変性の単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスの悪さのため偽陽性につながる成果物を配列する重亜硫酸塩につながることができます。ここでは、シトシンの正確な定量化にミトコンドリア Dna のメチル化レベルを許可する DNA の酵素消化による病原バイオ情報解析パイプラインと相まってプロトコルについて述べる。加えて、我々 は mtDNA に固有重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計のガイドラインを提供、望ましくない核ミトコンドリア セグメントをターゲットを避けるために (NUMTs) は、核ゲノムに挿入されました。

ミトコンドリア Dna のメチル化を調査する場合に、このプロトコルの 2 つのステップが重要です。1) 二次構造と 2) ミトコンドリア DNA 特異プライマーの設計の開口部。
制限酵素病原 (図 1) ヒトのゲノム DNA を消化によってミトコンドリア DNA の構造は塩基位置 14,258 カットされ、二次構造が表示されます。
そのまま mtDNA 二次構造の重亜硫酸塩の変換の可能な障害は、mtDNA unconversion 率を過大評価する可能性が高いです。重亜硫酸塩の配列による mtDNA の unconversion レートを調べた、未消化し、ミトコンドリアのゲノムの 5 つの異なる地域でのヒトの骨格筋細胞から全 DNA を消化: 変位ループ (D-ループ)、t...

ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA の酵素消化をについて説明します。

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

このバイサルファイトシーケンシングプロトコルとバイオインフォマティクスパイプラインの全体的な目標は、ミトコンドリアDNAメチル化の正確な定量化を達成することです。この方法は、ミトコンドリアDNAメチル化がヒトの病気を変えるのかなど、マイトエピジェネティックな分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ミトコンドリアDNAメチル化の正確な定量を可能にすることです。ミトコンドリアDNAのメチル化を研究する際の重要なステップは、亜硫酸水素ナトリウムで処理する前に、BamH1消化によってミトコンドリアDNAを直鎖化することです。BamH1制限酵素部位は、このヒトミトコンドリアゲノムのマップに示されています。また、バイサルファイトシーケンシングによって調査されるミトコンドリアゲノムの5つの領域も示されています。置換ループ、tRNAフェニルアラニン、および12Sリボソーム、16Sリボソーム、NADHデヒドロゲナーゼ5、シトクロムB mRNAコード遺伝子。バイサルファイトシーケンシング用のプライマーを設計した後、テキストプロトコルに記載されているオンラインツールを使用して、BiSearchを使用してミトコンドリアゲノムに対するプライマー特異性を確認します。BiSearch機能のプライマー検索にプライマー配列が追加されます。バイサルファイトのボックスがチェックされ、参照ゲノムが選択されます。検索結果には、センス鎖とアンチセンス鎖で生成された可能性のあるPCR産物が表示されます。バイサルファイト変換ミトコンドリアゲノムから関心領域を増幅するには、Hot-start Taqポリメラーゼを使用してPCRを行います。プライマーを別々に使用する場合は、100ナノグラムの変換DNA、500マイクロモルのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、1マイクロリットルのdNTP混合物、およびポリメラーゼを1反応あたり7.5単位、総容量50マイクロリットルで混合します。次の条件でPCRを実行します:摂氏95度で5分、摂氏94度で1分、摂氏55度で1分、摂氏72度で1分で35サイクル、続いて摂氏72度で10分間。マルチプレックスプライマーの場合、200ナノグラムの変換DNAを次のサイクル条件で使用します:摂氏95度で5分、摂氏94度で1分、摂氏55度で1.5分、摂氏72度で1.5分、摂氏72度で10分間、摂氏72度で10サイクル。PCRが完了したら、2%アガロースを100ボルトで使用して、PCR産物に対してゲル電気泳動を行います。アガロースゲルからのPCR産物の抽出は、UV曝露とDNA損傷のリスクを最小限に抑える方法で行う必要があります。UVライトの下でゲルの写真を撮ります。その後、非常に迅速に、メスでPCR産物の周囲に印を付け、UVライトをオフにします。次に、PCR産物を紫外線にさらさずにゆっくりとカットします。ゲルスライスを微量遠心チューブに入れ、テキストプロトコルに記載されているゲル精製を使用してPCR産物を精製します。精製したDNAを蛍光測定法を用いて定量します。サンプルは摂氏20度で保存し、そうでない場合はすぐにバイサルファイトシーケンシングライブラリ調製に進みます。バイサルファイト変換PCR産物のライブラリー調製を開始するには、最大100ナノグラムのPCR産物を使用して末端修復を行います。各0.2ミリリットルのチューブに、55.5マイクロリットルのPCR産物、3マイクロリットルの末端調製酵素、および6.5マイクロリットルの10X末端修復反応バッファーを追加します。サーモサイクラーでチューブを20°Cで30分間インキュベートし、続いて65°Cで30分間インキュベートします。次に、末端修復されたDNAを15マイクロリットルのBlunt/TAリガーゼミックス、2.5マイクロリットルのアダプター、および1マイクロリットルのライゲーションエンハンサーと混合することにより、ライゲートシーケンシングアダプターを作製します。混合物をサーモサイクラーに入れ、摂氏20度で15分間インキュベートします。サーモサイクラーを一時停止し、各チューブに3マイクロリットルのUSER酵素を追加します。チューブを混合してサーモサイクラーに戻し、摂氏37度で15分間インキュベートします。サイズ:固相可逆固定化またはSPRIを使用してアダプターライゲーションDNAを選択します。アダプターライゲーションDNAに13.5マイクロリットルの水と55マイクロリットルの再懸濁されたSPRIビーズを加えます。室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置きます。溶液が透明になったら、アダプターライゲーションされたDNAを含む上清を新しいチューブに移し、ビーズの入ったチューブを捨てます。25マイクロリットルの再懸濁されたSPRIビーズを上清に加えます。混合し、室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置き、溶液が透明になったら上清を捨てます。これで、アダプターライゲーションされたDNAがビーズに結合します。チューブをマグネットスタンドに置いた状態で、新たに調製した80%エタノールを200マイクロリットル各チューブに加え、30秒間インキュベートしてビーズを洗浄します。上清を取り除き、廃棄します。このエタノール洗浄ステップを合計2回の洗浄を繰り返します。2回目の洗浄からエタノールを取り出し、チューブをマグネットスタンドに置いたまま蓋を開けて5分間ビーズを風乾します。5分後、チューブをマグネットスタンドから取り外し、ビーズに23マイクロリットルのDNA溶出バッファーを加えて混合します。室温で2分間インキュベートします。溶液が透明になるまで、チューブを磁気スタンドに置きます。次に、2マイクロリットルの溶液を96ウェルPCRプレートに移し、PCR前増幅を行います。ビーズを慎重に避けながら、残りの溶液を新しい0.2ミリリットルチューブに移し、PCR増幅を行います。RT-qPCRによるPCR前増幅を行い、アダプターライゲーションDNAの増幅に必要なサイクル数を推定します。インデックスプライマー0.4マイクロリットル、ユニバーサルPCRプライマー0.4マイクロリットル、水7.2マイクロリットル、RT-qPCRマスターミックス10マイクロリットルの反応ごとに、以下のマスターミックスを作製します。次に、マスターミックスを混合し、96ウェルPCRプレートの2マイクロリットルのDNAに18マイクロリットルのマスターミックスを加えます。プレートをリアルタイムPCR装置にセットし、98°Cで30秒、98°Cで10秒、65°Cで75秒で20サイクル、65°Cで5分間の条件下で増幅を行います。テキストプロトコルに記載されているように、各サンプルに必要な増幅サイクルの数を推定した後、アダプターライゲーションされたDNAを増幅します。各サンプルについて、21マイクロリットルのDNA、25マイクロリットルのPCRマスターミックス、1マイクロリットルのインデックスプライマー、1マイクロリットルのユニバーサルPCRプライマー、および2マイクロリットルの水を混合します。サーモサイクラーで、各サンプルを次の条件にさらします:計算されたサイクル数で摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏65度で75秒、続いて摂氏65度で5分。前述したように、増幅したDNAをSPRIビーズを用いて精製し、22マイクロリットルの溶出バッファーで溶出します。Bioanalyzerを使用してライブラリの品質を制御します。正しいライブラリのピークサイズを探します。スメア分析により、ライブラリ製品の平均塩基対サイズを推定します。[Advanced Global Settings] の [Smear Analysis] で、[Table] をダブルクリックします。100 から 1000 の塩基ペアの領域を見つけて、[OK] をクリックします。[Region Table] に、定義されたリージョンが表示され、ライブラリの平均サイズが計算されます。蛍光測定法によるライブラリーの定量化。ライブラリは、次世代のシーケンシングおよび計算解析の準備が整うまで、摂氏 20 度で保存します。バイサルファイトシーケンシングにより、ミトコンドリアゲノムの5つの異なる領域で、ヒト骨格筋細胞の未消化および消化された全DNAでミトコンドリアDNAメチル化を調査しました。完全な正方形は、シトシングアニンジヌクレオチド部位を表します。白四角は、非シトシングアニンジヌクレオチド部位を表します。未消化のミトコンドリアDNAの場合、メチル化レベルは調査したすべての領域で0〜15.1%の範囲でした。しかし、バイサルファイト変換前にDNAを消化すると、アンコアコンバージョン率はすべての領域で最大1%に低下しました。これは、ミトコンドリアDNAメチル化レベルの過大評価を避けるために、バイサルファイト変換前のBamH1消化の重要性を示しています。このビデオを見れば、ミトコンドリアバイサルファイトシーケンシングの方法についてよく理解できるはずであり、当社のバイオインフォマティクスパイプラインに従うことで、ミトコンドリアDNAメチル化の正確な定量化を達成することができます。

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のためのプロトコルを示しています。 MeDIPは、選択的に5 - メチルシトシン（抗- 5...

メチル化DNA免疫沈降

DNAメチル化解析のためのゴールドスタンダードは、重亜硫酸変換したDNAのゲノム配列決定です。このメソッドは、酸性条件下で脱アミノ化を亜硫酸、5 - メチルシトシン（5 -...

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。...

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

このビデオでは、ナイロン膜上でのDNAサンプルのブロッティングとその後のモノクローナル抗体による可視化により、in...

DNAメチル化の程度を決定するための5-メチルシトシンドットブロット

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencingは、制限酵素消化とシトシンバイサルファイト変換を組み合わせたDNAメチル化解析のためのシーケンシングライブラリを調製する方法です。このプロトコルでは、50...

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

ここでは、単一細胞における絶対ミトコンドリア(mt)DNAコピー数とmtDNA欠失ヘテロプラスミーレベルを測定するためのプロトコルを紹介します。...

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

パイロシーケンシングアッセイは、ヘテロプラズマ細胞または組織におけるミトコンドリアDNA一塩基多型の堅牢かつ迅速なジェノタイピングを可能にします。...

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング

mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。...

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

学ぶバイサルファイトシーケンスとバイオインフォマティクス解析パイプラインを用いたミトコンドリアDNAメチル化の正確な定量法。BamH1消化によるリニア化が精度向上に不可欠で、ミトエピジェネティクス研究に有用です。

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

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