Name: 単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶ単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション（smFISH）を用いて、出芽酵母の栄養増殖期と減数分裂期における個別RNA分子の検出・定量法。この手法は遺伝子発現の細胞間変動とRNAの亜細胞局在を明らかにし、遺伝子制御研究に有用です。

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アン ・ ドッドソン感謝やステファニーハインリッヒ smFISH プロトコルを最適化する方法についてのアドバイスをザビエルの Darzacq 解析プラットフォーム、統計解析に関する提案 Haiyan 黄を助けます。この作品は、ダイムの月 (5-FY15-99)、ピュー慈善信託 (00027344)、デイモン ・ ラニアンがん研究振興財団 (35-15) と EÜ、グレン財団、NSF の大学院研究奨学金の付与号からの資金によって支えられました。JC に DGE 1106400。

メモ: すべてのバッファーとこのプロトコルで使用されるメディアは、表 1に表示されます。試薬用のベンダー情報は、材料のテーブルに表示されます。
一日 1/一日 1-2:
注: 栄養文化の細胞を好ましい媒体で 0.4 〜 0.6 の OD600に成長します。減数分裂文化受ける減数分裂 (1.85 の OD600で通常養殖) 最寄りのメソッドを使用してセルを誘発します。
1. サンプルの固定法と消化
<ol><li>3% ホルムアルデヒドのセルの ~3.5 OD600の合計を修正します。<ol>
<li>植物の文化文化の 5.52 mL を 15 mL の円錐管に 37% ホルムアルデヒドの 480 μ L に追加します。</li>
		<li>減数分裂の文化文化の 1840 μ L を 2 mL マイクロ遠心チューブ用の 37% ホルムアルデヒドの 160 μ L に追加します。〜 5 回を逆転してミックスします。 注意: ホルムアルデヒドは有毒です。処理、制度上の規則に従って処分してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で 20 分間のローラー ドラムにチューブを置きます。減数分裂のサンプル、20 分間室温で修正した後継続、4 ° C で一晩固定、回転します。 注: 一晩固定再現性と減数分裂のサンプル取得した smFISH データの品質が向上します。固定時間を最適化する必要があります。</li>
	<li>サンプルを修正しながら 200 mM バナジル リボヌクレオシド複合体 (VRC) の少なくとも 10 分の 65 ° C に解凍します。</li>
	<li>15 mL チューブに消化マスター ミックスを調製: 1 サンプル、200 mm (65 ° C に加温); VRC 40 μ L でバッファー B の 425 μ L をミックス5 つのサンプルで 200 mM (65 ° C に加温) VRC の 200 μ L でバッファー B の 2125 μ L をミックスします。渦 ~ 5 s VRC 添加後明るい茶色緑が表示されます、マスターのミックスに追加する前に、VRC を完全に再懸濁します。 注意: 消化中に添加 VRC はザイモリエイスの混合物は、粗抽出物から精製されたによって導入されるヌクレアーゼ汚染物質を阻害することによって可能性があります smFISH 結果の一貫性向上します。VRC のこのステップで必要な量を最適化してください。</li>
	<li>植物サンプルの 3 分間 ~ 1057 x g でチューブを遠心します。(一晩固定) 後減数分裂サンプル 1.5 分デカント 21,000 × g で遠心分離機またはホルムアルデヒド無駄に上清を吸引します。 注: すべての遠心分離手順は、室温で実行されます。</li>
	<li>上下にピペッティングか、チューブを反転してミックスするフリックは、コールド バッファー B の 1.5 mL の細胞を再懸濁します。再懸濁後、植物サンプルを 2 mL チューブに転送します。</li>
	<li>21,000 × g で遠心する 1.5 分削除液体のバルクは真空吸引によりピペッティング、〜 100 μ L を残してします。</li>
	<li>コールド バッファー B の 1.5 mL の細胞を再懸濁します</li>
	<li>21,000 × g で遠心する 1.5 分削除液体のバルクは真空吸引によりピペッティング、〜 100 μ L を残してします。</li>
	<li>液体真空によって完全にまたはピペッティングによる冷たいバッファー * 1.5 分吸引 21,000 × g で遠心の 1.5 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>消化のマスターの組合せ、および簡潔に再懸濁しますに渦の 425 μ L で細胞を再懸濁します。各チューブに 100 t 10 mg/mL ザイモリエイスの 5 μ L を追加します。 注: 渦ザイモリエイス前にチューブを追加するたびに。マスターのミックスに追加するのではなく、個別に各チューブにザイモリエイスを追加します。両方の手順は、ザイモリエイスはすぐに析出するため消化管の間で一貫性を維持に役立ちます。</li>
	<li>渦 2-3 s をミックスします。ローラー ドラムのチューブを置き、15-30 分のための 30 ° C に消化します。栄養細胞は、減数分裂初期 ~ 15 分かかります、減数分裂前期と減数分裂の部門は、通常かかります 〜 30 分。 注: 15 分後 5 分毎に顕微鏡を確認、非透明性と非屈折細胞の約 80% が表示される場合、消化を停止します。この時点から細胞が非常に壊れやすい。セルをそっと扱うし、真空吸引またはボルテックスを使用しないでください。
</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でチューブ液体完全にピペッティングによる。</li>
	<li>優しく上下に 1-2 回をピペットで 1 ml のバッファー B の細胞を再懸濁しますミックスします。</li>
	<li>ピペッティングで ~ 376 x g で 3 分間削除バッファー B 液でチューブを遠心します。優しく (RNase フリー水で希釈) 70% エタノール 1 mL に細胞を再懸濁します。</li>
	<li>3.5-4 時間室温で孵化させなさい。</li>
</ol>2. 交配
<ol><li>部屋の温度にホルムアミドをもたらす (50 mL の約数のかかる 〜 30 分湯せんで)。 注: ボトル ホルムアミドの酸化を避けるために部屋の温度に達するまでは、ホルムアミド ボトルを開かないでください。 注意: ホルムアミドは有毒です。処理、制度上の規則に従って処分してください。</li>
	<li>15 mL の円錐管に 10% ホルムアミド洗浄バッファーを準備します。</li>
	<li>ピペッティングで 70% のエタノールの 3 分を削除 500 μ L の ~ 376 x g でチューブを遠心します。優しく上下に、残りの細胞を再懸濁します、低接着管にセルを転送ピペット。 注: は大幅低接着管を使用後の洗浄中にセル損失を低減します。</li>
	<li>ピペッティングによるすべてのエタノール ~ 376 x g で 3 分間削除で再度チューブを遠心します。</li>
	<li>上下に 2-3 回の 10% ホルムアミド洗浄バッファー、およびゆっくりピペット 1 mL を追加、細胞を再懸濁します。</li>
	<li>交配のソリューションを準備している間 〜 20 分室温に坐るため細胞を許可します。1 サンプルの交配バッファー (部屋の温度) の 50 μ L、5 μ L 200 mM (65 ° C に温めて) VRC の各プローブ (200 nM ファイナル) の 1 μ L をミックスします。5 つのサンプルで交配バッファー (部屋の温度) の 250 μ L、200 mM (65 ° C に温めて) VRC の 25 μ L、5 μ L の各プローブ (200 nM ファイナル) をミックスします。<ol>
<li>ホルムアミドの酸化を防ぐために管を開く前に、部屋の温度に交配バッファー (-20 ° C で凍結) を解凍します。</li>
		<li>200 mM VRC、渦、プローブを追加する前に 5 10 秒を追加した後して、商業的に購入は、製造元の指示に従って再構成されました。</li>
		<li>2 つのプローブが共同培養の場合追加 1 μ L、1:10 のプローブ #1 株だけでなく、1 μ L、1:10 の希釈の最終的な希釈を行うため、プローブ #2 株式の希釈 〜 プローブのレバレッジ。信号対雑音比最高のニーズに必要な濃度を最適化 (詳細についてのディスカッションを参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清有害廃棄物にピペッティングによる。</li>
	<li>各チューブに交配ソリューションの少なくとも 50 μ L を追加します。ミックス チューブをフリックします。</li>
	<li>暗闇の中で、少なくとも 16 時間ローラー ドラムの 30 ° C で孵化させなさい。</li>
</ol>2 日目/3 日目
3. 洗浄およびイメージング
<ol><li>ホルムアミドを室温に戻します。</li>
	<li>15 mL の円錐管に 10% ホルムアミド洗浄バッファー (FWB) を準備します。</li>
	<li>ローラー ドラムからチューブを外し、光から保護するためにホイルで覆われたボックスにそれらを置きます。</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清有害廃棄物にピペッティングによる。</li>
	<li>優しく上下にピペットで 1 mL の 10 %fwb で再懸濁します 2-3 回。</li>
	<li>ホイルで覆われたボックスで 30 分 (回転しない) 30 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>3 分は、ピペッティングで有害廃棄物に上清を除去のために ~ 376 x g でサンプルを遠心し、〜 50 μ L のまま。</li>
	<li>一方、15 mL の円錐管に DAPI/FWB を準備: 1 サンプル、5 Mg/ml の DAPI の 1 μ L で 10% ホルムアミド洗浄バッファーの 1000 μ L をミックスします。10 個のサンプルの 5 mg/mL DAPI の 10 μ L と 10 mL の 10% ホルムアミド洗浄バッファーをミックスします。優しく上下にピペットで 1 mL DAPI/FWB ので再懸濁します 2-3 回。</li>
	<li>ホイルで覆われたボックスで 30 分 (回転しない) 30 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>氷の上の反漂白剤試薬を解凍します。</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清完全にピペッティングによる。必要な場合は遠心上清のすべてを削除する再び。</li>
	<li>時に、すぐにサンプル、50 μ L の酵素 GLOX バッファーなしでペレットを再懸濁します。上下ピペット 3-4 回をミックスします。<ol>
<li>すべての unimaged サンプル ボックスのままホイルで覆われた 4 ° C で準備が整うまでイメージに。イメージする準備ができたら、2 分間 ~ 376 x g でサンプルを遠心し、ピペッティングで清を完全に除去。以下の酵素と GLOX で再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルをすぐにイメージされる、GLOX バッファーと酵素の 15-20 μ L を追加します。ミックスを上下に優しくピペット。 注: 追加ボリューム細胞ペレットのサイズによって異なります。我々 は 15 μ L の酵素とバッファーを GLOX ので、ペレットを再をお勧めし、顕微鏡で細胞密度を確認します。細胞は密度が高すぎる (互いの上に群生していること細胞) である場合は、酵素と余分な GLOX バッファーを追加します。細胞はまばら、遠心分離機のサンプル、~ 5 μ L のバッファーを削除します。</li>
	<li>ピペット 5 coverslip (18 mm × 18 mm、第 1)、およびスライドの coverslip を入れて上に μ L。</li>
	<li>Coverslip の配置場所研究室ワイプ、スライドの上を置きます。研究室ワイプを軽く押して、スライド (液体、カバーガラスのすべての 4 つのエッジから外れを参照する必要があります) に設定します。</li>
	<li>スライドをアルミ箔で覆われた箱で顕微鏡室に転送します。</li>
	<li>高倍率 (60 〜 100 倍) と高開口数ワイド フィールド蛍光顕微鏡を使用してイメージ。 注: smFISH プローブによって放出されるフォトンの最大数を収集するには、共焦点顕微鏡は推奨されません、彼らが収集する光の量を大幅に制限します。ここでは、データが収集された 100 X 1.4 NA 目的を搭載した顕微鏡を使用してフィルター CY5 1.3 でイメージ (EX632/22, EM679/34) s、100 %t;TRITC (EX542/27、EM597/45)、1.3 s、100 %t;DAPI (EX390/18、EM435/48) 0.05 0.1 s、32%-50 %t.明るいフィールド参照画像も取得する必要があります。0.1 から 0.2 のステップ サイズで 15 25 スライスを取得 μ m から完全に上記のビューのフィールドのフォーカス以下完全すべてのことを確認するために RNA のスポットに対応します。</li>
</ol>4. 画像解析
<ol><li>魚クワント17など StarSearch2、公開された smFISH 分析ツールや実験の正確な要件に応じてのオーダー メード プログラム smFISH のデータを分析します。 注: 良い解析パイプラインにより、ユーザーは、背景から真の RNA スポットを分離し、X、Y、および Z (オプション) 座標と各スポットでは、各セルでのスポットの数の強さなどの統計情報を出力するしきい値を決定するには、とおそらく誤検出を排除する方法としてパラメーターを調整します。</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

ここで提示されたプロトコルその他公開されている smFISH プロトコル2,3,21,22,23から派生した、酵母のひずみ背景 SK1 用に最適化されました。携帯番号、固定期間、遠心分離速度と期間、消化期間、消化バッファー、プローブの濃度および交配バッファー最適化されたパラメーターが含まれています。交配の温度や時間などの他のパラメーターが最適化されていません。このセクションでは、任意の酵母のひずみ背景および興味の成長条件にこのプロトコルの適応に役立つだろういくつかのメモを共有します。
出芽酵母の細胞壁は細胞壁がプローブの浸透を防ぎますので出芽酵母における高品質 smFISH 画像の取得に対して 1 つの主要な課題です。ザイモリエイスによる細胞壁の不完全な消化力は、プローブと信号の高細胞間変動の非能率的な交配につながります。しかし、過剰消化できる細胞も壊れやすい、洗浄のステップの間に細胞の損失と細胞のイメージングのためのスライドの準備の間に破裂につながる重要です。したがって、消化の時間を最適化することが重要です。時間の量が異なるため同じサンプルの消化によってパイロットの smFISH の実験をお勧めします。細胞の約 80% が非屈折となったとき、我々 は消化を停止された場合私たちのケースでは、最高の smFISH データを得られました。通常、同じ成長条件の異なる遺伝的突然変異系統を似たようなタイミングで消化することができます。ただし、生育条件と出芽酵母における減数分裂のさまざまな段階の間で比較した場合消化の時間が異なります。一度タイミングを決定すると、smFISH の品質、再現できます。注、15 分未満ザイモリエイスの異なるバッチの使用で完了できます消化不良細胞壁合成や組成変異株のも若干消化のタイミングを変更可能性があります。
プローブの最適濃度は、高い信号対雑音比を達成するために必要です。設計し、商業的に私たちの smFISH プローブを購入しました。良いプローブ (多くの場合 20-mers) 35% から 45%、2 塩基プローブや低交差間の最小間隔に至るまで GC の割合が必要です。プローブのリストを生成するメーカーから web ベースのプローブ デザイナーを用いて、オーバー ラップよりも 17 の塩基対のプローブを排除する出芽酵母ゲノムのデータベースで BLAST アルゴリズムに使用私たちから選択する十分な調査があった場合他のゲノムの領域。我々 はこのセットで満足のすべての上記の条件 (20 本) プローブ数が低かったのでNDC80白頭(CF 590) のユニークな地域に焼鈍プローブ セットのためにもっとある蛍光色素 (CAL Fluor 590) を選んだ、(〜 25 プローブ) の製造元の推奨最小数です。製造元の指示に従ってプローブ ソリューションを再構築後、1:10 を行い原液の希釈、-20 ° C で 5 μ 因数で希釈した溶液を保存します。各因数は 1 回だけ使用されました。最適化、1 つはシリアルする必要があります、1:10 からの希釈希釈ソリューションとテスト集中が最高の信号対雑音比が得られます。1: 250、1: 500、1: 1000、および元の在庫から集の希釈系列をお勧めします。私たちの場合、1: 500 希釈倍率結果 CF 590 および Q 670 の両方のプローブ セットのため、最高の信号対雑音比。
最適な固定時間も出芽酵母で成功した smFISH のため重要です。その一晩の固定は 4 ° C、ある我々 は、一貫性と減数分裂のサンプルの smFISH 結果の品質を大幅に向上、20 分間室温で固定するのではなく。我々 がテストしていませんがどのように一晩固定の植物サンプルに影響を与えるかもしれない、この成長条件、室温での固定がうまくいきました。したがって、新種の成長条件 smFISH プロトコルを最適化して、お勧めします室温で短い固定時間から始まると信号の高い変動が発生した場合、固定時間を増やします。
他公開プロトコル3,22,23と比較して、我々 のプロトコルは、消化と交配時 VRC の高濃度の間に RNase 阻害剤 VRC を使用します。VRC のこれらの 2 つの手順を加えて改善 smFISH 結果の一貫性おそらくより良いザイモリエイス ミックス (酵素の粗抽出物から精製した、RNase を含めることができますが導入される可能性がありますのヌクレアーゼ活性に対する RNA 分子を保持します。汚染物質)。したがって、プロトコル最適化の VRC のさらに高い濃度の記載されている VRC の量を使用をお勧めします。
細胞のかなりの部分はバッファー B とホルムアミド洗浄バッファーで洗浄のステップ中に失われます。セル損失を減らすためには、1 つは遠心分離速度を増加可能性があります。私たちのケースでバッファー B 中に我々 のサンプルをペレットに高速 (21,000 x g) を使用して大幅に削減セル損失を洗います。ただし、セルにザイモリエイス消化後非常に壊れやすい、遠心分離速度の変更は推奨されません。代わりに、ホルムアミド洗浄バッファーで洗浄中に細胞のペレットを助ける米国科学から低付着の管の使用をおすすめします。全体的にみて、私達のプロトコルは一貫して効率的なイメージングのため十分な高密度の細胞の膜を生成できます。通常は、7 の視野を得られるはず > 130、定量化のため適当な細胞。
最後に、最適パラメーターおよび画像解析から必要な出力を決定することが重要です。公開されている解析プログラムは smFISH スポットを検出、一般的バック グラウンド信号を削除するガウス カーネルを使用して raw 画像をフィルターし、画像2,17の各セットで使用する信号対雑音比を決定してもらいます。残念ながら、現在、適切なパラメーターが決定する単一の標準はなく、だからこれらさまざまな設定のいくつかの実証的な検証が必要です。これらの各手順に必要なパラメーターを設定するには、繰り返し別のパラメーターのセットを入力し、どれだけ各セットから得られた結果と一致するいくつかの代表的な細胞で手動カウントからチェックが必要です。1 組のパラメーターが見つかると、一度は、生育条件や遺伝的背景にもかかわらず得られた画像のほとんどに使えます。
さらに、1 つは smFISH 画像の最大強度投影できる定量化22の前に実行する場合をテストできます。この手順では、スポットの検出アルゴリズムを簡素化し、彼らの細胞レベル下のローカリゼーションなど、個々 のスポットに関するいくつかの潜在的に有用な情報を犠牲にしても、撮像時間を大幅に短縮します。私たちのケースでNDC80遺伝子によって生成される mRNA の分子の数はこの処理 (新進の転写物酵母3、7のためか珍しく) 後、スポットは分かれても十分に低かった。共局在解析が重要な場合は、解析パイプラインの共存を評価するためにそれぞれのチャネル内の各 smFISH スポットの場所を決定する必要があります。特定の質問に応じて求められている、各スポットの強度などの他の情報も詳しく分析するためパイプラインから抽出する必要があります。プロトコル キーを最適化する手順し、画像解析パイプラインは興味のある質問を研究する smFISH データの高品質を得ることが重要です。

遺伝子発現の動的な制御は、代謝環境ストレス、感染症、および変更への応答と同様、有機体の開発をドライブします。転写制御に焦点を当てる研究は RNA 量測定技術に頼る。単一分子蛍光性上皮内交配 (smFISH) と呼ばれる 1 つそのような方法は、単一セル1,2で個々 の RNA 分子の検出に使用します。このメソッドでは、遺伝子発現、細胞間の変動の測定と細胞内の RNA の局在性の決定をことができます。
最も一般的に使用される smFISH の手法で個々 の RNA 分子の検出は、複数短い DNA のプローブ (多くの場合 ~ 48 20 mer プローブ) 標的 RNA を補完し、同じ蛍光色素の共役を必要があります。弱い信号における単一蛍光プローブの結合結果が、すべてのプローブのアンサンブルからの信号は堅牢です。にもかかわらず、単一のプローブでは、ターゲットからバインディングを表わすことができる、このような信号は、ターゲット RNA 分子3のに比べて非常に弱いと予想されるので、この機能は信号対雑音比を大幅に向上します。検出の誤差範囲内で RNA 分子の数をカウントし、様々 な成長条件と異なる突然変異体間で比較できます。
その最初の開発以来 smFISH は、遺伝子式4、転写伸長1,2,5,6、7を破裂転写スプライシングなどのさまざまな側面を研究する適応されています,8,9細胞内の対立表現10、11,12RNA 局在13,14,15最近、我々 の同じ遺伝子の 2 つの議事録フォームの発現を研究するこのメソッドを使用している短い写しアイソ フォーム (NDC80ORF) 長いアイソ フォーム (NDC80白頭と共有の全体のシーケンスを)16。2 つのプローブ セットを用いて 2 つの mRNA のアイソ フォームを一意に識別するには、: 1 セットはNDC80白頭一連のユニークな他の設定では、他の蛍光色素の共役を 2 つのアイソ フォームの共通の領域にバインドします。一方では両方の蛍光信号のNDC80白頭RNA をコードして, スポットとして識別、 NDC80ORF RNA は一般的なプローブ セットからの信号のみが含まれています。数、 NDC80ORF自信を持って smFISH スポットを特定し、エラーを削減するプローブの交配の高効率化と高い信号対雑音比が必要、成績証明書を「差分」法による計算伝搬します。
本稿では、出芽酵母酵母の smFISH を実行するための最適化されたプロトコルについて説明します。SK1 ひずみ背景出芽酵母の中の栄養このプロトコル、セル数、固定時間、消化時間、消化バッファー、プローブの濃度および交配の smFISH 実験のために使用されるバッファーに最適化成長または減数分裂です。しかし、我々 はこの原稿でなお: (1) 画像集録、およびプロトコル別の系統の背景と成長条件の最適化が必要で (2) の手順を実行後、smFISH データの品質をチェックするようメソッド。

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td> -<td>20°Cで保存してください。</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ</td><td>C3515</td>は<td>4°Cで保管します。短期の場合はC。使用前に渦巻きます。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9564</td>は<td>-20°Cで保管します。水中で再構成した後のC。光から保護してください。</td></tr><tr><td>50%デキストラン硫酸Milli</td><td>Pore</td><td>S4030</td><td>室温で保存してください。非常に粘性のある液体。忍耐強く扱います。</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>-20 °Cで保存。水中で再構成した後のアリコート中のC。</td></tr><tr><td>エタノール(100%、200プルーフ)</td><td>各種</td><td></td><td>可燃物。</td></tr><tr><td>37%ホルムアルデヒド</td><td>フィ</td><td>ッシャーF79-500</td>室温<td>で保存します。毒性。注意して使用および廃棄してください。</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>アンビオン</td><td>AM9342</td><td>4°Cで保管し、酸化を防ぐために室温に平衡化した後に開きます。毒性。使用および廃棄には注意して行ってください。&nbsp;</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>は4</td>°Cで様々な<td></td><td>ストア。ヌクレアーゼフリー水に溶解した後のC。</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma</td><td>G2133</td>は<td>-20°Cで保存します。50 mM NaOAc、pH 5で再構成した後のアリコート中のC。</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーの水</td><td>アンビオン</td><td>AM9932</td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>リン酸カリウム(一塩基性および二塩基性)</td><td>各種</td><td></td>室温<td>で保存してください。</td></tr><tr><td>プローブライブラリ、TE、pH 8.0&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>ストアは -20 °C;アリコート中のC(5 &micro;L)TE pH 8.0で再構成した後、メーカーの指示に従ってください。光から守ってください。&nbsp;</td></tr><tr><td>ソルビトール</td><td>各種</td><td></td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>TE、pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>-20 &deg;アリコートのC。</td></tr><tr><td>200 mM バナジルリボヌクレオシド複合体 (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>-20 °C で保存。再構成後のアリコート中のC、メーカーの指示に従ってください。</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals 08320932</td><td></td><td>-20 °Cで保存されています。水中で再構成した後のアリコート中のC。</td></tr><tr><td>低接着チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>室温で保存してください。</td></tr></tbody></table>

単一分子蛍光in-situハイブリダイゼーション (smfish) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

単一分子蛍光の in situハイブリダイゼーション (smFISH) は、その能力を検出し、個々 の RNA 分子をカウントのための単一細胞における遺伝子発現を研究する強力な手法です。深いシーケンス ベースの方法を補完するもの、smFISH は、トラン スクリプト豊富に細胞間変異と指定された RNA の細胞内分布についてを説明します。最近、我々 は出芽酵母の減数分裂期に遺伝子NDC80の発現を研究する smFISH を使用している、どの 2 つのトラン スクリプトにアイソ フォームが存在する、短い写しアイソ フォーム長いアイソ フォームと共有の全体シーケンス。自信を持って各トラン スクリプト アイソ フォームを識別するため、我々 は知られている smFISH プロトコルを最適化し、新進の中に取得したサンプルの smFISH データの高い一貫性と品質を得られる酵母の減数分裂です。ここでは、この最適化されたプロトコルは、かどうか smFISH データの高品質が得られると他の酵母菌株と成長条件でこのプロトコルを実装するためのいくつかのヒントを決定するために使用する基準について述べる。

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA 分子の数を数値化に最適です。

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

この最適化された単一分子 RNA in situ ハイブリダイゼーション(smFISH)の全体的な目標は、出芽酵母の栄養成長と減数分裂中に、個々の RNA 分子を細胞ごとに検出し、定量することです。この方法は、細胞内RNA局在における遺伝子発現の細胞間変動を明らかにするため、遺伝子調節を研究するための強力な技術です。smFISHによって明らかにされる独自の情報は別として、この技術の主な利点は、最適化されると堅牢で再現性が高いことです。減数分裂培養は、このプロトコルのデモンストレーションに使用されます。培養物を3%ホルムアルデヒドに固定するには、1840マイクロリットルの培養物を160マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドに2ミリリットルの微量遠心チューブで加えます。5回ほど反転させて混ぜます。チューブを室温のローラードラムに20分間置きます。20分後、一晩回転させながら摂氏4度で固定を続けます。翌日、最初に200ミリモルのバナジルリボヌクレオシド複合体(VRC)を摂氏65度で少なくとも10分間解凍して、消化の準備をします。消化マスターミックスを調製するには、まず2125マイクロリットルのバッファーBを15ミリリットルのチューブにピペットで移します。次に、温かいVRCを5秒間ボルテックスして完全に再懸濁し、200ミリリットルのVRCを15ミリリットルのチューブに追加します。ミックスは淡い茶色がかった緑色に見えるはずです。減数分裂サンプルを21, 000 x gで室温で1分半遠心分離します。上澄みを慎重に吸引し、ペレットの邪魔にならないように真空チップをペレットの反対側に置きます。ピペッティングで上下に動かして混合することにより、細胞を1.5ミリリットルの冷たい緩衝液Bに再懸濁します。21, 000 x gで1分半遠心分離します。真空吸引によって液体の大部分を取り除き、約100マイクロリットルを残します。細胞を1.5ミリリットルのコールドバッファーBに再懸濁しますサンプルを遠心分離し、液体を取り除き、細胞を1.5ミリリットルのコールドバッファーBに再度再懸濁します。21, 000 x gで1分半遠心分離します。ピペッティングで液体を完全に吸引します。細胞を425マイクロリットルの消化マスターミックスに再懸濁し、短時間ボルテックスします。5マイクロリットルのザイモリアーゼをチューブに加え、2〜3秒間ボルテックスして混合します。チューブをローラードラムに置き、摂氏30度で15〜30分間消化します。15分後、5分ごとに顕微鏡で細胞をチェックし、細胞の約80%が不透明で屈折していないように見えるときに消化を停止します。チューブを376 x gで3分間遠心分離します。上清を完全に取り除きます。1ミリリットルのバッファーBで細胞を静かに再懸濁し、ピペッティングで1〜2回上下させて混合します。チューブを遠心分離し、バッファーを取り外します。細胞を1ミリリットルの70%エタノールに穏やかに再懸濁し、室温で3時間半から4時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション手順を開始するには、細胞のチューブを376 x gで3分間遠心分離します。500マイクロリットルの70%エタノールをチューブから取り出します。ピペットで静かに上下に動かして、残りの細胞を再懸濁し、細胞を低接着チューブに移します。サンプルを低接着チューブに移すことは、その後のホルムアミド洗浄中の過剰な細胞損失を防ぐために重要です。低接着チューブを遠心分離し、すべてのエタノールを取り除きます。10%ホルムアミド洗浄バッファー1ミリリットルをチューブに加え、2〜3回ピペットで静かに上下させて細胞を再懸濁します。テキストプロトコールに記載されているように、ハイブリダイゼーション溶液を調製しながら、細胞を室温で約20分間硬化させます。サンプルを遠心分離し、上清を有害廃棄物に移します。各ハイブリダイゼーション溶液を少なくとも50マイクロリットルをチューブに加え、チューブをフリックして混合します。ローラードラムで摂氏30度で、暗闇の中で少なくとも16時間インキュベートします。ハイブリダイゼーションが完了したら、細胞のチューブをホイルで覆われた箱に入れて光から保護します。サンプルを376 x gで3分間遠心分離します。ピペッティングにより、上清を有害廃棄物に移します。サンプルを10%ホルムアミド洗浄バッファー1ミリリットルに再懸濁し、ピペッティングで2〜3回静かに行います。細胞のチューブをホイルで覆われた箱に戻し、光から保護するため、摂氏30度で30分間インキュベートします。30分後、サンプルを遠心分離します。ピペッティングで上清を有害廃棄物に移し、約50マイクロリットルを残します。サンプルを1ミリリットルのDAPI溶液に再懸濁するには、ピペッティングで2〜3回静かに行います。もう一度、細胞のチューブをホイルで覆われた箱に入れ、摂氏30度で30分間インキュベートします。サンプルを遠心分離し、ピペッティングで上清を完全に除去します。すぐにイメージングされないサンプルの場合は、酵素を含まない50マイクロリットルのGLOXバッファーにペレットを再懸濁します。ピペットで上下に3〜4回動かして混ぜます。画像化の準備ができるまで、ホイルで覆われた箱に摂氏4度で保管してください。すぐにイメージングするサンプルの場合は、酵素を含む15〜20マイクロリットルのGLOXバッファーを追加します。5マイクロリットルをカバースリップにピペットで移し、カバースリップをスライドに置きます。カバースリップが置かれているスライドの上にラボラトリーワイプを置きます。ワイプをそっと押してスライドをセットします。スライドをアルミホイルで覆われた箱に入れて、顕微鏡室に移します。このプロトコルは、2つのmRNAアイソフォームを発現するNDC80遺伝子の発現を調べるために使用されました。長い未解読転写産物アイソフォームは、短いアイソフォームと比較して、400塩基対の5プライムエクステンションを持っています。2セットのプローブが設計されました。CF 590 セットは長アイソフォームのユニークな 5 つのプライム領域に結合し、Q 670 セットは両方のアイソフォームの共通領域に結合します。最適化された条件下では、両方のプローブセットで明確なsmFISHスポットが明確に同定されました。2つのプローブセットは、栄養成長および減数分裂中のNDC80発現を研究するために使用されました。栄養細胞では、Q 670プローブセットからの強力なシグナルが検出されましたが、CF 590プローブセットからの強力なシグナルは検出されませんでした。対照的に、減数分裂前期では、両方のプローブセットからの堅牢なシグナルが検出され、スポットの大部分は共局在するシグナルを持っていました。ノーザンブロット分析により、長鎖アイソフォームは減数分裂で特異的に発現していることが確認されました。栄養細胞は、細胞あたり5つの短いアイソフォーム転写産物の中央値を持っていることがわかりましたが、減数分裂前期細胞では、中央値は細胞あたり4つの転写産物に大幅に減少しました。減数分裂前期では、細胞あたりの長鎖アイソフォーム転写産物の数の中央値は21であり、細胞の100%が転写産物を発現していました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば72時間で完了します。この手順を試行する際には、まず、最適なS/N比を達成するために必要なsmFISHプローブの消化時間と濃度を最適化することが重要です。さらに、ヌクレアーゼ活性を防ぐために、消化中および一晩のハイブリダイゼーション中にVRCを追加することを忘れないでください。この開発により、この技術は、研究者が動的な遺伝子制御と細胞内RNAの局在を探求する道を開きました。このビデオを見た後、出芽酵母減数分裂で単一分子RNA FISHを実行する方法をよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

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