単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

この最適化された単一分子 RNA in situ ハイブリダイゼーション(smFISH)の全体的な目標は、出芽酵母の栄養成長と減数分裂中に、個々の RNA 分子を細胞ごとに検出し、定量することです。この方法は、細胞内RNA局在における遺伝子発現の細胞間変動を明らかにするため、遺伝子調節を研究するための強力な技術です。smFISHによって明らかにされる独自の情報は別として、この技術の主な利点は、最適化されると堅牢で再現性が高いことです。

減数分裂培養は、このプロトコルのデモンストレーションに使用されます。培養物を3%ホルムアルデヒドに固定するには、1840マイクロリットルの培養物を160マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドに2ミリリットルの微量遠心チューブで加えます。5回ほど反転させて混ぜます。

チューブを室温のローラードラムに20分間置きます。20分後、一晩回転させながら摂氏4度で固定を続けます。翌日、最初に200ミリモルのバナジルリボヌクレオシド複合体(VRC)を摂氏65度で少なくとも10分間解凍して、消化の準備

消化マスターミックスを調製するには、まず2125マイクロリットルのバッファーBを15ミリリットルのチューブにピペットで移します。次に、温かいVRCを5秒間ボルテックスして完全に再懸濁し、200ミリリットルのVRCを15ミリリットルのチューブに追加します。ミックスは淡い茶色がかった緑色に見えるはずです。

減数分裂サンプルを21, 000 x gで室温で1分半遠心分離します。上澄みを慎重に吸引し、ペレットの邪魔にならないように真空チップをペレットの反対側に置きます。ピペッティングで上下に動かして混合することにより、細胞を1.5ミリリットルの冷たい緩衝液Bに再懸濁します。

21, 000 x gで1分半遠心分離します。真空吸引によって液体の大部分を取り除き、約100マイクロリットルを残します。細胞を1.5ミリリットルのコールドバッファーBに再懸濁しますサンプルを遠心分離し、液体を取り除き、細胞を1.5ミリリットルのコールドバッファーBに再度再懸濁します。

21, 000 x gで1分半遠心分離します。ピペッティングで液体を完全に吸引します。細胞を425マイクロリットルの消化マスターミックスに再懸濁し、短時間ボルテックスします。

5マイクロリットルのザイモリアーゼをチューブに加え、2〜3秒間ボルテックスして混合します。チューブをローラードラムに置き、摂氏30度で15〜30分間消化します。15分後、5分ごとに顕微鏡で細胞をチェックし、細胞の約80%が不透明で屈折していないように見えるときに消化を停止します。

チューブを376 x gで3分間遠心分離します。上清を完全に取り除きます。1ミリリットルのバッファーBで細胞を静かに再懸濁し、ピペッティングで1〜2回上下させて混合します。

チューブを遠心分離し、バッファーを取り外します。細胞を1ミリリットルの70%エタノールに穏やかに再懸濁し、室温で3時間半から4時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション手順を開始するには、細胞のチューブを376 x gで3分間遠心分離します。

500マイクロリットルの70%エタノールをチューブから取り出します。ピペットで静かに上下に動かして、残りの細胞を再懸濁し、細胞を低接着チューブに移します。サンプルを低接着チューブに移すことは、その後のホルムアミド洗浄中の過剰な細胞損失を防ぐために重要です。

低接着チューブを遠心分離し、すべてのエタノールを取り除きます。10%ホルムアミド洗浄バッファー1ミリリットルをチューブに加え、2〜3回ピペットで静かに上下させて細胞を再懸濁します。テキストプロトコールに記載されているように、ハイブリダイゼーション溶液を調製しながら、細胞を室温で約20分間硬化させます。

サンプルを遠心分離し、上清を有害廃棄物に移します。各ハイブリダイゼーション溶液を少なくとも50マイクロリットルをチューブに加え、チューブをフリックして混合します。ローラードラムで摂氏30度で、暗闇の中で少なくとも16時間インキュベー

ハイブリダイゼーションが完了したら、細胞のチューブをホイルで覆われた箱に入れて光から保護します。サンプルを376 x gで3分間遠心分離します。ピペッティングにより、上清を有害廃棄物に移します。

サンプルを10%ホルムアミド洗浄バッファー1ミリリットルに再懸濁し、ピペッティングで2〜3回静かに行います。細胞のチューブをホイルで覆われた箱に戻し、光から保護するため、摂氏30度で30分間インキュベートします。30分後、サンプルを遠心分離します。

ピペッティングで上清を有害廃棄物に移し、約50マイクロリットルを残します。サンプルを1ミリリットルのDAPI溶液に再懸濁するには、ピペッティングで2〜3回静かに行います。もう一度、細胞のチューブをホイルで覆われた箱に入れ、摂氏30度で30分間インキュベートします。

サンプルを遠心分離し、ピペッティングで上清を完全に除去します。すぐにイメージングされないサンプルの場合は、酵素を含まない50マイクロリットルのGLOXバッファーにペレットを再懸濁します。ピペットで上下に3〜4回動かして混ぜます。

画像化の準備ができるまで、ホイルで覆われた箱に摂氏4度で保管してください。すぐにイメージングするサンプルの場合は、酵素を含む15〜20マイクロリットルのGLOXバッファーを追加します。5マイクロリットルをカバースリップにピペットで移し、カバースリップをスライドに置きます。

カバースリップが置かれているスライドの上にラボラトリーワイプを置きます。ワイプをそっと押してスライドをセットします。スライドをアルミホイルで覆われた箱に入れて、顕微鏡室に移します。

このプロトコルは、2つのmRNAアイソフォームを発現するNDC80遺伝子の発現を調べるために使用されました。長い未解読転写産物アイソフォームは、短いアイソフォームと比較して、400塩基対の5プライムエクステンションを持っています。2セットのプローブが設計されました。

CF 590 セットは長アイソフォームのユニークな 5 つのプライム領域に結合し、Q 670 セットは両方のアイソフォームの共通領域に結合します。最適化された条件下では、両方のプローブセットで明確なsmFISHスポットが明確に同定されました。2つのプローブセットは、栄養成長および減数分裂中のNDC80発現を研究するために使用されました。

栄養細胞では、Q 670プローブセットからの強力なシグナルが検出されましたが、CF 590プローブセットからの強力なシグナルは検出されませんでした。対照的に、減数分裂前期では、両方のプローブセットからの堅牢なシグナルが検出され、スポットの大部分は共局在するシグナルを持っていました。ノーザンブロット分析により、長鎖アイソフォームは減数分裂で特異的に発現していることが確認されました。

栄養細胞は、細胞あたり5つの短いアイソフォーム転写産物の中央値を持っていることがわかりましたが、減数分裂前期細胞では、中央値は細胞あたり4つの転写産物に大幅に減少しました。減数分裂前期では、細胞あたりの長鎖アイソフォーム転写産物の数の中央値は21であり、細胞の100%が転写産物を発現していました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば72時間で完了します。

この手順を試行する際には、まず、最適なS/N比を達成するために必要なsmFISHプローブの消化時間と濃度を最適化することが重要です。さらに、ヌクレアーゼ活性を防ぐために、消化中および一晩のハイブリダイゼーション中にVRCを追加することを忘れないでください。この開発により、この技術は、研究者が動的な遺伝子制御と細胞内RNAの局在を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、出芽酵母減数分裂で単一分子RNA FISHを実行する方法をよく理解しているはずです。