覚醒マウス ガラス Optrode を持つ神経型のオプトジェネティクス同定
2018年6月28日
この作品は、特注ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから確実に記録光単一ユニットを実行するメソッドを紹介します。
この方法は、さまざまな種類のニューロンの機能など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、安価で入手しやすい材料を使用して、in vivoでさまざまな種類のニューロンを確実に識別できることです。私は、当研究室の技術者である村本真司さんと研究室の馬蘭蘭助教と一緒に手順を実演します。
この手順を開始するには、圧力制御用の鋼管をホルダーのバレルからそっと引き出します。ホルダーの砲身にあるピン座側の穴を穴あけ加工で広げます。次に、穴にステンレス鋼管を置きます。
次に、直径2.5mmのフェルール用のセラミックスプリット嵌合スリーブを穴に挿入します。L字型のウサギに穴を開け、電極ホルダーのバレルをエポキシ接着剤でウサギに取り付けます。その後、ネジでマニピュレーターに取り付けます。
円柱状の基板スペーサーをフライスで直方体状に加工して特注のヘッドポストを用意し、ソーで2本のヘッドポストにカットします。次に、フライスでヘッドポストの底を平らにします。手術の前に、すべての手術器具とヘッドポストをオートクレーブで滅菌します。
脳定位固定装置フレームと加熱パッドを70パーセントのアルコールで清掃します。次に、マウスに麻酔をかけ、加熱パッドの定位固定フレームに置きます。この実験では、チャネルロドプシン-IIを発現する抑制性ニューロンを用いたトランスジェニックマウスを用いた。
バイトバーの穴に歯を置き、ノーズクランプを軽く締めます。その後、イヤーバーを使用して頭の両側を固定します。ヘッドがイヤーバーで正しく固定されたら、ノーズクランプを締めます。
眼科用軟膏を目に塗ります。小さなハサミで頭の上の髪を切り取り、グルコン酸クロルヘキシジンの綿棒で頭皮をきれいにします。次に、頭皮を正中線に沿って切り、脇に押します。
70%のアルコールに浸した綿棒で骨膜を取り出し、頭蓋骨を乾かします。次に、ヘッドポストをマニピュレーターに取り付けます。マニピュレーターを使用して、ヘッドポストをブレグマの周りの頭蓋骨に平らに配置します。
モノマー4滴、触媒1滴、ポリマーの小さなスプーン1杯を、冷蔵庫で冷やした小さな皿に混ぜます。前頭骨と頭頂骨に歯科用セメントを塗布し、ヘッドポストを頭蓋骨に固定します。歯科用セメントが固まったら、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外します。
露出した皮膚に抗生物質軟膏を塗布し、メデトミジン拮抗薬と抗生物質のカクテルを注射します。次に、マウスをケージ内のヒートパッドに置き、マウスが目覚めるまでケージに入れ、エンリッチメントのあるハウジングケージに戻します。記録のためにターゲットの脳領域に対して開頭術を行うには、グルコン酸クロルヘキシジンと70%アルコールを浸した綿棒で頭蓋骨を清掃します。
デンタルドリルで記録部位の頭蓋骨を慎重にこすります。骨が十分に細くなったら、メスの先で切って取り除きます。次に、頭蓋骨を強化するために、露出した領域の周りに歯科用セメントを塗布します。
歯科用セメントが固まった後、露出した脳領域をシリコーン接着剤で覆います。次に、動物をケージ内のヒートパッドに置き、目を覚ますまでケージに戻します。開頭術後少なくとも1日間は動物を回復させてから、電気生理学的記録を行います。
電気生理学的記録を行う前に、電極プーラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーからガラスピペットをいくつか作成します。ピペットに10ミリモルPBSを入れます。一部の記録では、2%のニューロビオチンが10ミリモルPBSに添加されています。
次に、動物を記録室に入れます。カスタムメイドのオプトロードホルダーに充填されたガラスピペットを取り付けます。塩化銀でコーティングされたワイヤーをガラスピペットに挿入します。
その後、ピンをヘッドに接続しますtage レコーディング amplifier。次に、ジルコニアフェルール付きの光ファイバーパッチコードをオプトロードホルダーの分割嵌合スリーブに接続します。フェルールの先端がガラスピペットの背面に接触するまで、パッチコードをスリーブに押し込みます。
パッチコードはLEDからの光を供給し、LEDはシングルチャネルLEDドライバーによって制御されます。その後、開頭術の上のシリコーン接着剤を取り除きます。記録セッション中に脳表面が乾燥するのを防ぐために、定期的に脳表面に温かい生理食塩水を適用します。
必要に応じて、鋭利なピンセットで硬膜を取り外してください。ここでは、スパイク応答を覚醒状態のVGATチャネルrhodopsin-IIマウスの下丘で記録しました。VGATチャネルロドプシン-IIマウスの下丘では、GABA作動性ニューロンはチャネルロドプシン-IIを特異的に発現します。
覚醒しているマウスでは、GABA作動性ニューロンとグルタミン酸作動性ニューロンの両方が、光刺激を与えられるとそれぞれ興奮または抑制されました。光刺激がガラス電極を介して送達されると、一部のニューロンでスパイク応答が誘発されました。対照的に、他のニューロンでは、光刺激が音刺激によって引き起こされるスパイク反応を抑制しました。
これらの結果は、ガラスオプトロードが十分に分離された単一ユニットの活性を記録し、記録されたニューロンを光によって確実に刺激できることを示しています。開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が、さまざまな種類のニューロンがさまざまな脳領域の神経ソケットでどのように機能するかを探求する道を開きました。
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概要
本研究では、カスタムガラスオプトロードを用いた、覚醒マウスにおける光遺伝学的シングルユニット記録法を提示します。本手法は、費用対効果の高い材料を用いて、生体内での信頼性の高い同定と操作を可能にすることで、さまざまなニューロン型の機能に関する知見を提供することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 光遺伝学
背景
- この手法は、特にGABA作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンを中心とした、ニューロンの機能の理解に重点を置いています。
- 抑制性ニューロンにチャネルロドプシン-IIを発現させるため、トランスジェニックマウスモデルを利用しています。
- 従来の手法では、生体内（in vivo）でのニューロン型の同定における信頼性が不足していました。
- 本手法では、費用対効果が高く、入手しやすい材料が使用されています。
研究目的
- 覚醒したマウスにおける信頼性の高い単一ニューロン記録手法を開発すること。
- 記録された活動 during における異なるニューロン型の機能的役割を調査すること。
- 様々な脳領域における神経ダイナミクスを研究するための利用可能なツールを向上させること。
使用された手法
- 主要な手法には、特製ガラスオプトロードの使用および標的脳領域への開頭術が含まれます。
- 生物学的モデルには、VGAT channelrhodopsin-II トランスジェニックマウスを用います。
- 電気生理学的記録とオプトジェネティクス刺激が、本プロセスの極めて重要なステップとなります。
- 手順には、入念な術前準備、麻酔管理、およびオプトロードの精密な刺入技術が含まれます。
- 術後の滅菌処理および回復プロトコルに細心の注意を払います。
主な結果
- この手法により、下丘の特定のニューロンタイプから、十分に分離された単一ユニット活動の記録が可能になりました。
- 光刺激により多様な反応が認められ、GABA作動性ニューロンは興奮し、グルタミン酸作動性ニューロンは抑制されました。
- これらの知見は、神経回路およびニューロンタイプ特異的な反応を解析する上での本手法の有効性を示唆しています。
- 極めて重要な点として、これにより、覚醒し行動しているマウスにおけるニューロンダイナミクスの詳細な調査が可能になります。
結論
- 本研究では、神経科学の研究能力を向上させる、信頼性の高い光遺伝学的記録手法を確立しました。
- この技術は、異なるニューロン間の相互作用および機能的役割の理解に大きく寄与します。
- 総じて、本手法は、さまざまな脳領域におけるニューロンのメカニズムと相互作用をより深く探索するための道を切り拓くものです。
よくある質問
業界における重要性
本手法により、覚醒したマウスにおける神経細胞型の信頼性の高いin vivo同定が可能となり、ターゲット検証およびメカニズムのリスク低減という神経科学における重要な課題を解決します。光遺伝学的刺激とガラス製オプトロードを用いた電気生理学的記録を組み合わせることで、脳深部領域における神経機能の仮説検証を支援します。このアプローチは入手しやすい材料を使用しており、神経回路解析に焦点を当てた初期探索ワークフローのための拡張可能なツールを提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬とターゲット検証
- 科学的価値： 特定の神経細胞集団における光刺激とスパイク応答を関連付けることで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 費用対効果が高く入手しやすいコンポーネントを用いて、in vivoで神経細胞型を単離するための再現性のあるシステムを提供する。
- 戦略的価値： 疾患に関連する脳領域における神経細胞の同一性と機能を検証することで、ターゲットへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：制御された光刺激下でのニューロンの興奮性または抑制を評価することを可能にする、定量的な電気生理学的リードアウトを生成します。
- 運用の価値：アッセイの最適化および再現に適した、標準化された単一ユニット活動の独立測定を提供します。
- 戦略的価値：薬理学的または遺伝的な摂動に対するニューロンの反応を評価するための信頼性の高いプラットフォームを構築することで、スクリーニングへの移行を容易にします。
翻訳および前臨床研究
- 科学的価値：覚醒し行動している動物において細胞種特異的な操作を可能にすることで、疾患に関連するシステムモデリングを支援します。
- 運用の価値：一貫したニューロンの同定と刺激を通じて、発見から前臨床検証までの連続性を確保します。
- 戦略的価値：ターゲット検証におけるニューロンメカニズムの帰属に関する曖昧さを低減し、予測の信頼性を高めます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、特に細胞型特異的な解析を必要とする回路において、リード化合物の同定前に神経標的を検証するメカニズムを提供することで、初期の創薬ワークフローに組み込まれます。
- 発見生物学：in vivoで精密なニューロン刺激と記録を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：定量的で再現性のある電気生理学的出力を提供し、異なる条件下でのニューロン応答の比較を可能にします。
- 分析：スパイク応答の測定値および光誘発活性の変化を提供し、ニューロン機能の統計分析に寄与します。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒト疾患に関連する覚醒・行動モデルにおいてニューロン標的の検証を可能にし、前臨床段階への継続性を繋ぎます。
- エンタープライズ再利用：複数の脳領域および実験パラダイムにわたるニューロン特性評価のための、再利用可能なプラットフォームとなります。
運用および企業への影響
- 科学的価値：光誘発による直接的な機能的読み出しを通じて、神経標的バリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用の価値：カスタマイズ可能でアクセスしやすいオプトロード（optrode）システムにより、標準化と再現性を向上させる。
- 戦略的価値：神経機能におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、Go/No-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの神経細胞の同一性と応答プロファイルに基づき、リスク調整後の標的優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 定位固定手術、電気生理学、および光遺伝学的刺激の専門知識が必要です。
- 電極プラー、マニピュレーター、LEDドライバー、および光ファイバーコンポーネントへのアクセスに依存します。
- ユーザー間での手術準備、ヘッドポスト固定、および開頭処置の標準化が必要です。
- 下丘以外の異なる脳領域や神経細胞型への適応に関する検討が含まれます。
- 覚醒動物での安定した記録を確保するため、適切な術後回復と馴化が必要です。
