Name: ひと初代細胞における細胞老化の誘導性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶ 初代線維芽細胞を用いた細胞老化の誘導法と評価手法。ドキソルビシン処理により50%以上の細胞で老化を誘導し、βガラクトシダーゼ染色やEdU取り込み試験で解析できます。高い再現性を持つ標準的な培養技術です。

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実りある議論のため管理者にラボと Thijmen ヴァン Vliet と紫外線による老化のプロトコルのデータを共有するためのメンバーに感謝いたします。

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RB+and+p53+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li>
<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

ここで説明したプロトコル最適化した一次線維芽細胞、特に BJ と WI-38 細胞。複製老化、電離放射線、ドキソルビシンのためのプロトコルは (HCA2 および IMR90) 線維芽細胞と他の細胞型 (すなわち新生児メラノサイトとケラチノ サイトまたは iPSC 由来心筋細胞) の他のタイプに正常に適用されています。本研究室では。ただし、その他の細胞のタイプのための適応は、シード細胞、メソッドおよびプラスチック サポートにアタッチ/デタッチの細胞を助ける化学物質の番号や毒性を避けるために治療の投与量などいくつかの詳細を調整することによって最適化できます。
主線維芽細胞の使用もポーズの課題の数です。老化細胞が通常増殖より、デタッチするのには難しく、trypsinization をより敏感またはデタッチ メソッド、デタッチ後生存率のものよりわずかに低いことを意味の他のタイプが多い増殖細胞。さまざまな老化誘導方法に適切なコントロールの選択は困難です。例えば、ドキソルビシンなど薬物による治療、車両と短い治療お勧め: ドキソルビシン処理細胞の対照サンプルの場合 24 時間 PBS に続いてす...

1961 年、ヘイフリック、ムーアヘッドは、文化の主要な線維芽細胞が連続通路1の後の増殖の可能性を失うことを報告します。このプロセスは、各細胞分裂後シーケンシャル テロメア短縮が原因です。テロメア批判的に短い長さに達する、増殖の不可逆的な停止を活性化する DNA 損傷応答 (DDR) によって認識されます-複製老化としても定義されています。複製老化細胞のマイトジェンとアポトーシス シグナル2,3の両方に依存しないレンダリングする永久的な細胞周期の停止の状態を誘導するために知られている多くの刺激の 1 つされて。老化プログラムは通常高リソソーム活動、ミトコンドリア、核変化、クロマチン再編成、小胞体ストレス、DNA の損傷と老化関連を含む追加の機能によって特徴付けられる分泌型表現型 (SASP)3,4。老化細胞体に複数の機能がある: 開発、創傷治癒およびがん抑制2。同様に、彼らは高齢化と、逆説的に、腫瘍の進行5で重要な役割を再生する知られています。老化の負の値、および部分的に矛盾した効果は、SASP6頻繁に原因です。
最近では、マウスから老化細胞の除去が寿命延長し老化機能7,8,9,10、11,の多くの除去につながることを示した12します。 同じ方法で複数の薬を老化細胞 (senolytics) を排除するか、または SASP13,14を対象に開発されています。アンチエイジング治療の可能性は、フィールドに多くの注目を集めている最近。
細胞の老化に関連したメカニズムの研究と薬理学的介入の上映前のヴィヴォモデルでは、特に主線維芽細胞上に依存します。老化の表現型の変化は観察と細胞の種類、刺激および時間ポイント3,15を含む様々 な要因に依存して多様な老化誘導因子によって活性化されるいくつかの一般的な機能がありますが、 16,17。勉強し、老化細胞をターゲットの不均一性を考慮することが不可欠です。したがって、このプロトコルは一連のさまざまな治療法を使用して、主に線維芽細胞老化を誘導するために使用されるメソッドを提供するために目指しています。それで説明しますが、メソッドは他の細胞型に適応できます。
別に複製老化老化を誘発する他の 5 つの治療について述べる: 電離放射線、紫外線 (UV)、ドキソルビシン、酸化ストレスおよびエピジェネティックな変化 (すなわち DNA 脱メチル化やヒストンのアセチル化の推進).電離放射線と紫外線の両方、直接 DNA 損傷を引き起こすし、適切な用量でトリガー老化18,19。ドキソルビシンまた間を DNA にインターカ レートによって DNA の損傷によって主に老化を引き起こすし、トポイソメラーゼ II の機能を中断、中止 DNA 修復機構20。老化に不可欠な遺伝子の発現は、DNA メチル化とヒストンのアセチル化によって制御されます通常。結果として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤 (例えば、酪酸ナトリウム、サハ) と DNA demethylating (例えば5 字) エージェントは、正常細胞21,22老化をトリガーします。
最後に、4 つの老化細胞に関連付けられている最も一般的なマーカーの説明される: 老化関連-β-ガラクトシダーゼ (SA β gal) EdU 取り込みアッセイ、細胞周期調節因子の過剰発現による DNA 合成率の活動とサイクリン依存性キナーゼ阻害剤 p16 と p21 と、SASP のメンバーの分泌の過剰発現

<table><tbody><tr><td>DMEM Media - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S; 10,000 U/ml)</td><td>ロンザ</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水 (DEPC処理なし)</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;15 mL遠心分離管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>13mm丸型カバースリップ</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Cesium137-source</td><td></td><td></td><td>IBL 637 Cesium-137&gamma;-ray machine</td></tr><tr><td>UV放射室</td><td></td><td></td><td>Opsytec, Dr. G&ouml;bel BS-02</td></tr><tr><td>ドキソルビシン二塩酸塩&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr>過<tr><td>酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-デオキシシチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-D-ガラクトピラノシド)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>フェロシアン化カリウム&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>フェリシアン化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルクミリポア</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャーケミカルズ</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% グルタルアルデヒド</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド (w/v)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-エチニル-2'-デオキシウリジン)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>スルホ-シアニン3アジド (スルホ-Cy3-アジド)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II) 五水和物 (Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros organics 215682500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>ライトサイクラー 480 シーリング フォイル&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>センシファストプローブ Lo-ROXキット&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL プローブライブラリ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R&D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting スライド</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>ドライインキュベーター</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' laboratory film</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#PM992 ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

細胞の老化は、さまざまな有害な刺激への応答でアクティブに永久的な細胞周期の停止の状態です。細胞の老化の活性化は、腫瘍の抑制、組織改造と高齢化を含むさまざまな病態生理学的条件の特徴です。生体内で細胞老化の誘導はまだよく特徴付けられます。ただし、 ex vivo細胞老化を促進する刺激の数を使用できます。その中で、最も一般的な老化誘導が複製枯渇、電離放射線し非電離放射線、遺伝毒性薬、酸化ストレスと demethylating とエージェントをアセチル化します。ここでは、これらの刺激を使用して老化に線維芽細胞を誘導する方法で詳細な指示いたします。このプロトコルは、簡単に、初代培養細胞やがん細胞を含む細胞の種類ごとに適応できます。老化誘導の検証するための異なる方法についても述べる。特に、我々 はライソゾーム酵素老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β gal) 細胞周期の表現のレベル 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) 取り込みアッセイを用いた DNA 合成率の活性の測定に焦点を当てるp16 の阻害剤と p21 と表情やメンバーの Senescence-Associated 分泌形質 (SASP) の分泌。最後に、私達は例の結果を提供し、これらのプロトコルのアプリケーションをさらに議論。

SA β gal 染色老化線維芽細胞の濃縮
Β-ガラクトシダーゼ (β gal) すべての細胞で発現していること、最適な pH 4.025,26のライソゾーム酵素であります。ただし、老化、中にリソソームのサイズが大きく、その結果、老化細胞蓄積 β gal。この酵素の増加量は、最適 pH 6.025,27もその活性を検出することが可能。図 1 aは、老化の主な線維芽細胞と増殖の SA β gal 染色の代表的なイメージを示しています。セルには、拡大と不規則な細胞体も見てください。前述のように、こと個々 の細胞を区別するは難しい、共同 DAPI 染色容易に可視化と細胞 (...

ここでは、一連の誘発のためのプロトコルおよび培養細胞の細胞老化の検証について述べる。私たちはさまざまな老化を誘発する刺激に焦点を当てるし、一般的な老化関連マーカーの定量化を記述します。私たちはモデルとして線維芽細胞を使用して技術的な詳細を提供するが、プロトコルは、さまざまな携帯電話モデルに合わせることができます。

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

この方法は、細胞老化を誘導するための一般的な手法の実行方法や老化表現型の評価方法など、老化およびがん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、追跡が容易で、再現性が高く、特別または高価な機器を必要とせず、細胞集団の少なくとも50%で老化が誘発されることです。この手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるAlejandra Hernandez-Seguraです。まず、10ミリリットルのD10を含むT75フラスコに、Population DoublingまたはPDが低い5番目の生存可能な一次線維芽細胞に10倍7回播種します。細胞培養インキュベーターで、5%の二酸化炭素と5%の酸素を入れて摂氏37度の細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。1, 000Xドキソルビシン原液の11マイクロリットルを11ミリリットルのD10に希釈し、最終濃度を250ナノモルにします。次に、細胞から培地を吸引し、10ミリリットルのD10とドキソルビシンと交換します。細胞培養インキュベーターで、摂氏37度の細胞培養インキュベーターで、5%の二酸化炭素と5%の酸素で正確に24時間インキュベートします。次に、培地を吸引し、10ミリリットルのD10を使用して細胞を一度慎重に洗浄します。細胞を10ミリリットルのD10でさらに6日間インキュベートし、培地を約3日ごとに定期的に交換します。β-ガラクトシダーゼ染色を行うには、各サンプルシードについて、500マイクロリットルのD10を含有する24ウェルプレートの少なくとも1つのウェルに10〜4番目の細胞を1回ずつ入れ、細胞がまばらになるようにする。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と5%の酸素で一晩インキュベートします。翌日、500マイクロリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、PBSに2%ホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドをウェルあたり500マイクロリットル加え、室温で3〜5分間細胞をインキュベートして固定します。次に、500マイクロリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、新しい染色液を調製した後、ウェルあたり500マイクロリットルを追加し、パラフィルムを使用してプレートをシールし、結晶の形成を引き起こす可能性のある蒸発を防ぎます。暗所で37°Cの乾燥インキュベーターで、二酸化炭素を含まない乾燥インキュベーターで12〜16時間細胞をインキュベートします。次に、500マイクロリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。通常の光学顕微鏡で細胞をチェックし、青色のパラ核染色で陽性細胞が現れる結果を評価します。個々の細胞の可視化と定量化を容易にするために、DAPIを対比染色として使用します。次に、蛍光顕微鏡を使用して、陽性細胞と細胞の総数の割合を決定し、同じサンプルの複数の写真を撮影して、少なくとも100個の単一細胞を評価します。サンプルまたは条件ごとに、ウェルごとに1枚のカバースリップを24ウェルプレートに入れます。ウェルあたり500マイクロリットルのD10を4番目の細胞に1回10回播種して、細胞がまばらになるようにします。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と5%の酸素で一晩インキュベートします。各サンプルが250マイクロリットルを受け取るように、20マイクロモルのEdU溶液とD10を十分に調製します。処理する各ウェルから培地の半分を取り出し、EdU D10溶液と交換します。最終的なEdU濃度は10マイクロモルです。サンプルを摂氏37度で5%の二酸化炭素と5%の酸素で18〜24時間インキュベートします。コントロール細胞と老化細胞に同じインキュベーション時間を使用します。インキュベーション後、500マイクロリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、PBSに500マイクロリットルの4%ホルムアルデヒドを加え、細胞を10分間インキュベートして固定します。固定後、500マイクロリットルの100ミリモルTris pH 7.6をサンプルに加え、5分間インキュベートします。次に、PBS中の0.1%Triton X-100を500マイクロリットル加え、細胞に10分間浸透させます。次に、PBSを使用してサンプルを3回洗浄します。カバーガラスごとに50マイクロリットルのラベルミックスを準備し、次の順序でコンポーネント、44.45マイクロリットルのPBS、0.5マイクロリットルの硫酸銅(II)、0.05マイクロリットルのスルホ-cy3-アジド、および5マイクロリットルのアスコルビン酸ナトリウムを追加します。パラフィルムに50マイクロリットルのラベルをピペットで混ぜます。次に、ピンセットと針を使用して、カバーガラスを持ち上げ、ラベルミックスの上にセル側を下にして置きます。気泡がないこと、およびカバースリップの表面全体がラベルミックスに触れていることを確認してください。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。細胞を24ウェルプレートのウェルに戻し、PBSを使用して3回洗浄します。次に、DAPIを使用した封入剤を使用してサンプルを封入し、一晩乾燥させます。まず、7回10を5番目の生存可能な一次線維芽細胞に播種し、人口倍増が少ないか。条件ごとに少なくとも100個の細胞を画像化します。最後に、次の式を使用して、EdUを組み込んだセルの割合を定量化します。テキストプロトコルに従って遺伝子およびタンパク質発現研究を実施します。ここに示されているのは、増殖性および老化性一次線維芽細胞におけるSA-β-gal染色の代表的な画像です。老化細胞は、通常の細胞体内で拡大して見えます。前述のように、個々の細胞を区別するのは難しい場合があります。したがって、DAPIとの共染色は、視覚化と細胞カウントを容易にします。この実験では、スフロ-cy3-アジドを使用して、銅触媒アジド-アルキン環化付加を集団に行いました。アジドとアルキンの結合が起こった場合、細胞はcy3フィルターの下で蛍光を示し、増殖する細胞と増殖しない細胞を区別する。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば36時間で完了します。この手順を試みる際は、酸素濃度の振動が結果に影響を与える可能性があるため、インキュベーターの外で細胞を取り扱う際には、できるだけ迅速に扱うことを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、サイトカインアレイやウェスタンブロットなどの他の方法を実行して、分泌されるタンパク質のレベルや特定のシグナル伝達経路の理解などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、老化および癌分野の研究者が老化細胞が哺乳類の生理学的および病理学的状態にどのように関与しているかを探求する道を開きました。このビデオを見れば、初代細胞で老化を再現性よく誘導する方法と、その老化状態を評価する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。...

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細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。...

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テルトブチル過酸化物を用いた一次ヒトメラノサイトにおけるストレス誘発性早期老化を誘導する標準化されたプロトコル

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ヒト線維芽細胞における細胞老化の定量的評価のためのLysoTrackerを用いたリソソームプロファイリング

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老化細胞の調整培地を用いたin vitro モデルにおける健康な細胞間コミュニケーション回復のための抗酸化剤の新規結合

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