Name: ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶビオチンベースプルダウン法で細胞内miRNAのmRNA標的を検証する方法。LNA修飾ミミックとストレプトアビジン磁気ビーズを用いて高特異性で標的mRNAを捕獲し、qPCRで定量します。miRNA生物学と治療薬開発への応用が期待されます。

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この仕事は部分的 (装置) に国立衛生研究所 (NIH) の助成金 DA037779 によって支えられた DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960、MD007586 (C.D.) に。仕事も RCMI グラント G12MD007586、ヴァンダービルト CTSA グラント UL1RR024975 によって支えられた Meharry 臨床研究センター (MeTRC) CTSA 付与 (U54 RR026140 傘下/NIH、NIMHD/NIH から U54 グラント MD007593 およびテネシー州エイズ センターから研究 (P30 AI110527)。

1. 3'-ビオチン化マイクロ Rna のトランスフェクション
注: 滅菌層流フードの内部次の手順に従います。
<ol><li>シード 4 x 105–5 × 105 HEK 293 t 細胞あたり 2 mL でよくダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) [DMEM 10% ウシ胎児血清 (FBS) とペン連鎖球菌性抗生物質 x 1] を完了します。37 ° C、5% CO2一晩で設定インキュベーターで培養します。</li>
	<li>次の日は、健康と光学顕微鏡の下でめっきされたセルの付着を確認します。 注: 細胞が付着し、次のステップに進む前に適切な形態を達成したことを確認します。HEK 293 t 細胞は通常 18-24 h の transfection のため準備ができているポストめっき。</li>
	<li>1.7 mL の滅菌および microfuge の管で最小限の必須メディアを 200 μ l 添加のビオチン標識 miRNA の 75 picomoles を希釈します。このミックスを別 1.7 mL および microfuge 管含むリポソーム ベースのトランスフェクション試薬 (8 μ L/ウェル) 最小限の重要なメディアの 200 μ L で希釈に転送します。ミックスを徹底的にでもやさしく、ピペッティングとトランスフェクション複合体の形成を許可する室温で 20-25 分間インキュベートします。</li>
	<li>穏やかなピペッティングして 6 よく培養プレートから古いメディアを削除し、作りたての完全な DMEM (ペン連鎖球菌性抗生物質 x 1) なしの 1.6 mL の各ウェルを補充します。</li>
	<li>(1.3) から drop-wise よく校正ピペットを使用して 6 ウェル プレートで細胞にトランスフェクション錯体を追加します。板全体の均一な分布を確実に錯体を追加しながら優しくプレートを旋回します。 注: この手順は、高効率遺伝子導入を実現するため非常に重要ですし、注意と忍耐で実行する必要があります。</li>
	<li>少なくとも 36 h の 37 ° C および 5% の CO2の細胞を培養します。</li>
</ol>2. 準備ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズ-私
<ol><li>ボルテックスによって、ストレプトアビジンの磁気ビーズを徹底的に再懸濁します。(サンプルごと) ビーズ懸濁液 30 μ L を 2 mL ヌクレアーゼ フリーおよび microfuge の管に転送します。</li>
	<li>2 分の磁気ビーズ区切りスタンド (「マグネット」以下) にビーズ懸濁液を含んでいる管を配置します。ビーズがマグネットに接触してチューブの側面に描かれていることを確認した後、マイクロ ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。</li>
	<li>ビーズにビーズ洗浄バッファー (10 mM Tris Cl pH 7.5、0.5 ミリメートルの EDTA、1 M 塩化ナトリウム) の 100 μ L を追加します。磁石からチューブを削除します。15 の渦、ビーズを洗浄する室温で s。</li>
	<li>2 分のための磁石にビーズを含むチューブを置き、慎重に削除、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>3 つの洗浄の合計は 2.3 と 2.4 の手順を繰り返します。最終的な洗浄ステップの後に、磁石からチューブを削除します。</li>
	<li>ビーズにソリューション (0.1 M NaOH、0.05 M 塩化ナトリウム) を解放 RNase の 100 μ L を追加、15 のボルテックスでよく混ぜる、s と 5 分場所 2 分のための磁石にビーズを含む管、室温でインキュベートし、慎重に削除、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>3 回の合計 2.6 手順を繰り返します。</li>
	<li>ビーズ、渦 15 s にビーズ巻き上がりソリューション (0.5 M NaCl) を追加し、5 分は 2 分のための磁石に再懸濁のビーズを置き、上澄みを慎重に削除のために、室温でインキュベートします。</li>
	<li>ビーズにブロッキング液 (1 μ g/2 μ g/μ L 酵母 tRNA μ L BSA) ビーズの 200 μ L を追加します。ミックス 15 の穏やかなボルテックスによって室温で s。16 h (オーバー ナイト) 多管回転子の 4 ° C で孵化させなさい。</li>
</ol>3. セル Lysates の準備
<ol><li>層流フードの内部の無菌細胞スクレーパーを使用して穏やかスクレーピングによって transfected HEK 293 t 細胞を採取し、滅菌 2 mL および microfuge の管に各サンプルを転送します。</li>
	<li>1,500 × gで遠心分離によって掻き細胞のペレットの 5 分は、滅菌 PBS (リン酸バッファー生理食塩水)、pH 7.2 × 1 でペレットを再懸濁します。ペレット残留メディアの自由を取得する 5 分間 1,500 × gで遠心するもう一度。すぐに突入する氷に餌を含んでいる管。</li>
	<li>新鮮な完全なセル換散バッファーを準備 (150 mM NaCl、25 ミリメートル pH 7.5、トリス-の Cl 5 mM DTT、0.5 %igepal、60 U/mL Superase プロテアーゼ阻害剤 1)。 注: IGEPAL、Superase、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルに欠けているセル換散バッファーの在庫が事前に準備して、常温保存します。在庫のセル換散バッファーに推奨される最終的な濃度で上記の補足を追加して氷の上に格納することによって完全なセル換散バッファーの新鮮なバッチを準備します。</li>
	<li>および microfuge の管 (すなわち、各および microfuge の管には 6 ウェル プレートの 1 つの井戸から採取した細胞が含まれています) では各サンプルに冷たい完全セル換散バッファーの 260 μ l 添加し均一な懸濁液にピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>凍結融解法を用いた細胞の溶解:-80 ° C で 10-15 分でチューブを孵化させなさい。氷の上解凍する細胞、許可します。</li>
	<li>4 ° C で設定冷蔵ベンチトップ遠心分離機で 5 分間 16,000 x gにて、結果細胞を遠心分離します。</li>
	<li>氷の上、滅菌 1.7 mL および microfuge の管にクリア細胞ライセートを転送します。ペレットを破棄します。 注: の最終巻クリア ライセートはず 〜 240-250 μ L。</li>
	<li>ライセートをクリアの 5 M NaCl を加える最終濃度 1 M と氷のサンプルを維持します。</li>
</ol>4. ストレプトアビジン磁性ビーズの作製-II
<ol><li>新鮮な完全なプルダウン洗浄バッファー (10 mM KCl 1.5 mM MgCl210 mM Tris Cl pH 7.5、5 mM DTT、1 M 塩化ナトリウム、0.5 %igepal、60U/mL、Superase、1 x プロテアーゼ阻害剤カクテル) を準備します。 注: IGEPAL、Superase、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルを欠けているプルダウン洗浄バッファーの在庫が事前に準備して、常温保存します。在庫のセル換散バッファーに推奨される最終的な濃度で上記の補足を追加して氷の上に格納することによって完全なセル換散バッファーの新鮮なバッチを準備します。</li>
	<li>2 分のための磁石の (ステップ 2.9) から準備されたビーズは慎重に削除し、上澄みを廃棄を含む管を配置します。</li>
	<li>ビーズに冷たい完全なプルダウン洗浄バッファーの 150 μ L を追加します。15 の渦 s し, 室温で 30-60 s. 場所 2 分のための磁石の管は慎重に削除し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>3 回の合計 4.3 手順を繰り返します。</li>
	<li>完全なプルダウン洗浄バッファーの 300 μ L でビーズを再懸濁します。</li>
</ol>5. ターゲット mRNA-マイクロ Rna 複合体のプルダウン
<ol><li>(ステップ 3.8) から細胞ライセートの 300 μ L を転送 (ステップ 4.5) からビーズの 300 μ L を含むおよび microfuge の管に。</li>
	<li>室温で 1 時間ならびにミキサーでの混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>5 分のための磁石の管は慎重に削除、上澄みを廃棄場所。</li>
	<li>ビーズに冷たい完全なプルダウン洗浄バッファーの 300 μ L を追加します。15、渦部屋の温度と場所 5 分のための磁石の管は慎重に削除し、上澄みを廃棄で s。</li>
	<li>ステップ 5.4 をさらに 2 回繰り返します。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L のビードを再停止しなさい、氷の上を孵化させなさい。</li>
</ol>6. 総 RNA の抽出、cDNA の統合、qPCR
<ol><li>(ステップ 5.6) から再懸濁のビーズからの総 RNA の抽出、適切なメソッドを使用して (材料の表を参照してください)。ヌクレアーゼ フリー水を 25 μ l 添加で抽出されたトータル RNA を再懸濁します。RNA 濃度と品質 (260/280 吸光度) 分光光度計を使用して決定します。50 ng/μ L の RNA の作業在庫を準備します。</li>
	<li>トリプリケート、50 を使用して cDNA 合成を実行 (ステップ 6.1) からの総 RNA の ng (材料表参照) 適切な cDNA 合成法を用いたキット 20 μ L (表 1) の最終巻の oligo dT プライマーを使用して。表 2に記載されている条件に従って熱サイクルを実行する qPCR 測定器に、PCR チューブを負荷。</li>
	<li>
実行 (ステップ 6.2) から CDNA qPCR SYBR グリーン化学を使用して (材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>無菌状態で 96 のよく明確な底板をトリプリケートの qPCR 反応のすべてを実行します。</li>
		<li>QPCR マスターから反応混合物の 9 μ L 分注はミックス プレートの各ウェルに (表 3参照)。その後、10 μ L の最終巻を達成するために各ウェルに cDNA の 1 μ L 密封耐熱性 PCR プレート シーラーを使用して PCR プレートを追加し、qPCR 楽器に読み込みます</li>
		<li>表 4に記載された条件に従って熱サイクルを実行します。</li>
		<li>スクランブル コントロールの発現レベルに各サンプルの発現 (Ct 値) を正規化します。これらの値を使用して、計算式のフォールドの変更。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は金融と非金融の利害を宣言しません。

携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの同定は彼らの調節の機能を理解するため重要です。シード シーケンス補完とターゲット シーケンス19,20省に基づいてターゲットを予測するいくつかの計算ツールが用いられます。これらのツールは、貴重な彼らは偽陽性と偽陰性の高レベルを生成できます。したがって、これらの予測は、それぞれターゲット27,31miRNAs の直接結合を確認する RISC 複雑で複雑な miRNA:mRNA のプルダウンの免疫沈降などの実験方法とつながれます。ビオチン標識 miRNA を活用した実験的戦略をプルダウンする模倣このレポートの詳細は、mRNA をターゲットします。ビオチン プルダウンは、高感度と低偽陽性率35,43miRNA ターゲットを識別するために使用でき...

マイクロ Rna (Mirna) は小さなタンパク質式1を負に制御する rna。マイクロ Rna の前駆体は、ゲノム、遺伝子間領域と蛋白質のコーディングの遺伝子2,3のイントロン内にある最も頻繁の多くの地域でクラスターに存在します。Mirna の miRNA エンコーディングから pri miRNAs の転写を含む遺伝子4。Pri miRNAs はシーケンシャル処理、核最初単一の孤立した成熟 Mirna4,5を生成する細胞質にしを受けます。その後、成熟 Mirna が RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に組み込まれている: ターゲット認識4,5のための蛋白質のアルゴノート家族のメンバーを含むポリコームタンパク蛋白・ RNA 複合体 6,7。RISC の複合体の成熟 Mirna は主に 3' UTR ターゲット Mrna8,9,10のバインド、時折、コーディングおよび mRNA の10、11 の 5' UTR 領域にバインドすることも.MRNA に miRNA のバインディングはシーケンス結果翻訳サイレンシング12,13,14といくつかのケースの mRNA の不安定化の15です。単一のマイクロ Rna は多くの Mrna をターゲットできます、のでこれらの規制の分子細胞のほとんどすべてのプロセスに関与しているし、様々 な病気の条件16,17,18に関与しています。
Mirna が細胞経路を調整する方法の詳細な理解には、ターゲット Mrna の同定が必要です。複数のバイオインフォマティクスのプラットフォームは、推定 miRNA:mRNA 相互作用19,20を予測します。これらの予測は、miRNA の 2-8 塩基種子とターゲット mRNA4,21内補足シーケンスの完璧なワトソン Crick 基本組み合わせに依存します。さらに、これらのツールを miRNA:mRNA 二重の二次構造を生成、この分子間相互作用の熱力学的パラメーターを計算およびターゲットの機能的関連性を高めるために種にわたって結合部位の保全を表示予測。残念ながら、これらのツールも非常に高率 (~ 27-70%)15,22偽肯定的な目標を予測の制限があります。最も重要なは、これらのインシリコプラットフォームは彼らのターゲットの23の miRNAs の非正規の相互作用を認識に失敗します。したがって、そのような予測分析はしばしば機能的関連性の高いターゲットを検証するための実験方法と組み合わせて.
複数のアプローチは、miRNA:mRNA 相互作用の実験的検証に開発されています。MiRNA の模倣を使用して遺伝子実験、スポンジとセルの miRNAs のレベルを変更する阻害剤ターゲット遺伝子発現24,25,26の規制影響について手がかりを提供します。さらに、記者ターゲット mRNA および miRNA mimics の 3' UTR 領域を含むクローンとの共トランスフェクションによるアッセイまたはセルに阻害剤は、miRNAs26の調節機能の証拠を提供します。これらのメソッドは、Mirna による遺伝子発現の転写後調節を研究することが重要ですが、miRNA の細胞レベルにおける変化のトランスフェクション効率と pleotropic 効果がこれらの遺伝的アプローチ23の主要な制限 26。したがって、miRNA とターゲット間の直接相互作用を調査する補完的な生化学的手法は Mirna の細胞機能を理解するために用いられます。
MiRNA とターゲット間の直接対話を勉強する 1 つの広く使われている方法は、複雑な27,28,29,30 内 mRNA ターゲットの検出によって続いて RISC の複合体の免疫沈降.最近では、RISC トラップ法の改良はまた miRNA ターゲットを識別するために利用されました。それはターゲット mRNA の精製と RISC マイクロ Rna mRNA 中間体内のターゲットの安定化が高まります。ただし、これらの methodsface は、通常、分離細胞コンパートメント31,32の RNA、RNA 結合タンパク質の非特異的相互作用の固有の挑戦。さらに、これらの試金は RISC 複雑な33の免疫沈降の AGO2 タンパク質の存在に依存しています。AGO2 は効率的な miRNA:mRNA の相互作用を仲介するだけのアルゴノートではない、他の argonautes の排除は偏った結果34に 。したがって、mRNA に miRNA の直接結合を勉強する代替戦略が必要です。
本報告で我々 は miRNA とターゲット間の直接対話をプロービングのためのワンステップ アプローチ手の込んだ mRNA。まず、3' ロックされているビオチン化核酸 (LNA) miRNA 模倣は哺乳類細胞に導入しました。その後、細胞ライセートの複雑な miRNA:mRNA は、ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズを用いたがキャプチャされます。その補完の miRNA にバインドされている mRNA ターゲットは、qPCR を使用して定量化されます。

<table><tbody><tr><td>細胞株HEK293T</td>細胞 <td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 (Hi-FBS)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」培地 (DMEM)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)&nbsp;</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x)</td><td>Cellgro/Mediatech</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清培地</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>3198-088</td><td></td></tr><tr><td>Liopfectamine 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 has-miR-125b</td><td>Exiqon</td><td>339178/ID-27281622</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化スクランブルコントロール</td><td>Exiqon</td><td>479997-671/ID-714884</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン磁気ビーズ</td><td>Pierce</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl) 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl<sub)>2</サブ>)溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩(EDTA)溶液、0.5 M、pH 8.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Superase</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse 遊離水</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript-Select cDNA 合成キット</td><td>Biorad</td><td>170-8897</td><td></td></tr><tr><td>qPCR プライマー&nbsp;</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-Spin Magnet</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>12320D</td><td></td></tr></tbody></table>

ビオチン ベース プルダウン法検証 mrna をターゲットの携帯電話の mirnas

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

マイクロ Rna (Mirna) は、post-transcriptionally 細胞の遺伝子発現を調節する小さな Rna のクラスです。3' 非翻訳領域 (UTR) にバインドする Mirna ターゲット蛋白質翻訳を阻害したり、いくつかのインスタンスで mRNA 分解を引き起こす mRNA。3' UTR マイクロ Rna の 5' 端に 2-8 塩基種子による mRNA ターゲットの miRNA のバインディング。細胞の制御分子としての Mirna の役割が確立している機能的関連性でターゲット Mrna の同定課題のままです。Bioinformatic ツールは miRNA のバインドの潜在的なターゲットとして 3' UTR Mrna の内のシーケンスを予測するために採用されています。これらのツールは、機能的な役割を予測する試みの近縁種の中でこのような配列の進化的保存を決定するため利用されています。ただし、これらの計算方法は、しばしば偽陽性の結果を生成、miRNA と mRNA の正規の相互作用を予測する制限されます。したがって、マイクロ Rna、mRNA ターゲットへの直接結合を測定実験の手順、機能的相互作用を確立する必要。本報告では、細胞の miRNA のミール 125b と 3' UTR PARP 1 mRNA の直接相互作用を検証するため機密性の高いメソッドをについて説明します。合成ビオチン miRNA を模倣された哺乳類細胞にトランスフェクション細胞ライセート ミルナ ・ mRNA 複合体ストレプトアビジン コートした磁気ビーズをおろされたプロトコルを詳しく説明します。最後に、ターゲットは qPCR ベースの戦略を使用してプル ダウン核酸複合体の mRNA の定量化を行った。

Mirna は、ターゲット Mrna に結合して細胞過程を調節します。したがって、特定の mRNA ターゲット、miRNA の機能を理解する鍵です。ここで我々 は細胞のマイクロ Rna の mRNA ターゲットを識別するための方法を詳しく説明します。このプロトコルは、ワニブックスらから適応35プルダウンにビオチン化 miRNA LNA ベース mimics を利用の変更とは、mRNA をターゲットします。LNA によるオリゴヌクレオチドの模倣の使用変更されたリボース リング毒性36,37,38無しのより高い安定性のための標的結合の特異性が向上します。プルダウン PARP 1 mRNA 細胞 miRNA ミール 125b の対象としてこのメソッドを採用しました。神経機能39<s...

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR ポリメラーゼ連鎖反応による定量化のため。

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

この方法は、in silicoで予測されたmRNAターゲットが特定の細胞マイクロRNAと直接相互作用できるかどうかなど、mRNAバイオロジーの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、ビオチン化模倣体を利用して標的mRNAを引き下げることです。また、これらのビオチン化模倣体は、核酸またはLNAベースの模倣体化学を固定しており、反応の特異性を高めることができる非常に高い親和性を持つ非常に安定なオリゴヌクレオチドの形成に役立ちます。この方法論の意味するところは、マイクロRNAの生物学の理解からマイクロRNAベースの治療薬まで拡張できるということです。これは主に、マイクロRNAが細胞生物学のあらゆる側面で重要な役割を果たしていることを誰もが知っているためです。ですから、マイクロRNAの標的、つまりmRNAを特定することで、発見や治療に重要な重要な知識を確実に提供することができます。プロトコールのデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるSabyasachi Dashさんです。磁気ビーズをストレプトアビジンでコーティングするには、まず、ビーズを完全にボルテックスして再懸濁します。次に、再懸濁したビーズ30マイクロリットルを2ミリメートルのヌクレアーゼフリーマイクロチューブに移します。磁石上の磁気ビーズ懸濁液でチューブを充填したチューブを2分間放置します。2分後、ビーズが磁石と接触しているチューブの側面に引き寄せられたら、マイクロピペットを使用して上清を取り除きます。次に、100マイクロリットルの洗浄バッファーをビーズに加えます。ウォッシュバッファーを追加した後、チューブを磁石から取り外します。次に、ビーズを15秒間渦巻きにして洗います。次に、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。インキュベーションが終わったら、上清をピペットで取り出して捨てます。次に、100マイクロリットルのRNaseフリーリング溶液をビーズに加えます。ビーズを15秒間ボルテックスして、RNase溶液を混合します。その後、ビーズを室温で5分間インキュベートします。5分間のインキュベーション後、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。インキュベーション後、上清をピペットで取り出して捨てます。次に、ビーズに100マイクロリットルの再懸濁液を加え、15秒間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブを室温で5分間インキュベートします。5分後、磁石に磁気ビーズを付けたチューブを2分間移します。2分後、上清をピペットで取り出して捨てます。次に、ビーズに200マイクロリットルのビーズブロッキング溶液を追加します。ブロッキング溶液にビーズを再懸濁するには、室温で15秒間完全にボルテックスします。次に、チューブを摂氏4度のマルチチューブローテーターに16時間放置します。ライセートを調製するには、セルスクレーパーを使用し、トランスフェクションしたHEK293T細胞を層流フードの下で掻き取ります。次に、細胞懸濁液を2ミリリットルのマイクロチューブに移します。次に、細胞懸濁液を1,500gで5分間遠心分離する。遠心分離後、細胞ペレットをpH 7.2に維持された1xリン酸緩衝生理食塩水に溶解します。遠心分離のプロセスを繰り返して、残留培地を含まないペレットを得ます。遠心分離が終了したら、ペレットを氷上にすばやく移します。次に、新鮮な細胞溶解バッファーを調製します。バッファーを調製した後、260マイクロリットルの完全細胞溶解バッファーをマイクロチューブ内のサンプルに加えます。細胞ペレットを数回ピペッティングして均質な懸濁液にします。細胞を溶解するには、チューブを摂氏80度で10〜15分間インキュベートします。次に、細胞を氷の上に置きます。摂氏 4 度のベンチトップ遠心分離機で 16 、 000g で 5 分間遠心分離プロセスを繰り返します。遠心分離後、溶解物を含む上清を氷上の滅菌済み1.7ミリリットルマイクロチューブに移し、ペレットを排出します。上清に5モルの塩化ナトリウムを加えて、最終濃度を1モルにします。まず、プルダウンウォッシュバッファーを準備します。ビーズブロッキング後、一晩インキュベーションした後、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。ビーズに、150マイクロリットルの氷冷プルダウン洗浄バッファーを追加します。その後、ビーズを室温で15秒間ボルテックスします。そしてすぐに室温で30〜60秒間インキュベートします。1分後、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。次に、ビーズを300マイクロリットルの完全プルダウン洗浄バッファーに再懸濁します。塩化ナトリウムを添加した後、300マイクロリットルの細胞溶解物を300マイクロリットルのビーズで満たされたマイクロチューブに移します。次に、混合物を室温で1時間、ニューティングミキサーに置きます。1時間後、チューブを磁石に移し、5分間移します。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。次に、300マイクロリットルの氷冷完全プルダウン洗浄バッファーをビーズに加えます。バッファーを添加した後、室温で15秒間ビーズをボルテックスします。次に、チューブを磁石に5分間置きます。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。その後、ビーズを100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶かし、氷上に保存します。ビーズから全RNAを単離します。次に、単離したRNAを25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解します。次に、分光光度計でRNAの濃度を測定します。最後に、RNAの作業用原液を50ナノグラム/マイクロリットルで調製します。次に、単離された全RNAの50ナノグラムを使用して、製造元の指示に従って相補的なDNAを合成します。次に、オリゴプライマーを最終容量の20マイクロリットルまで追加します。PCRチューブをサーモサイクラーに置き、ランを開始します。qPCRが完了したら、プレートの各ウェルに9マイクロリットルのPCR反応ミックスを移します。各ウェルに1マイクロリットルの相補型DNAを添加し、最終容量10マイクロリットルを目指します。次に、耐熱PCRプレートシーラーを使用してPCRプレートをシールし、サーモサイクラーにロードします。次に、サーモサイクラーでプログラムを開始します。miR-125bの標的を検証するために、PARP-1およびp53の標的mRNAの発現レベルを研究します。興味深いことに、PARP-1およびp53 mRNAの発現レベルは、ネガティブコントロールであるActin mRNAよりも比較的高いです。実験で使用された他のネガティブコントロールは、テンプレートなし、および3つの主要なビオチン化スクランブル配列です。さらに、定量化されたPARP-1およびp53の3つの主要な非翻訳領域も、さまざまなレベルの増幅を示しています。これは、Actin、テンプレートなし、3つの主要なビオチン化スクランブル配列などのネガティブコントロールと比較したものです。このPARP-1とp53の増幅は、これらが細胞miR-125bの強力な標的であることを示しています。この技術を習得すると、細胞のプレーティングから始まり、ビオチンタグ付きLNA模倣体のトランスフェクション、PCR分析まで、適切に実行すれば1週間以内に行うことができます。このビデオを見れば、哺乳類細胞における推定mRNAターゲットの検証方法について十分に理解できるはずです。これは、哺乳類細胞に3つの主要なビオチンタグ付きロック核酸模倣物ベースのトランスフェクションを導入することにより、高い特異性と低ノイズ比で達成できます。RNA、特にマイクロRNAなどのsmall RNAを扱う作業は、感度が高く、分解しやすい可能性があることを忘れないでください。したがって、このアッセイを実施する際には、ヌクレアーゼフリーの水、ヌクレアーゼフリーのマイクロフュージチューブ、滅菌バッファーの使用など、必要な予防措置を講じる必要があり、このアッセイを実施する際には、より優れた感度と結果を得るために、新たに調製したバッファーと試薬を考慮する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。...

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3...

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

3'非翻訳領域(3'UTRs)(3'LIFE)の機能的要素の発光同定は、miRNAまたは他の調節因子による3'UTRの機能調節を特定する技術です。このプロトコルは、96ウェルトランスフェクションやルシフェラーゼアッセイなどのハイスループット手法を利用して、機能的抑制のための数百の推定相互作用をスクリーニングします。...

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

ここでは、関心のある転写因子を標的とする小さなヘアピン(sh)RNAで細胞をトランスフェクションした後、公開されているデータ、計算リソース、およびマイクロRNAアレイからのハイスループットデータを使用して、目的の転写因子がマイクロRNAトランスクリプトームに及ぼす影響を研究する戦略を提案します。...

マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

私たちは、増幅を必要とせずに生物学的基質中の分子をバーコード化し、カウントすることにより遺伝子発現を定量化するマルチプレックスハイスループット遺伝子発現プラットフォームの使用について説明します。このプラットフォームを使用して、過敏性腸症候群の有無にかかわらず、全血中のマイクロRNA(miRNA)発現を定量しました。...

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

この RNA プルダウン法は、長い非コード RNA (lncRNA) の RNA ターゲットを識別することができます。自家製、設計されたアンチセンス DNA のオリゴヌクレオチドのプローブ適切に固定ティッシュまたは細胞のこの lncRNA に固有の交配に基づいて、それは効率的に、lncRNA のすべての RNA...

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna...

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

ここでは、1)既知および新規のmiRNAをより正確に同定でき、2)完全に自動化され、自由に利用できる新しい完全に自動化されたmiRNAパイプラインmirMachineを紹介します。ユーザーは、短い送信スクリプトを実行して、完全に自動化された mirMachine...

mirMachine:植物miRNAアノテーションのワンストップショップ

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶビオチンベースプルダウン法で細胞内miRNAのmRNA標的を検証する方法。LNA修飾ミミックとストレプトアビジン磁気ビーズを用いて高特異性で標的mRNAを捕獲し、qPCRで定量します。miRNA生物学と治療薬開発への応用が期待されます。

ビオチンベースプルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

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ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

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