ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

この方法は、in silicoで予測されたmRNAターゲットが特定の細胞マイクロRNAと直接相互作用できるかどうかなど、mRNAバイオロジーの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、ビオチン化模倣体を利用して標的mRNAを引き下げることです。また、これらのビオチン化模倣体は、核酸またはLNAベースの模倣体化学を固定しており、反応の特異性を高めることができる非常に高い親和性を持つ非常に安定なオリゴヌクレオチドの形成に役立ちます。

この方法論の意味するところは、マイクロRNAの生物学の理解からマイクロRNAベースの治療薬まで拡張できるということです。これは主に、マイクロRNAが細胞生物学のあらゆる側面で重要な役割を果たしていることを誰もが知っているためです。ですから、マイクロRNAの標的、つまりmRNAを特定することで、発見や治療に重要な重要な知識を確実に提供することができます。

プロトコールのデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるSabyasachi Dashさんです。磁気ビーズをストレプトアビジンでコーティングするには、まず、ビーズを完全にボルテックスして再懸濁します。次に、再懸濁したビーズ30マイクロリットルを2ミリメートルのヌクレアーゼフリーマイクロチューブに移します。

磁石上の磁気ビーズ懸濁液でチューブを充填したチューブを2分間放置します。2分後、ビーズが磁石と接触しているチューブの側面に引き寄せられたら、マイクロピペットを使用して上清を取り除きます。次に、100マイクロリットルの洗浄バッファーをビーズに加えます。

ウォッシュバッファーを追加した後、チューブを磁石から取り外します。次に、ビーズを15秒間渦巻きにして洗います。次に、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。

インキュベーションが終わったら、上清をピペットで取り出して捨てます。次に、100マイクロリットルのRNaseフリーリング溶液をビーズに加えます。ビーズを15秒間ボルテックスして、RNase溶液を混合します。

その後、ビーズを室温で5分間インキュベートします。5分間のインキュベーション後、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。インキュベーション後、上清をピペットで取り出して捨てます。

次に、ビーズに100マイクロリットルの再懸濁液を加え、15秒間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブを室温で5分間インキュベートします。5分後、磁石に磁気ビーズを付けたチューブを2分間移します。

2分後、上清をピペットで取り出して捨てます。次に、ビーズに200マイクロリットルのビーズブロッキング溶液を追加します。ブロッキング溶液にビーズを再懸濁するには、室温で15秒間完全にボルテックスします。

次に、チューブを摂氏4度のマルチチューブローテーターに16時間放置します。ライセートを調製するには、セルスクレーパーを使用し、トランスフェクションしたHEK293T細胞を層流フードの下で掻き取ります。次に、細胞懸濁液を2ミリリットルのマイクロチューブに移します。

次に、細胞懸濁液を1,500gで5分間遠心分離する。遠心分離後、細胞ペレットをpH 7.2に維持された1xリン酸緩衝生理食塩水に溶解します。遠心分離のプロセスを繰り返して、残留培地を含まないペレットを得ます。

遠心分離が終了したら、ペレットを氷上にすばやく移します。次に、新鮮な細胞溶解バッファーを調製します。バッファーを調製した後、260マイクロリットルの完全細胞溶解バッファーをマイクロチューブ内のサンプルに加えます。

細胞ペレットを数回ピペッティングして均質な懸濁液にします。細胞を溶解するには、チューブを摂氏80度で10〜15分間インキュベートします。次に、細胞を氷の上に置きます。

氏 4 度のベンチトップ遠心分離機で 16 、 000g で 5 分間遠心分離プロセスを繰り返します。遠心分離後、溶解物を含む上清を氷上の滅菌済み1.7ミリリットルマイクロチューブに移し、ペレットを排出します。上清に5モルの塩化ナトリウムを加えて、最終濃度を1モルにします。

まず、プルダウンウォッシュバッファーを準備します。ビーズブロッキング後、一晩インキュベーションした後、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。

ビーズに、150マイクロリットルの氷冷プルダウン洗浄バッファーを追加します。その後、ビーズを室温で15秒間ボルテックスします。そしてすぐに室温で30〜60秒間インキュベートします。

1分後、磁気ビーズの入ったチューブを磁石に2分間移します。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。次に、ビーズを300マイクロリットルの完全プルダウン洗浄バッファーに再懸濁します。

塩化ナトリウムを添加した後、300マイクロリットルの細胞溶解物を300マイクロリットルのビーズで満たされたマイクロチューブに移します。次に、混合物を室温で1時間、ニューティングミキサーに置きます。1時間後、チューブを磁石に移し、5分間移します。

潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。次に、300マイクロリットルの氷冷完全プルダウン洗浄バッファーをビーズに加えます。バッファーを添加した後、室温で15秒間ビーズをボルテックスします。

次に、チューブを磁石に5分間置きます。潜伏期間が終わったら上清を捨ててください。その後、ビーズを100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶かし、氷上に保存します。

ビーズから全RNAを単離します。次に、単離したRNAを25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解します。次に、分光光度計でRNAの濃度を測定します。

最後に、RNAの作業用原液を50ナノグラム/マイクロリットルで調製します。次に、単離された全RNAの50ナノグラムを使用して、製造元の指示に従って相補的なDNAを合成します。次に、オリゴプライマーを最終容量の20マイクロリットルまで追加します。

PCRチューブをサーモサイクラーに置き、ランを開始します。qPCRが完了したら、プレートの各ウェルに9マイクロリットルのPCR反応ミックスを移します。各ウェルに1マイクロリットルの相補型DNAを添加し、最終容量10マイクロリットルを目指します。

次に、耐熱PCRプレートシーラーを使用してPCRプレートをシールし、サーモサイクラーにロードします。次に、サーモサイクラーでプログラムを開始します。miR-125bの標的を検証するために、PARP-1およびp53の標的mRNAの発現レベルを研究します。

興味深いことに、PARP-1およびp53 mRNAの発現レベルは、ネガティブコントロールであるActin mRNAよりも比較的高いです。実験で使用された他のネガティブコントロールは、テンプレートなし、および3つの主要なビオチン化スクランブル配列です。さらに、定量化されたPARP-1およびp53の3つの主要な非翻訳領域も、さまざまなレベルの増幅を示しています。

これは、Actin、テンプレートなし、3つの主要なビオチン化スクランブル配列などのネガティブコントロールと比較したものです。このPARP-1とp53の増幅は、これらが細胞miR-125bの強力な標的であることを示しています。この技術を習得すると、細胞のプレーティングから始まり、ビオチンタグ付きLNA模倣体のトランスフェクション、PCR分析まで、適切に実行すれば1週間以内に行うことができます。

このビデオを見れば、哺乳類細胞における推定mRNAターゲットの検証方法について十分に理解できるはずです。これは、哺乳類細胞に3つの主要なビオチンタグ付きロック核酸模倣物ベースのトランスフェクションを導入することにより、高い特異性と低ノイズ比で達成できます。RNA、特にマイクロRNAなどのsmall RNAを扱う作業は、感度が高く、分解しやすい可能性があることを忘れないでください。

したがって、このアッセイを実施する際には、ヌクレアーゼフリーの水、ヌクレアーゼフリーのマイクロフュージチューブ、滅菌バッファーの使用など、必要な予防措置を講じる必要があり、このアッセイを実施する際には、より優れた感度と結果を得るために、新たに調製したバッファーと試薬を考慮する必要があります。