ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

我々は、局在化カルシウムイオン勾配を用いた巨大小胞の操作技術を提示する。この技術の主な利点は、小胞の表面を完全に非接触で刺激し、カルシウムイオンとの相互作用による脂質膜のリモデリングを直接可視化できることです。私たちのアプローチは、カルシウムイオン膜相互作用の詳細に取り組む手段を導入し、細胞微小環境の変化による細胞膜の再形成のメカニズムを研究するための新しい場所を提供します。

この手順を開始するには、クロロホルム中の脂質溶液を調製します。クロロホルム中の脂質の最終濃度は1ミリグラム/ミリリットルであり、最終質量は0.6ミリグラムである。脂質混合物が入ったガラスバイアルを金属箔で包み、内容物を周囲光から保護します。

金属ホイルで包まれたサンプルバイアルをガラスビーカーの中に入れます。クロロホルムを除去するには、ロータリーエバポレーターで溶媒を3時間蒸発させ、圧力は80rpmで7キロパスカルの真空度に達します。蒸発後、ガラスバイアルの底部に乾燥脂質膜が形成されます。

乾燥した脂質フィルムの上に600マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水をゆっくりと加えます。バッファーを添加した後、6マイクロリットルのグリセロールを穏やかに添加して、マルチラメラ小胞(GUV-MLV)に接続された巨大な単層小胞の形成中にサンプルが完全に脱水されるのを防ぎます。パラフィルムを使用してガラスバイアルを密封します。

また、周囲光から保護するために金属箔で覆います。バイアルを摂氏4度で一晩保管します。翌日、溶液を含むガラスバイアルを室温で超音波処理浴を使用して1分間超音波処理します。

パラフィルムを取り外し、小さな脂質小胞の視覚的に均一な溶液が形成されるまでピペットで移動します。得られた小さな脂質小胞溶液の30マイクロリットルを個々の0.5ミリリットルのプラスチックチューブに分注します。小さな脂質小胞の凍結懸濁液のアリコートが入ったプラスチックチューブを室温で解凍します。

ボルテックスミキサーを使用して、チューブを1〜2秒間4回ボルテックスします。5マイクロリットルの小さな脂質小胞懸濁液をガラスカバースリップの表面に置き、小さな丸い液滴を形成します。ガラスカバースリップは、事前のクリーニング手順なしで使用してください。

次に、ガラスカバースリップを真空デシケーターに20分間置きます。乾燥した脂質フィルムを室温で4分間保存します。次に、乾燥脂質フィルムの上に50マイクロリットルの10ミリモルHEPESバッファーをゆっくりとピペットで移し、水分補給します。

5分間待って、GUV-MLV複合体をプリフォームします。ガラスカバースリップを顕微鏡のステージの中央に置きます。次に、300マイクロリットルのHEPESバッファーをピペットで固定し、液滴の中心を対物レンズの上に配置します。

50マイクロリットルの予備成形されたGUV-MLV溶液をHEPES溶液に移します。25分ほど待つと、まばらに形成されたGUV-MLV複合体がガラスカバーガラスの表面にしっかりと付着します。ホウケイ酸ガラスキャピラリーの端をキャンドルの炎にそっと配置して、マイクロピペットホルダーに取り付けたときにマイクロピペットが壊れないようにして、ホウケイ酸ガラスキャピラリーの端を丸めます。

自動レーザープーラーを使用して、少なくとも3つのガラスキャピラリーを引っ張ります。本文で参照されているホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して、先端開口部の直径が約0.3ミクロンのマイクロピペットを実現します。ピペットチップの詰まりを防ぐため、使用前に0.2〜0.5ミクロンのシリンジフィルターを使用して、HEPES緩衝液中の5ミリモル塩化カルシウム溶液をろ過してください。

次に、マイクロローダーを使用して、各マイクロピペットに8マイクロリットルの塩化カルシウム溶液を埋め戻します。マイクロピペットホルダーをマイクロマニピュレーターに接続します。マイクロピペットをマイクロピペットホルダーにしっかりと取り付けます。

次に、供給チューブを使用してインジェクションポンプとキャピラリーホルダーを接続します。インジェクションポンプを始動した後、インジェクションポンプの設定を20ヘクトパスカルの注入圧力に調整します。また、5つのヘクトパスカル補償圧力を設定します。

顕微鏡を明視野モードに設定します。微分干渉コントラストに設定します。粗いマイクロマニピュレーターを使用して、GUV-MLV複合体を含む液滴の上にマイクロピペットを配置します。

マイクロピペットの先端を対物レンズの上にある位置にあり、粗いマイクロマニピュレーターを使用してピペットを液滴まで下げます。顕微鏡を蛍光モードに設定します。マイクロピペットの先端を膜表面から3ミクロンの距離に置きながら、マイクロピペットから塩化カルシウム溶液を注入してMTPが形成されるようにします。

MTPSをGUV表面に沿って並進させるには、微細なマイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップをGUV表面の周りをゆっくりと動かします。GUV表面とマイクロピペットチップとの距離をほぼ同じに保ちながら、カルシウムイオン注入を続けます。マイクロインジェクションを停止するには、インジェクションポンプをオフにしてください。

ガラスカバーガラスの表面に固定化されたGUV-MLV複合体の代表的な蛍光顕微鏡像を以下に示します。これらの画像では、GUV表面にカルシウムイオンを局所的に注入する際に生じる膜管状の突起を見ることができます。矢印で示されているように、マイクロピペットの先端がメンブレンの表面を中心として並進すると、メンブレンの尿細管状の突起がカルシウムイオン源の方向に動きます。

要約すると、カルシウムイオンによる局所的な刺激により膜管状の突起が形成される巨大な脂質小胞の非接触膜リモデリングを可能にする技術を提案します。この方法の将来の応用には、合成脂質小胞から天然の生体膜への移行や、非接触マイクロマニピュレーションプラットフォームの開発を目的とした高分子システムへのこのアプローチの適用が含まれます。