Name: 魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学ぶメダカの脳下垂体スライス調製法とパッチクランプ電気生理学的手法。神経内分泌細胞の活動電位とGnRH応答を解析し、より生理学的な環境で下垂体細胞機能を研究する新たなアプローチを提供します。

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LourdesCarreon G タンさんのめだかの施設を維持する助けと例示図のアンソニー ・ ペルチェに感謝しますこの作品は、NMBU、許可番号 244461 (養殖プログラム) と 248828 (デジタル ライフ ノルウェー プログラム)、ノルウェーの研究協議会に賄われていた。

生命科学研究科の承認された調査官の監督の下でケアとノルウェーの大学での研究の動物の福祉のための推奨事項に従ってすべて動物取扱を行った。
1. 機器およびソリューションの準備
注: すべてのソリューションは、無菌でなければなりません。細心の注意は、pH と慎重に学びの種の細胞外の環境に適応する必要がありますすべてのソリューションの浸透圧 (osmol/kg 水) に与えべき。pH および浸透圧はそれぞれ pH メーターと凝固点 osmometer など精密電子機器で調整する必要があります。
<ol><li>
なし Ca2 +の細胞外液の 500 ml ペットボトル (Ca2 +無料 EC): 150 mM の NaCl、KCl、1.3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM グルコース、10 mM Hepes。
	<ol>
<li>4.38 g nacl、KCl、186.37 mg の MgCl2グルコースと 450 mL の超純水に HEPES 1.19 g 360.32 mg の 61.89 mg を溶解 (0.055 米国/25 ° C での cm、18.2 m ω の抵抗率) H2O 磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーに。</li>
		<li>7.75 NaOH で pH を調整します。</li>
		<li>500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。</li>
		<li>よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。マンニトールと 290 – 300 mOsm に調整されます。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞外液 (EC) の 500 ml ペットボトル: 150 mM の NaCl、KCl、2 mM CaCl2, 5 mM 1.3 mM MgCl2、4 mM グルコース、10 mM Hepes。
	<ol>
<li>NaCl の 4.38 g、KCl の 186.37 mg、147.01 CaCl2mg、61.89 MgCl2mg、360.32 mg のブドウ糖の超純水 H2O の磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーの 450 mL に HEPES の 1.19 g を溶かします。</li>
		<li>7.75 NaOH で pH を調整します。</li>
		<li>500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。</li>
		<li>よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。マンニトールと 290 – 300 mOsm に調整されます。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1% ウシ血清アルブミン (BSA を用いた EC) と細胞外液の 500 ml ペットボトル: 150 mM の NaCl、KCl、2 mM CaCl2, 5 mM 1.3 mM MgCl2、4 mM グルコース、10 mM Hepes。
	<ol>
<li>NaCl の 4.38 g、KCl の 186.37 mg、147.01 CaCl2mg、61.89 MgCl2mg、360.32 mg のブドウ糖の超純水 H2O の磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーの 450 mL に HEPES の 1.19 g を溶かします。</li>
		<li>7.75 NaOH で pH を調整します。</li>
		<li>500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。</li>
		<li>よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。マンニトールと 290 – 300 mOsm に調整されます。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。50 mg BSA を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞内液 (IC) の 250 mL を作る: 110 mM 20 mM ショ糖 20 mM KCl、10 mM Hepes、コー。
	<ol>
<li>1.54 グラムの KOH、KCl の 327.75 の mg、HEPES の 595.75 の mg、450 mL の超純水 H2O の磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーの中のスクロースの 1.712 g を溶かします。</li>
		<li>7.2 (N morpholino) エタン スルホン (MES) 酸の pH を調整します。</li>
		<li>250 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。250 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。</li>
		<li>よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。280-290 mOsm (EC よりも低い 10 mOsm) とスクロースを調整します。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2% 低融点アガロース溶液の 100 mL は、Ca2 +と BSA 無料 EC (Ca2 +の 100 mL の低融点アガロースの 2 g 無料 EC)。電子レンジを使用して溶解し、40 ° C で水のお風呂で溶かしたアガロースを配置組織で使用する前に 40 ° C に達するまでそれはクールダウンをみましょう。 注: EC、Ca2 +無料の EC は、数ヶ月数週間場合生殖不能、-20 ° C での IC ソリューションの 4 ° C で保存されるかもしれない。アガロースは 4 ° C で 1 週間保存でき、簡単に電子レンジで 3-5 回を再利用できます。過度の再利用は、蒸発やアガロースと塩濃度と品質の変化に します。</li>
	<li>
寒天橋を作る。
	<ol>
<li>外径 (外径) 2 mm の 7.5 mm 長いホウケイ酸ガラス管を熱し、径 (内径) 1.16 mm、焦点距離でブンゼン バーナーを使用する内部と、ガラスが曲がり始めるまで 1 つの端から約 1/3 がポイントします。炎からガラスを削除し、(図 2A) 約 120 度の角度で曲げガラスを許可します。</li>
		<li>Agarose が液体にガラスの両端のいずれかを置くと、数分待って強制的に既製のガラス毛管現象を用いたキャピラリー液体充填、グルコース、電子レンジを使用せず通常の EC で 2% 寒天を溶かします。グルコース不含 EC 4 ° C での使用まで橋を格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切なピペットの引き手を使用してフィラメント パッチ ピペットでホウケイ酸ガラスを準備します。必要な電極の抵抗を取得するピペット引き手マニュアルを参照します。 注: ピペットの先を細くは可能な限り短くする必要があります。ショート ピペット テーパは 4-6 引きの手順を使用して実現されます。電極抵抗は、セル サイズに応じて 2 と 6 の MΩ の間でなければなりません。</li>
	<li>
避けるためにパッチ ・ クランプの実験中に組織の動きはポリエチレンイミン (PEI) ホウ酸バッファー内の 0.1% の記録室の表面をコートします。
	<ol>
<li>ホウ酸バッファー (25 mM) の 500 mL を準備します。<ol>
<li>Na2B4O710 H2O 450 ml の超純水 H2O 磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーでの 4.768 g を溶解します。</li>
			<li>8.4 塩酸で pH を調整します。</li>
			<li>500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL、0.2 μ m フィルター滅菌水の真空システムを使用して、ソリューションまで、超純水 H2O、メスフラスコを入力します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>PEI (49 mL 25 mM ホウ酸バッファーに 1 mL 50 %pei)、0.1 %pei 希釈液の原液を 1% 1% ホウ酸バッファーの 100 μ L の原液の希釈 10 μ L 最終用準備します。</li>
		<li>スライス ホルダーのガラスに 0.1 %pei の 2 mL を追加し、1 分間インキュベート コーティング。簡単に超純水 H2O の 5 mL で 2 回ガラスを洗浄し、使用するまで乾燥空気します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アムホテリシン B のソリューションを準備します。
	<ol>
<li>光から保護 1 mL 管に 50 μ L ジメチルスルホキシド (DMSO)、アムホテリシン B 粉の 3 mg を溶解することにより 60 mg/mL 原液を作る。30 の最大速度で渦 s と均質化に 15 分間、超音波。-20 ° C で 3-5 管に因数を格納し、1 日あたり 1 つの因数を使用します。 注: アムホテリシン B 原液はないはっきりと黄色の色が 15-20 分超音波処理後 (まだ黄色) ミルキーなら新しい原液。</li>
		<li>以上 10 mL 容量ときれいなガラス ビーカーに IC のピペット 2 ml アムホテリシン B の IC ソリューションを確認します。ピペットのソリューションにアムホテリシン B 原液の 8 μ L を加え、ピペッティングで混ぜます。使用するまで氷の上アルミ箔と場所でビーカーをラップし、すべての 3 h を更新します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 郭清と Vibratome とスライス
<ol><li>ハサミでシャープの 1 つと 1 つの強力な鉗子を含む解剖する前に郭清ツールを準備します。きれいにエタノールとツール (ティッシュ ホルダー、ブラシ、鉗子)、郭清のためだけに、固定組織と接触することで使用されるかどうかを確認します。汚染を避けるために別のボックスでそれらを保ちます。</li>
	<li>1 分の氷冷水の魚を安楽死させます。</li>
	<li>
その後の手順は、すぐに (3 分以上使用) シャープの鉗子でメダカの脳や下垂体を解剖します。
	<ol>
<li>押しながら魚強い鉗子で厳しい目の後ろに 2 つの視神経ハサミまたは鉗子を鋭い。</li>
		<li>強い鉗子で一歩一歩の頭蓋骨の骨を壊すことによって後方から前方への頭蓋骨の背の部分を開きます。</li>
		<li>強力な鉗子で片側に頭蓋骨をはがします。</li>
		<li>重症脊髄はさみまたは鋭い鉗子。</li>
		<li>優しく、鉗子で脊髄をつかむ前に後方から脳を反転、冷たい Ca2 +無料 EC と皿に入れます</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体の agarose が付いて 1.5-2 cm3金型を記入し、氷の上に置きます。</li>
	<li>Agarose を (およそ 25-30 ° C) で凝固、直前に優しく鉗子で脊髄が脳をつかむ、上質紙の切れ端で鉗子を乾燥、agarose に組織を置きます。すぐに周囲の組織を残して EC の痕跡を希釈し組織をオリエンテーションし、agarose を硬くなるまで数秒間氷にカビを聞かせてする agarose をミックスします。 注意: この手順で高速が重要です。金型は氷による冷却、agarose が迅速に固化します。</li>
	<li>メスの刃で組織を含む agarose の正方形のブロックをトリムし、vibratome 試料ホルダーの手術 (無毒) 接着剤を使用して接着します。</li>
	<li>冷たい Ca2 +無料理事会とホルダー (脳下垂体) を受け取る vibratome のキュベットを埋める</li>
	<li>Vibratome に試料ホルダーを置き、矢状断面を 150 μ m、高周波および低速を使用して、区分のために agarose ブロックをカットします。選択したセクションを収集し、3 ml の氷冷 Ca2 +無料 EC のパッチ ・ クランプ記録室に配置</li>
	<li>ティッシュ セクションのグリッド ハープ (図 2B) を配置します。 注: ハープ コーティングと共に組織を安定化、パッチ ・ クランプ記録中に動かないようにします。</li>
	<li>ハープを配置した後、Ca2 +通常の EC および BSA に Ca2 +無料 EC メディアを変更します。10 分はティッシュを聞かせてください。</li>
</ol>3. 穿孔パッチ ・ クランプと電気生理学的記録
<ol><li>次の手順により塩化銀ワイヤ電極の実験を開始する前に: 最初に、銀線電極をきれいに目の細かいサンドペーパー (p180) を使用します。第二に、2 mL、70% エタノールでリンスします。第三に、2 mL、10 分の 2-5% 塩素でワイヤを浸しなさい。最後に、すすぎ 2 mL、超純水 H2o.</li>
	<li>顕微鏡ステージの脳-下垂体スライスと録音室を配置および対物レンズ 10 倍を使用してターゲット領域 (下垂体) 40 × 対物を使用してセルを検査します。 注: 準備に成功した場合、非常に少数の円形細胞が見えるはずです。これらの丸い細胞は、通常損傷した細胞の組織から切り離すことです。</li>
	<li>EC お風呂に 2% 寒天橋を介して接地電極を配置します。</li>
	<li>40 × 対物を使用して健康な細胞を探します。 注: 健康な細胞しっかり組織スライスに接続されているとない切り上げ、スライスから切り離されました。</li>
	<li>電圧クランプ (VC; でアンプをセットします。図 4 aのポイント 1) モード。オープン シール テスト ウィンドウを押しお風呂の構成 (図 4 bポイント 1 と 2。5 mV のパルスを使用して、ピペット抵抗 (図 4 bポイント 3) を監視します。</li>
	<li>バックフィル アムホテリシン B マイクロ フィラー注射器を使用しての IC ソリューションを追加する前に抗真菌無料 IC ソリューション パッチ ピペットの先端 (図 3参照)。</li>
	<li>1 mL の注射器を使用してパッチ ピペットに少し肯定的な空気圧を追加します。 注: これは先端の汚染を避けるためパッチ ピペットから液体小流量になります。</li>
	<li>一度風呂にパッチ ピペット抵抗を評価し、ピペット (図 4) の先端に粒子が付いていないことを確認します。 注: テープの小さい部分はビデオ録画フォーム ビューのフィールドを表示するモニター取り付けです。これは位置のセルを基準にしてパッチ ピペットの容易に目的のセルにピントが合わないときになります。</li>
	<li>マニピュレーターを用いたセルまでパッチ ピペットをご案内します。 注: ピペット、ピペットの先端に付けたことがあります小さな粒子を捜すことによってクリーンであることを確認します。抵抗の急激な変化は、ピペット チップで立ち往生粒子の結果もあります。</li>
	<li>ときにいくつかのピペットを再調整セルの上ミクロン、ピペットの先端は、図 5に示すように、セル、セルの中央から 1/3 が触れます。セルに触れて、圧力を解放、シールを作成する穏やかな吸引を適用されます。 注: パッチ ピペットから時間成功にお風呂に入るシールは、可能な限り短くおく必要があります。以上 1-1.5 分間お風呂にリーク、ピペットの先端を到達アムホテリシン B を避けるために。</li>
	<li>すぐにパッチ ・ クランプ ソフトウェア (図 4 Dポイント 1) でパッチウィンドウに切り替えるし、-50 と-60 mV (図 4点 2) 間保持可能性があります。ゼロ アウト高速容量ガラス製ピペット (図 4点 3) によるもの。</li>
	<li>ソフトウェア パッチ クランプ (図 4Eポイント 1 と 2) でセルのウィンドウに切り替えるし、抵抗、 Raウィンドウに表示の監視を開始します。十分なアクセス権後アンプ ソフトウェア (図 4Eポイント 3) 膜容量をゼロに。 注: 十分なアクセスは、10 〜 30 分 (図 4Eポイント 2) をかかることがあります。現在のクランプ録音の良いアクセスは、20 M 以下でなければなりません。</li>
	<li>現在のクランプ、 ICアンプ ソフトウェア ウィンドウ (図 4 階ポイント 1) に切り替えます。3.12 のように同じ値にアンプ ソフトウェア (図 4 階ポイント 2 と 3) の- クランプウィンドウで高速容量性電流を調整します。膜電位 (図 4 階ポイント 1) を確認してください。 注: 重要なは、膜電位が浅い場合 (-35 上典型的な mV) セルが破損する可能性があります。録画をキャンセルし、新しいセルを見つけます。</li>
	<li>健康な細胞を発見した後 (-40 以下潜在的な膜組織にしっかりと接続されている mV)、製造元のプロトコル33,34の詳細として、実験的なレコーディングを開始。</li>
</ol>

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著者がある何も開示するには

脳下垂体スライスのパッチ ・ クランプの技術を使用して電気生理学的記録は、慎重に最適化を必要とします。特に硬骨魚類における生細胞調査のためよく最適化されたプロトコルは哺乳類システムに基づくプロトコルを使用して、文書の大半と限られます。この点で、それは重要な pH および浸透圧のようないくつかの生理学的パラメーターの事実を知っている種だけでなく扶養家族、しかしまた非常に土地や水の問題の生物が住んでいるかどうかに依存します。魚、海洋または淡水環境で暮らす場合にも、考慮に入れる、必要です。たとえば、CO2分圧は魚まで 1.7-3.4 mmHg pCO2魚と哺乳類の36の 40-46 mmHg pCO2哺乳類に比べてはるかに低い。これに基づいて、我々 は 7.75 · 37,·38,39,4...

下垂体は視床下部の下に位置し、視交叉の後方、脊椎動物の主要内分泌器官です。生成され、特定の細胞型から 6 ~ 8 ホルモンを分泌します。下垂体ホルモン脳と末梢器官との間の中間体を構成し、成長、生殖、恒常性の調節など重要な生理学的なプロセスの広い範囲をドライブします。神経細胞、下垂体の内分泌細胞と同様、自発的に活動電位を発生させる能力を持つ電気的興奮性1。これらの活動電位の役割は、細胞依存性です。哺乳類の下垂体のいくつかのセルの種類、活動電位を昇格できます、細胞内 Ca2 +ホルモン2の持続的なリリースを十分に。また、下垂体は、脳細胞の3,4,5,6の膜電位に影響を与えるから促進と抑制の両方の情報を受け取ります。通常、刺激入力興奮性を増加、しばしば細胞内ストアからの Ca2 +の放出を含むと同様発射周波数7増加します。どのようにセルがイオン チャネル構成を利用し、脳からこれらの入力信号に適応を理解理解ホルモンの合成と放出の鍵です。
パッチ ・ クランプの技術により開発され 1970 年代後半ザックマンと Neher 8,9,10 、 11・ ハミル、さらに向上でき、細胞の電気生理学的特性の調査下の単一イオン チャネル。また、電流と電圧の両方の研究の手法を使用できます。今日、パッチ クランプは、細胞の電気生理学的特性の測定のゴールド スタンダードです。タイトなシールのパッチ ・ クランプの技術の 4 つの主要な構成はずっと先進11;セル付、インサイド アウト、外アウト、全細胞のパッチ。3 つの最初の構成は通常、単一イオン チャネルの調査のため使用されます。次のセル接続構成では、4 番目の細胞膜の穴は、減圧を使用して行われます。この構成には、 12セル全体のイオン チャネル構成の調査もできます。しかし、この手法の 1 つの制限は細胞質分子希釈パッチ ピペット ソリューション13 (図 1A)、研究の細胞の電気的および生理学的反応に影響を与えることです。確かに、信号の伝達や異なったイオン チャネルの規制重要な役割を再生可能性がありますそれらの分子のいくつか。これを避けるには、リンダウとフェルナンデス14パッチ ピペットに細孔形成化合物を追加する位置方法を開発しました。セル接続構成では、次の化合物はパッチの下の膜に組み込む、ゆっくりと細胞質 (図 1B) と電気的接触を作成する膜を穿孔します。ナイスタチン15とアムホテリシン B 16などいくつかの異なる抗真菌薬または界面活性剤サポニン β エスシン17,18などを使用できます。これらの化合物は一価の陽イオンと Cl-高分子と Ca2 + 15のようなより大きいイオンのゾル性細胞質のレベルを維持しながら細胞質とパッチ ピペットの拡散を許可するのに十分な大きさの毛穴を作成します。 16。
穴あきのパッチを使用しての課題は、潜在的に高い直列抵抗です。直列抵抗 (Rs) またはアクセス抵抗合成抵抗を地面に関連してパッチ ピペット上です。パッチ ・ クランプ記録中に膜の抵抗と並列に Rsになります (Rm)。Rmと Rs電圧ディバイダーとして並列処理で。高 Rs Rsの録音にエラーを与える倒れる電圧。エラーは記録された大きな電流と大きくなります。さらに、電圧ディバイダーはまた周波数依存の時間分解能に影響を与える低域通過フィルターの作成です。事実上、穿孔パッチできないがあります常に大きい高速な電流の録音 (詳細な測定値は、参照19を参照) ために、電圧ゲートの Na+電流のような。また、Rsは、パッチ ・ クランプ記録、記録された電流の変化に再びリード中に異なる場合があります。したがって、偽陽性は、Rsが薬剤の適用時に変更の状況で発生します。
スライスした組織に電気生理学は20の脳における神経細胞の電気生理学的特性を研究するアンデルセン研究室で初めて導入されました。技術よりそのままの環境で細胞間コミュニケーションとセル回路と同様に、単一のセルの詳細な調査のための道を開いた。下垂体のスライスを作るため同様の手法は、Guérineauらによって 1998 年に導入されました。21します。 しかし、それはなかった 2005 年前に、その脳下垂体スライス標本が魚類22のパッチ ・ クランプ学正常に使用されました。本研究で著者らはまた穿孔パッチ ・ クランプ記録の使用を報告しました。しかし、はるかに、下垂体細胞の電気生理学的調査のほとんどで行われている、哺乳類、魚類1,2,22,23 を含む他の脊椎動物のほんの一握り.真骨魚類、一次解離細胞24,25,26,27,28,29,30 ほぼすべての研究を行った.
本論文ではモデルのメダカから健康な脳下垂体スライスの準備のための最適化されたプロトコルの概要を説明します。アプローチは、一次解離細胞培養に比べていくつかの利点を表します。まず、細胞が解離細胞の培養条件と比較して比較的保存状態の良い環境で記録されます。第二に、スライス標本は解離細胞の培養条件で不可能である細胞間コミュニケーション22を介した間接的な経路を研究することを許可します。さらに、孔形成剤としてアムホテリシン B と穴あき細胞パッチ ・ クランプの技術を使用して得られた組織スライスの電気生理学的記録を行う方法を示します。
メダカは小さな淡水魚の原産アジア、主に日本で発見です。それは多くの実験室で一般的に使用される研究モデルや生理学、発生学、メダカの遺伝学は広く以上 100 年31、検討されています。この紙に特に重要なの魚類に視床下部-下垂体複合体の個別の形態学的組織: 哺乳類や鳥類に視床下部ニューロン解放の神経ホルモンの下垂体の内分泌細胞を調節するのに対し正中隆起のポータル ・ システムに硬骨魚32で下垂体の内分泌細胞に視床下部ニューロンの直接神経投射があります。したがって、魚、特にどのように下垂体細胞とよく保存された脳下垂体ネットワークの下垂体細胞の電気生理学的特性を調査することで特に重要なは、慎重に行った脳下垂体スライス興奮性を制御し、それによって Ca2 +恒常性。

<table><tbody><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond ティッシュ接着剤</td></tr><tr><td>ステンレス製ブレード</td><td>カムデンインスツルメンツ</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>金型</td><td>さくら</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>スチールハープ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>超高純度LMPアガロース</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>パッチピペット</td><td>サッター機器</td><td>BF150-110-10HP</td><td>フィラメント付きホウケイ酸 O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>顕微鏡 Slicescope Scientifica</td><td></td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>デジタイザー Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH トリフルオロ酢酸塩&nbsp;</td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>細孔形成抗生物質</td></tr><tr><td>ポリエチレン&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>ガラス 寒天ブリッジ用</td><td>サッター機器</td><td>BF200-116-15</td><td>ホウケイ酸フィラメント付き O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>超音波処理器</td><td>エルマ</td><td>D-7700シンゲン</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ</td><td>>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>プ</td><td>スSiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES酸</td><td></td><td>SIGMA M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

下垂体細胞の電気生理学的調査は、多くの脊椎動物でも魚類に非常にいくつか行われています。これらのうち、過半数は解離の主細胞で行われています。どの硬骨魚の下垂体細胞の私達の理解を改善より生物学的関連性の高い環境での動作は、このプロトコルは、小さな淡水魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体スライスを準備する方法を示します。値 25 に 28 ° C で住んでいる淡水魚の体液の pH および浸透圧のすべてのソリューションの脳下垂体スライスを作り、調整されました。次のスライス標本は、プロトコルは、穴あき細胞パッチク ランプ法を用いた電気生理学的録音を実施する方法を示します。パッチ ・ クランプの技術は、前例のない時間分解能と感度、単一イオン チャネルにそのまま全体のセルからの電気的特性の調査を許可する強力なツールです。それはそのままパッチ ピペット電極溶液で希釈されてから細胞質の規制要素を防止する細胞内の環境を保つユニーク穿孔パッチです。対照的に、伝統的な全細胞記録を実行すると、めだかの下垂体細胞が迅速に活動電位を発生させる能力を失うことが観察されました。様々 な穿孔技術を利用可能な中でこのプロトコルは殺菌剤のアムホテリシン b. を使用してパッチを適用した膜の穿孔を実現する方法を示します

このプロトコルはターゲット細胞の (Lh 生産アクチビン) めだか形質転換線 [Tg (1塩基変異hrGfpII)] を使用して、下垂体 (gonadotrope) セルから信頼性の高い記録を達成する方法のステップ バイ ステップ プロトコルを示します緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いています。
当初は、全細胞の構成を使用して電気生理学的調査を行った。しかし、任意調査細胞ので自発的な活動電位は見られなかった。セルのサブセットで-50 と-60 mV (図 6) の間の静止電位から小さな現在注射 (5-9 pA) を使用して活動電位をトリガー可能性があります。これらの活動電位が高速ランダウンと誘発電位が可能であったもはや約 4-6 分後。観測された特に高速ランダウンは、小さいセルのサイズによって説明されるかもしれない。一般に、下垂体細胞、ニューロン<sup class="x...

続いて硬骨魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体組織スライスを作るとパッチ ・ クランプの技術を用いた下垂体細胞の電気生理学的記録のために、最適化されたプロトコルを説明、穴あきのパッチ構成。

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

この方法は、神経内分泌学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。下垂体細胞はどのように通信し、脳からの放出因子に反応しますか?この技術の主な利点は、この最初の初代細胞培養と比較して、この手順により、より無傷の環境で細胞を調査できることです。この方法は、メダカの黄体形成ホルモン産生細胞の電気的特性についての洞察を提供することができます。わずかな調整で、他の細胞種や他の魚種にも使用できます。エタノール滅菌した強力な鉗子で安楽死させたテレオストフィッシュを解剖顕微鏡で保持しながら、鋭い鉗子で目の後ろの2つの視神経を切断し、頭蓋骨を後から前側に骨折します。鉗子を使用して頭蓋骨を剥がし、脊髄を切断します。鉗子で脊髄を優しくつかむと、脳が後方から前方に反転し、氷のように冷たく、カルシウムを含まない、余分な細胞培地で満たされた皿に臓器を置きます。次に、1ポイント5〜2立方センチメートルの金属ホールドに液体アガロースを充填し、型を氷の上に置きます。アガロースが固まる直前に、鉗子を使用して脊髄で脳を優しく拾い上げ、実験用紙で鉗子を乾かし、脳をアガロースに入れます。次に、アガロースをすばやく混合して、組織に残った余分な細胞培地の痕跡を希釈し、必要に応じて型内の脳の向きを調整します。アガロースが固まったら、メスの刃を使用して組織の周りのアガロースの正方形のブロックを切り取り、外科用接着剤を使用してサンプルをビブラトーム標本ホルダーに取り付けます。ビブラトームホルダーのキュベットに氷冷したカルシウムを含まない細胞外培地を入れ、ホルダーをビブラトームに入れます。高周波と低速を使用して、アガロースブロックを切断して150マイクロメートルのパラサジタル切片を作成し、選択した切片を3ミリリットルの氷冷カルシウムフリーの余分な細胞溶液を含むパッチクランプ記録チャンバーに入れます。アガロースに脳を添加した後は、成形されたアガロースに長時間放置すると組織が乾燥し、切片化前の空気へのアクセスが制限されるため、迅速に行動することが重要です。すべての切片を取得したら、グリッドハープを組織切片に置き、カルシウムを含まない細胞外培地を、ウシ血清卵白を補充したカルシウムを含む細胞外培地に置き換えます。その後、ティッシュを10分間休ませます。パッチクランプを設定するには、脳下垂体スライスがセットされた記録チャンバーをパッチクランプ記録顕微鏡ステージに置き、10倍対物レンズを使用して下垂体の位置を特定します。接地電極を2%寒天ブリッジを介して細胞外培地浴に置き、40X対物レンズを使用して健康な細胞を見つけます。アンプを電圧に設定しますamp モードにし、シールテストウィンドウを開きます。バス構成を選択し、5ミリボルトのパルスを使用してピペット抵抗を監視します。パッチピペットの先端を抗真菌性遊離細胞内培地で埋め戻してから、マイクロフィラーシリンジを使用して、アムホテリシンBを補充した細胞内溶液をパッチピペットの後部に追加します。1ミリリットルのシリンジを使用して、パッチピペットにわずかに正の空気圧を加え、ピペットチップの汚染を防ぎ、パッチピペットの耐性を評価します。ピペットの先端に粒子が付着していない場合は、マイクロマニピュレーターを使用してパッチピペットを細胞まで誘導します。ピペットがセルから数ミクロン上にあるときにピペットを再調整して、ピペットの先端がセルの中央から3分の1の距離でセルに接触するようにします。セルに触れるには、圧力を解放し、優しく吸引してシールします。パッチピペット内の陽圧により、約1分後に抗真菌剤が漏れ、細胞が損傷するため、ギガシールを迅速に塗布することが不可欠です。シールが所定の位置にあるときは、すぐにパッチクランプソフトウェアのパッチウィンドウに切り替え、保持電位を負の50〜負の60ミリボルトに調整します。ガラスピペットで補う高速容量をゼロにし、セルウィンドウに切り替えてアクセス抵抗の監視を開始し、十分なアクセス後にアンプソフトウェアでメンブレン容量をゼロにします。電流クランプに切り替えて、I-Clampウィンドウでピペットの高速容量性電流の正しい値を調整し、結果として生じる膜電位を確認します。次に、細胞を膜電位がマイナス40ミリボルト未満の組織にしっかりと付着させた状態で、メーカーのプロトコルに従って実験記録を開始します。活動電位は、負の50〜負の60ミリボルトの静止電位からの5〜9ピコアンペア電流注入を使用して、下垂体細胞のサブセットで引き起こすことができます。これらの活動電位は急速に減少し、約4〜6分後には、トリガーされた活動電位は達成できなくなります。アムホテリシンBを用いた穿孔パッチ構成に切り替えると、記録された細胞の約50%で自発的な活動電位が観察され、これらの細胞の95%で活動電位が引き起こされ、最大1時間の記録後でも観察可能なランダウンがなくなります。ゴナドトロピン放出ホルモン1は、穿孔パッチ構成の細胞に放出されるパフは、二相性応答を明らかにし、その間に細胞は応答の最初のフェーズで過分極され、内部ストアからのカルシウム放出に続いて細胞の脱分極と、第2フェーズで1〜2ヘルツから3ヘルツへの活動電位発火周波数が増加します。この手順を試みる際には、すべての溶液が使用している実験生物(この場合はメダカ)の生理機能に適合させる必要があり、この値は異なる温度で生息する種によって異なるため、pHに特に注意する必要があることを覚えておくことが重要です。

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、GABA活性化単一チャネル電流（GABAAチャネル、GABAA受容体）とそれらが神経細胞で生成シナプスとトニック電流を測定するパッチクランプ技術を使用してください。チャネルの活性化は、健康や​​病気で神経細胞の興奮性を低下させる...

ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

このビデオでは、複雑な神経回路を維持し、脳全体の準備、で識別される単一のニューロンからの電気的活動を記録する方法を説明します。私たちは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンは遺伝的に無傷の脳の準備の識別のための蛍光タンパク質でタグ付けされたトランスジェニック魚を使用しています。...

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。...

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

本論文では、成人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、無傷の動物における記録と神経活動の操作を可能にするためのin vivo電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。...

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

ここで準備し、メダカ (メダカ) からプライマリ下垂体の細胞培養を維持するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルの最適化条件はそれにより生理学的より意味のある結果を有効にする、魚の生理学的条件を模倣して考慮温度、浸透圧、pH...

魚脳下垂体から質の高いプライマリ細胞培養の準備

ここでは、横性属核を含む急性脳スライスの調製のためのプロトコルと、網膜原生殖器およびコルチコゲニキュレートシナプス機能の電気生理学的調査を行う。このプロトコルは、同じ急性脳スライスの高放出および低放出確率でシナプスを研究する効率的な方法を提供します。...

網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

本稿は、DiI の心臓灌流を固定で希釈し、メダカ (Oryzias latipes) をモデルとして使用し、脳と下垂体組織に焦点を当てて、teleost...

DiI による心灌流を用いた Teleost 脳および下垂体の血管の標識

自由に泳ぐ金魚の脳からの細胞外神経信号を記録するための新しい無線技術が提示される。記録装置は、マイクロドライブ、ニューラルデータロガー、防水ケースの2つのテトロドで構成されています。データロガーとそのコネクタを除くすべての部品はカスタムメイドです。...

自由に泳ぐ魚における可動テトロデスによるニューロンの無線電気生理学的記録

提示されたプロトコルは、潜在的な抗てんかん物質の前臨床評価ツールとして重要な脳スライスを使用するという究極の目標を持つ切除されたヒト海馬組織の輸送および調製について説明する。...

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

学ぶメダカの脳下垂体スライス調製法とパッチクランプ電気生理学的手法。神経内分泌細胞の活動電位とGnRH応答を解析し、より生理学的な環境で下垂体細胞機能を研究する新たなアプローチを提供します。

魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス

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