Name: 差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ ヒト多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を分化させる方法。BEST1変異によるベストロフィノパチーの病態メカニズムを解明し、細胞置換療法への応用可能性を探索する研究手法です。

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このプロジェクトは、立ち上げ資金のためのロチェスターの大学、GM127652、NIH 助成金 EY025290 で賄われていた。

1. hPSC RPE への分化
<ol><li>維持し、通路 hPSCs 前述した18。 注: (hPSC RPEs、hPSCs など) のすべてのセル成長および微分のプロトコルの期間中 5% CO2 37 ° C で育ちます。</li>
	<li>
分化する前にあらかじめコーティング 6 ウェル プレートに合流 hPSCs を分割します。
	<ol>
<li>コート プレート、約 1 時間の氷の上の基底膜マトリックスを解凍、1:50 で 4 ° C DMEM 培地における液状化・行列を停止に希釈、各ウェルに 800 μ L コーティング混合物を追加し、37 ° C で少なくとも 1 時間インキュベート</li>
		<li>コーティングが完了したら、混合物を吸引し、すぐに井戸に 1.5-2 mL の培地を追加します。</li>
		<li>古い培養皿から hPSCs を持ち上げる、室温で 5 分間 PBS プラス 0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を孵化させなさい、ソリューションを吸引、培養培地に小さな塊の細胞を再懸濁します。</li>
		<li>新しい板で 〜 20% の confluency シード細胞。 注:-20 ° C で 100 μ 因数で基底膜マトリックスし 6 ウェル プレートに塗るに 1 つの因数を利用します。コーティングのための時間は、37 ° c、または一晩室温で 4 h まで拡張できます。中断し、単一のセルではなく、3-5 細胞の小さな塊として hPSCs をシードすることが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞がフルの confluency に成長できたら、置き換える培分化培地 (4 mL/ウェル) (表 1、アクチビンなし-A)。文化 14 日間 (4 mL/ウェル) 媒体を変更する 3 x/週。 注: hPSC プレート密度ダブルス約すべての 24 h. 重要な細胞死は、微分の手続きの開始後期待されます。死んだ細胞や井戸に破片の集合体は、中程度の変更時に肉眼で見ることができます。</li>
	<li>28 日目に、15 日から 100 ng/mL 人間アクチビン A (表 1アクチビン A の人間) と分化培地を補足します。媒体 (4 mL/も) を変更 3 回/週。</li>
	<li>日 29 (表 1、人間アクチビン A なし) にアクチビン A 補給を停止します。8-10 週間色素 hPSC RPE クラスターが表示される (図 1 aB) まで分化培地で培養を続けます。 注: 色素細胞のクラスターは細胞培養プレート上に小さな暗い点として (図 1 a ・B、トップ)、肉眼で見ることが。署名の玉石の形状と個々 の色素細胞は (図 1 a・ B下) 20 X 顕微鏡下で見ることができます。</li>
</ol>2. 分離と差別化された RPE 細胞の培養
<ol><li>分化培地を取り除き、PBS で 1 回洗浄、0.05% トリプシン プラス 1 U/μ L を各ウェルにコラゲナーゼの 1 mL を加えると, 20-30 分削除トリプシン/コラゲナーゼの 37 ° C で、軽く 6 ウェル プレートの各ウェルに予め温めておいた RPE 媒体の 2 mL を追加 (<c0 > テーブル 2)。 注: 倒立顕微鏡を使用してトリプシン/コラゲナーゼ処理前に多角形である hPSC RPE 細胞の形態を監視するなり充分な消化後ラウンド。</li>
	<li>
プル ガラス パスツール ピペットにブンゼン バーナーを使用します。
	<ol>
<li>両手で両端水平方向だとブンゼン バーナーの上に長い (9 インチ) パスツール ピペットを保持、ピペットの薄い部分の長さを約 2/3。</li>
		<li>ガラスは炎からソフトになると、すぐに引き離し 2 つの端、マイクロのスクレーパーのような先端が新しいピペット (図 2) 末に形成されることなど。</li>
		<li>複数「細胞スクレーパー」を作成するために数回をを繰り返します。70% のエタノールの殺菌と引っ張られたピペットをスプレーし、細胞文化フードでそれらを空気乾燥します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
顕微鏡、マイクロ「細胞スクレーパー」を使用して、優しくプレートから色素 hPSC RPE クラスターを分離します。
	<ol>
<li>軽く (こすりしない) 直接色素細胞のある、フロートを培地に一度井戸の底から彼らを切り離して考えます。</li>
		<li>すぐに 20 μ L マイクロ ピペットを使用して、優しく解離 hPSC-網膜色素上皮細胞を吸引、RPE の中の24のプレコート 6 ウェル プレートにそれらを転送するため。</li>
		<li>複数回、必要に応じて 2.3.1–2.3.2 の手順を繰り返すことによって 12 ウェル プレートのプレコート各 5 〜 10 の3セル (~ 10% の confluency 20 X 顕微鏡下で観察) x を収集します。2 mL に媒体の最終巻をもたらします。 注: 解離 hPSC RPE を防ぐために浮遊細胞で動きを避けるためプレートの解離過程の中に解離細胞培地に浮遊しているローカル集中のままが。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 中色素分子 (図 1) を形成するための別の 6-8 週間 12 ウェル プレートに培養新たに単離した hPSC 網膜色素上皮細胞 (P0)。</li>
	<li>3 媒体を変更 x/週。メディアを変更すると、各ウェルに古い媒体の約 1/3 量を残すし、新鮮な予め温めておいた RPE 培地 2/3 量を追加します。この段階で 12 ウェル プレートの各ウェルの RPE 培地 2 mL を使用して (したがって、交換中の 1.3 mL たび)。 注: P0 hPSC 網膜色素上皮細胞の単層細胞が積極的に、流体を輸送するいるとタイトジャンクショ25によって固定されます、ドームを形成できます。したがって、ドーム形成は成熟 RPE ステータスのインジケーターです。</li>
</ol>3. イムノブロット RPE 運命検証
<ol><li>カクテルを作る hPSC 網膜色素上皮細胞ライセート プロテアーゼ阻害剤を添加した哺乳類タンパク質抽出バッファーを使用してください。不溶細胞の残骸を破棄する 4 ° C で 15 分間 13,000 × gで遠心分離前に 30 分間氷の上細胞ライセートを孵化させなさい。ライセートの総蛋白濃度を測定します。</li>
	<li>変性 40 μ g 75 ° C で塩化物イオンと SDS サンプルバッファーの総蛋白質の 10 分別の蛋白質のサンプル 15 分、染料のフロントに達するまで 150 V、90 V の定電圧で 10% トリス-グリシンの SDS ページのゲルのゲルの底。</li>
	<li>1 h の 100 V で 10% メタノールを添加した予冷のトリス-グリシン バッファー内の硝酸セルロースの膜に蛋白質を転送します。</li>
	<li>0.1% 非イオン性洗剤 (TBST) と室温で 1 時間 5% 脱脂乾燥したミルクでトリス緩衝生理食塩水の膜をブロックします。</li>
	<li>一晩で 4 ° C ブロック バッファーで希釈した一次抗体と細胞膜を孵化させなさい。網膜色素上皮特異的マーカー蛋白質を次のようにターゲット抗体を希釈: RPE65、1:1, 000CRALBP、1:1, 000BEST1 は、1:1, 000。ローディング コントロールとして β-アクチンを検出する 1: 10,000 で β-アクチン抗体を希釈します。</li>
	<li>TBST の 3 回、各洗浄のため 5 分で膜を洗浄します。</li>
	<li>Fluorophore 共役ヤギ抗マウス IgG 抗体希釈 1: 10,000 室温で 1 時間ブロッキング バッファー内で膜を孵化させなさい。</li>
	<li>TBST 4 回、各洗浄のため 10 分で膜を洗浄します。</li>
	<li>赤外線システム (図 3) を用いたタンパク質を検出します。</li>
</ol>4. 免疫染色による細胞内局在 BEST1 をチェックします。
<ol><li>1 回 2 ml の PBS の hPSC 網膜色素上皮細胞を洗浄し、常温で 45 分 4% パラホルムアルデヒドの 2 mL で修正します。</li>
	<li>2 mL の PBS で 2 回洗うし、0.1% 非イオン性界面活性剤と 2% ロバ血清非特異的結合部位をブロックする 45 分の 2 mL の PBS のセルを孵化させなさい。</li>
	<li>室温で 2 h の BEST1 抗体 (希釈 1: 200) 細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>2 ml の PBS 3 回の細胞を洗浄します。孵化 fluorophore 共役二次 IgG (1:1, 000) 室温で 1 時間。</li>
	<li>非連結の二次抗体を削除する PBS 3 回 2 mL で洗います。</li>
	<li>共焦点顕微鏡 (図 4) によるステンド グラスの細胞を観察します。</li>
</ol>5. 記録 Ca2 +-hPSC-RPE 細胞パッチク ランプでの Cl-現在の依存
<ol><li>24-72 時間、パッチク ランプ、前に分割 (玉石形や色素)、完全に合流も (12 ウェル プレート) に成熟した P0 hPSC 網膜色素上皮細胞の。、Pbs 中、洗って一度を吸引し、井戸に 0.05% トリプシン プラス 1 U/μ L コラゲナーゼの 1 mL を追加します。 注: 事前使用直前の 37 ° C にトリプシン/コラゲナーゼを温めます。</li>
	<li>8 分 37 ° C で孵化させなさい。 注: この手順後 hPSC 網膜色素上皮細胞がまだ付着性細胞と接続しています。</li>
	<li>水洗いして、プレートからセルに 1 mL ピペットを使用し、消化混合物内のセルを 15 mL の円錐管に転送します。予め温めておいたトリプシン/コラゲナーゼ残留細胞を収集し、それらを組み合わせて 15 mL の円錐管に 1 mL でよく洗ってください。 注: hPSC 網膜色素上皮細胞が大きな塊でまだこの時点で。積極的なピペッティングにより細胞塊を破るしないでください。いくつかの塊が 1 mL 先端の内側の壁に固執します。</li>
	<li>8 分間 37 ° C の乾燥浴で円錐形の管を孵化させなさい。</li>
	<li>1 mL ピペット ピペットをゆっくり上下に 10-15 回消化ミックスを使用します。 注: セルの塊は、まだ目に見えるが、ずっと狭くなった。積極的なピペッティングを避けてください。</li>
	<li>前の 2 つの手順を繰り返します。 注: 細胞の大部分は、ピペッティングした後単一細胞懸濁液にする必要があります。受け入れているいくつかの小さな細胞塊はまだあります。オプション: 穏やかなピペッティングに続いてさらに 5 分間 37 ° C で円錐形の管を孵化させなさい。37 ° C でトリプシン/コラゲナーゼの合計時間 30 分 (8 + 8 + 8 + 5 = 29) を超えてはなりません。</li>
	<li>消化細胞を含む 15 mL コニカル チューブに予め温めておいた RPE 培地 5 mL を追加します。200 x のg細胞を収集するために 5 分で回転します。10-20% の confluency にプレコート 35 mm 料理に再中断と種子の細胞 (例えば100% 10% の confluency 5 35 mm 皿に 12 ウェル プレートにも合流)。 注: すべての回で避けるため積極的なピペッティング、遠心分離後の上清の明白な暗い細胞の残骸によって表される、重要な細胞死をさせることがあります。十分に分離単一セルのシードは、パッチ ・ クランプ記録のために不可欠です。</li>
	<li>全細胞パッチを実行18,26,27,28,29,30,31を前述のようにクランプします。ステップ電位の家族から現在のトレースを取得 (+100、-100 0 の開催可能性から mV mV) (図 5)。 注: 内部と外部のソリューションのレシピそれぞれ表 3 表 4で説明されます。</li>
</ol>

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<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
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病気の料理方法の最も重要な手順は、 BEST1の RPE の正しいセル血統に病気の原因となる変異を有する hPSCs を区別することです。したがって、各分化実験後結果の hPSC 網膜色素上皮細胞慎重によって検証されるべきの成熟状態の RPE 固有の形態とタンパク質マーカー16,17,18。クローン アーチファクトを最小限に抑えるために同じ患者から複数によるクローンまたは同じ変異を有する複数の hESC クローン使用してください可能な限り。
HESC の線は、同じプロトコルで RPE に区別できます。hiPSCs BEST1遺伝子の突然変異の有無は、それぞれ BEST1 患者や健康なドナーの皮膚線維芽細胞から書き換えることができます。hESCs BEST1 の突然変異を軸受は、野生型 (WT) BEST1 を持つ親 hESC 行から遺伝子組み換えできます。自分の...

それは、少なくとも 5 つの網膜変性疾患がBEST1遺伝子1,2,3,4,5,6遺伝子の突然変異によって引き起こされるを記載されています。,7,8、200 と依然として増加を既に報告された突然変異の数。これらのBEST1-準の病気として知られている bestrophinopathies、進歩的な視野の損失と、さらには失明を引き起こすし、効果的な治療法は現在ありません。BEST1、すなわち BESTROPHIN1 の蛋白質の製品 (BEST1) は Ca2 +-アクティブ Cl-チャネル (CaCC) 目5,6、網膜色素上皮 (RPE) に特異的に発現 8,9。BEST1の重要な臨床表現型-関連疾患は眼球電図10,11; 測定光ピーク (LP) と呼ばれる、光の刺激に減らされた視覚反応LP は RPE12,13,14CaCC によって媒介されると考えられています。BEST1の突然変異の病理メカニズムをよりよく理解するために、潜在的な治療に向けてに取り組む、内生人間の網膜色素上皮細胞に発現変異の BEST1 チャンネルの勉強は必須です。
ただし、取得 RPE ライブ患者から直接細胞はない非常に実用的です。ネイティブの網膜色素上皮細胞は、人間の死体と胎児のバイオプシーから収穫されることが、これらの情報源に困難なアクセシビリティは大幅に、科学的な研究を制限しています。したがって、代替の RPE ソース以外の人間の目を持つことが重要です。この呼び出しは、幹細胞技術の最近の進歩によって回答されている網膜色素上皮細胞の機能が今ひと多能性幹細胞 (hPSCs) を含む萌芽期の幹細胞 (hESCs) から区別することができ、誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)、後者リプログラミング ドナー16,17,18からプライマリ皮膚線維芽細胞によって生成されています。重要なは、自己更新と hPSCs の多能性確保 hiPSCs の患者特異性と hESCs (例えば、CRISPR によって) のゲノムの変更可能性の多彩な料理での疾患モデルを提供しています RPEs を生成する信頼性の高いソース目的のBEST1の突然変異。
hPSC RPE マウス RPE モデル上のいくつかの利点がある: 1) BEST1ノックアウト マウスの網膜異常19マウスとヒトの間 RPE でBEST1のさまざまな遺伝的要件の可能性を高めるを表示しません。2) 人間の網膜色素上皮細胞の 3% がマウス20; 35% と対照をなして、嬢だけ3) による網膜色素上皮移植の臨床を促進する網膜の治療疾患21。しかし、動物モデルがまだライブ システムに RPE の生理学と病理学を勉強するために不可欠である、ことの発癌性を見落すことができません。
ここでの手順では、研究と臨床目的のため使用することができます網膜色素上皮分化プロトコルに役に立つと適度に単純な hPSC について説明します。このプロトコルでは、ナイアシン (ビタミン B3) を使用して、hPSCs、RPE への分化誘導アクチビン A と治療に起因するさらに神経組織への分化を増強セル22を差別化のアポトーシス活性を減衰させることによってして、ニコチンアミド治療を色素細胞 (RPE への分化の記号) の数を増やす可能性が示されています。結果の hPSC 網膜色素上皮細胞は、ネイティブひと網膜色素上皮細胞22として同じキー マーカー、石畳の形態と細胞機能を表示します。したがって、研究の設定で、結果の hPSC 網膜色素上皮細胞は、法、免疫染色と細胞パッチクの詳細な実験手順は提供されていますを含む下流の機能解析に適しています。臨床的に、幹細胞由来網膜色素上皮細胞は、動物試験とひと試験23の黄斑変性症の移植治療のための大きな可能性を示しています。

<table><tbody><tr><td>ノックアウト(KO) DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KO 血清補充</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Human activin-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (修飾型)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 サプリメント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン-ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>トリヨード-チロニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 中型</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER 哺乳類タンパク質抽出試薬</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>ベータアクチン抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 パッチクランプアンプ</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: best1変異の皿での疾患モデル

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

人間BEST1遺伝子の 200 以上の遺伝的変異を特定し、網膜変性疾患にリンクされている、病理学的メカニズムままBEST1を研究するためのモデル良い体内の不足のために主にとらえどころのないです。生理学的な条件の下でその変異体。BEST1は、イオン チャネル、すなわち BESTROPHIN1 をエンコード (BEST1)、網膜色素上皮 (RPE) の機能ただし、ネイティブのひと網膜色素上皮細胞に非常に限定されたユーザー補助は、科学研究の主要な課題を表します。このプロトコルでは、ひと多能性幹細胞 (hPSCs) から誘導される分化によってBEST1病気を引き起こす突然変異をつける人間の RPEs を生成する方法について説明します。HPSCs は自己再生可能、このアプローチにより、hPSC-RPEs 法、蛍光抗体法、パッチク ランプなどの様々 な実験的解析のための着実なソースを持っている研究者の非常に強力な皿での疾患モデルを提供しますBEST1-網膜の条件に関連付けられています。特に、この戦略は、RPE (病態) 生理と RPE でネイティブ表現の興味の他の遺伝子研究に適用できます。

差別化された P0 hPSC RPE 人口の高純度を達成するためにめざす手動分離の最も技術的に挑戦的なステップです。成功した分離後 &gt; P0人口の 90% の細胞が成長し、成熟署名 RPE 形態 (図 1) を表示します。RPE 非または P0人口の未熟な網膜色素上皮細胞のマイナーな部分の存在はほぼ避けられないが、下流の実験と干渉しない限り、発色が良くて、石畳状 hPSC 網膜色素上皮細胞の数が圧倒的大半は。
総合的に特徴づけられる生体内でタンパク質発現 (免疫ブロット、図 3)、膜人身売買 (することができます hPSC RPE ベース料理での疾患アプローチBEST1にある各患者特有の変異免疫染色、<strong class=...

患者由来の変異ひと多能性幹細胞からの網膜色素上皮 (RPE) を区別するためにプロトコルをご紹介します。変異細胞は、免疫ブロット、蛍光抗体法、パッチク ランプなど機能の分析に使用可能性があります。この病気の料理方法は、ネイティブのひと網膜色素上皮細胞を得ることが困難を回避できます。

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

この方法は、イオンチャネル関連網膜疾患分野における、BEST1変異の分子メカニズムとベストロフィノパチーの病理に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒトからRPE細胞を直接取得することの難しさを回避できることです。この技術の意味は、RPE細胞を研究目的と細胞補充療法の両方に使用できるため、ベスト疾患を含むベストロフィノパチーの治療にまで及びます。hPSC培養物がコンフルエントに達したら、培養液を6ウェルプレートのウェルあたり4ミリリットルの分化培地と交換します。2週間の培養後、分化培地にヒトアクチビンAの1ミリリットルあたり100ナノグラムを補充し、補充した培地を週に3回、さらに14日間交換します。29日目に、色素沈着したRPE細胞クラスターが現れるまで、さらに8〜10週間、非補充の分化培地に切り替えます。色素沈着したRPE細胞を単離するには、まず、個々の9インチガラスパスツールピペットをブンゼンバーナーの炎の上に水平に保持します。ピペットの薄い部分の長さの約3分の2下にあります。加熱されたガラスが柔らかくなったら、2つの端をすばやく引き離して、ピペットの新しい端にマイクロスクレーパーのような先端を形成します。引っ張ったピペットに70%エタノールをスプレーし、細胞培養フードで自然乾燥させます。ピペットの準備ができたら、分化培養の各ウェルをPBSで洗浄し、コラゲナーゼ1マイクロリットルあたり1単位を補充した0.05%トリプシン1ミリリットルを各ウェルに加えます。摂氏37度で20〜30分後、6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルの摂氏37度RPE培地で消化を停止し、プレートを顕微鏡ステージに置きます。引っ張ったピペットを使用して、色素沈着したRPEクラスターを軽くたたきます。細胞がウェルの底から分離したらすぐに、20マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、解離した細胞をRPE培地を含む新しい細胞培養プレートの個々のウェルに移します。約5, 000個のRPE細胞を12ウェルプレートの各ウェルに添加したら、新鮮なRPE培地で最終容量を最大2ミリリットルまで持ってきて、単離されたhPSC-RPE細胞をさらに6〜8週間培養し、色素沈着した丸石型の成熟RPE細胞の単層が観察されるまで観察します。パッチクランプの24〜72時間前に、色素沈着した単層細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、PBSを除去した後、1ミリリットルの0.05%トリプシンとコラゲナーゼ1マイクロリットルあたり1単位を12ウェルプレートの各ウェルの細胞に1マイクロリットル加え、摂氏37度で8分間のインキュベーション期間を行います。細胞が剥離し始めたら、1ミリリットルのマイクロピペットを使用してウェルの底から細胞を優しく洗い、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管にプールし

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。...

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。...

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

このプロトコルでは、多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞 (RPE) を生成する方法について説明します。メソッドは、分化誘導細胞の未熟な網膜色素上皮に 14 日で成熟し、機能的な RPE 3...

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

このプロトコルの目的は、高齢者や病気にかかった人間ブルッフ膜の網膜色素上皮 (RPE) 細胞の培養を示すことです。このメソッドは、侵害された細胞外のマトリックスの RPE...

高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

非ヒト霊長類(NHP)は、解剖学的および遺伝的類似性によるヒトの細胞疾患治療を研究するための理想的なモデルである。本稿では、NHP眼における網膜色素上皮細胞の脳下移植法と、黄斑操作に伴う術中合併症を予防するための戦略を記載する。...

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。...

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。...

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

マウスモデルは、網膜色素上皮(RPE)の生物学を調べるための有用なツールとなり得る。マウスは一連のRPE病理を発症する可能性があることが確立されています。ここでは、光、透過電子、および共焦点顕微鏡を使用してマウスのRPE病理を解明および定量化するための表現型プロトコルについて説明します。...

加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

ここでは、生理的酸素条件下でmRNAの5'キャップに結合する翻訳開始因子を分析するためのヒト細胞培養プロトコルを紹介します。この方法は、アガロース結合m7GTPキャップアナログを利用しており、キャップ結合因子とその相互作用パートナーの研究に適しています。...

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

学ぶ ヒト多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を分化させる方法。BEST1変異によるベストロフィノパチーの病態メカニズムを解明し、細胞置換療法への応用可能性を探索する研究手法です。

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

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