差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

この方法は、イオンチャネル関連網膜疾患分野における、BEST1変異の分子メカニズムとベストロフィノパチーの病理に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒトからRPE細胞を直接取得することの難しさを回避できることです。この技術の意味は、RPE細胞を研究目的と細胞補充療法の両方に使用できるため、ベスト疾患を含むベストロフィノパチーの治療にまで及びます。

hPSC培養物がコンフルエントに達したら、培養液を6ウェルプレートのウェルあたり4ミリリットルの分化培地と交換します。2週間の培養後、分化培地にヒトアクチビンAの1ミリリットルあたり100ナノグラムを補充し、補充した培地を週に3回、さらに14日間交換します。29日目に、色素沈着したRPE細胞クラスターが現れるまで、さらに8〜10週間、非補充の分化培地に切り替えます。

色素沈着したRPE細胞を単離するには、まず、個々の9インチガラスパスツールピペットをブンゼンバーナーの炎の上に水平に保持します。ピペットの薄い部分の長さの約3分の2下にあります。加熱されたガラスが柔らかくなったら、2つの端をすばやく引き離して、ピペットの新しい端にマイクロスクレーパーのような先端を形成します。引っ張ったピペットに70%エタノールをスプレーし、細胞培養フードで自然乾燥させます。

ピペットの準備ができたら、分化培養の各ウェルをPBSで洗浄し、コラゲナーゼ1マイクロリットルあたり1単位を補充した0.05%トリプシン1ミリリットルを各ウェルに加えます。摂氏37度で20〜30分後、6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルの摂氏37度RPE培地で消化を停止し、プレートを顕微鏡ステージに置きます。引っ張ったピペットを使用して、色素沈着したRPEクラスターを軽くたたきます。

細胞がウェルの底から分離したらすぐに、20マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、解離した細胞をRPE培地を含む新しい細胞培養プレートの個々のウェルに移します。約5, 000個のRPE細胞を12ウェルプレートの各ウェルに添加したら、新鮮なRPE培地で最終容量を最大2ミリリットルまで持ってきて、単離されたhPSC-RPE細胞をさらに6〜8週間培養し、色素沈着した丸石型の成熟RPE細胞の単層が観察されるまで観察します。パッチクランプの24〜72時間前に、色素沈着した単層細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、PBSを除去した後、1ミリリットルの0.05%トリプシンとコラゲナーゼ1マイクロリットルあたり1単位を12ウェルプレートの各ウェルの細胞に1マイクロリットル加え、摂氏37度で8分間のインキュベーション期間を行います。

細胞が剥離し始めたら、1ミリリットルのマイクロピペットを使用してウェルの底から細胞を優しく洗い、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管にプールします。ウェルに37°Cのトリプシン-コラゲナーゼ溶液を1ミリリットル加えます。摂氏37度でさらに8分間インキュベートし、ウェルの底から残っている細胞を洗浄し、細胞懸濁液を同じ15ミリリットルの円錐管に結合します。

細胞を摂氏37度のドライバスで8分間インキュベートした後、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して細胞を10〜15回穏やかに滴定します。細胞をさらに2回インキュベートおよびトリチュレートした後、5ミリリットルの37°CRPE培地を単一細胞懸濁液に加え、遠心分離により細胞をペレット化します。10〜20%のコンフルエンシーでカバースリップを使用してプレコートプレートに播種するための適切な量でペレットを再懸濁し、標準プロトコルに従って全細胞パッチクランプを実行します。

単離が成功した後、継代ゼロ集団の細胞の90%以上が成熟し、特徴的なRPE細胞形態を示す必要があります。hPSC-RPEベースのDisease-in-a-Dishアプローチにより、各患者特異的なBEST1変異のタンパク質発現、膜輸送、およびイオンチャネル機能を包括的に特徴付けることができ、RPEの病理学的メカニズムを解明するための重要な情報を得ることができます。一部のBEST1変異はそのタンパク質発現に影響を与える可能性があるため、他の確立されたRPEマーカーもチェックする必要があることに注意してください。

ヒト多能性幹細胞RPE細胞の分化は、ヒト多能性幹細胞株や変異の種類にもよりますが、分化したヒト多能性細胞の単離は、適切に行えば2時間で完了します。パッチクランプのために細胞を分割しようとするときは、過剰な細胞死を避けるために細胞を非常に穏やかに回転させることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、3D RPE細胞培養などの他の方法を実行して、RPE細胞の頂端膜および基底膜上のイオン輸送がBEST1変異によってどのように影響を受けるかについての追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、網膜変性疾患の分野の研究者が患者由来のRPE細胞の生理学的表現型と病理学的メカニズムを探求するための道を開きました。このビデオを見れば、多能性幹細胞を網膜色素上皮細胞に分化する方法と、全細胞パッチクランプ用のRPE細胞を準備する方法について十分に理解できるはずです。