Name: 高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ Nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶフラッシュナノ沈殿法による多様なナノキャリアの高速組み立てと生理活性タンパク質・薬物の読み込み技術。化学・工学の専門知識がなくても高度なドラッグデリバリーシステムを独自に製造できる方法です。

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我々 は、スタッフとインストルメンテーション ノースウェスタン大学構造生物学研究棟からのサポートを認めます。相対湿度 Lurie 包括的がんセンターの北西大学、ノースウェスタン大学の構造生物学施設からのサポートが認められています。シカゴ ・ コミュニティ ・ トラストでサール資金からサポートとシカゴ医療コンソーシアムによって提供される資金でカダン K2 直接電子検出器を購入しました。我々 はまた、ノースウェスタン大学で次の設備を感謝: 分析、高度な分子イメージング センター生体イメージング施設構造生物学研究棟ケック学際的表面科学施設バイオナノ テクノロジー機器のコア。この研究は国立科学財団のグラント 1453576、国立保健監督機関の新しいイノベーター賞 1DP2HL132390-01、再生ナノメディシン カタリスト賞 2014 マコーミック カタリスト賞センターによって支えられました。SDA は NIH を経てバイオ テクノロジー訓練助成金 T32GM008449 によって部分的に支えられました。

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<li>Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+block+copolymer+stabilized+nanoparticles%3A+simultaneous+encapsulation+of+organic+actives+and+inorganic+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures.</a> Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Polymersomes ペグ17-bl- 安35を使用しての迅速な製造のための詳細な手順を提供している-SH ジブロック共重合体。小胞 polymersomes は、ペグの親水性および疎水性 PPS ブロック分子量この比率で組み立てられた主な集計形態です。複数回を吹きつけたとき直径と一致された後 200 nm 膜を通して押し出さ polymersomes 分散形成薄膜水和を介して。このプロトコルはこうして径 polymersome ナノキャリアの作製中に押し出しの追加の手順の必要性を排除します。Polymersomes 形成を介してFNP 親水性と疎水性の両方の貨物をロードし、策定プロセス11を介してこれらの分子の生理活性を維持します。追加のプロトコルは、不妊、エンドトキシンしたがって管理生体の安全と同様、生化学的・免疫学的アッセイに最適 polymersome 製剤の形成を許可する必要がある場合を確保するため説明.CIJ の手回しミキサーを設定する簡単なは、使いやすさをユ...

ナノキャリアは、小さな、高分子化合物の貨物の管理された配信などアクティブなエンティティされていない場合、そのカプセル化、高分解性や生体の管理にも疎水性になります。定期的に作製したナノキャリア形態の高分子ベシクル (polymersomes とも呼ばれます) リポソームに似ていますは親水性と疎水性の貨物1,2を同時にロードする機能を提供します。その有望な利点にもかかわらず polymersomes ではまだ珍しい臨床応用により、一部、製造のいくつかの重要課題に。臨床用 polymersome 製剤、無菌、大規模な一貫したバッチで行われる必要があります。
Poly(ethylene glycol)-ブロックなど、ブロック共重合体からフォーム polymersomes にさまざまな技術を使用ことができます-ポリ (プロピレング硫化) (ペグ-bl- PPS)、溶剤分散3、薄膜水分補給1を含む,4マイクロ5,6、および直接水和法7。溶剤分散には、タンパク質のようないくつかの生理活性のペイロードを変性が有機溶剤存在下で長いインキュベーション時間が含まれます。薄膜水分補給は、しばしば受け入れ状単分散を達成するために高価で時間のかかる押出し技術が必要な形成された polymersomes の分散制御を提供していません。さらに、流体と直接水和法は、大量生産のためにスケールしにくい。異なるナノキャリア作製方法のフラッシュ nanoprecipitation (FNP) は大規模かつ再現性のある製剤8,9,10を作成する機能を提供しています。私たちの研究室は最近に一貫性のある多様なペグ -bl- PPS ナノ構造形態11,形成を含める FNP の使用を拡大して FNP 以前ソリッドコア ナノ粒子の形成のために予約中、12、polymersomes11とキュービック ナノスフェア12を含みます。FNP が薄膜水分補給と溶媒分散によって形成される非押し出し polymersomes に比べて優れた分散インデックス値の結果に押し出しを必要とせず polymersomes の単分散製剤を形成できることがわかった11. キュービック ナノスフェア, 彼らの大きな疎水性領域とは FNP12溶媒条件の番号の下の形成にもかかわらず、薄膜水分補給によって形成されることができませんでした。
ここでは、我々 はbl- PPS ジブロック共重合体 polymersome 形成で使用されるペグの合成のための詳細な説明を提供し、FNP、FNP に使用される限られた衝突噴流 (CIJ) ミキサー プロトコル自体、および自動システムの実装ユーザーの可変性を減らします。滅菌システムを十分にエンドトキシン配合体内の使用、および polymersomes FNP によって形成された特性に関する代表的なデータを生成する方法については、含まれています。この情報は、polymersomesの in vitroとin vivoの仕事のための利用に関心を持つ読者は、独自の滅菌は、単分散製剤を作製することになります。ナノキャリア製剤、高分子合成専門知識経験を持つ読者は FNP を使用して、現在の製剤化技術の潜在的な代替として、独自のポリマー システムを迅速にテストすることができます。さらに、ナノテクノロジー研究所コースにナノキャリアの定式化の教育ツールとして記載プロトコルは使用可能性があります。

<table><tbody><tr><td>CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate スターターキット - 32 GB Edition</td><td>CanaKit</td><td>UPC 682710991511</td><td></td></tr><tr><td>リニアベアリングプラットフォーム (小) - 直径 8mm</td><td>Adafruit</td><td>1179</td><td></td></tr><tr><td>リニアモーション 8 mm シャフト、長さ 330 mm クロムメッキ、ケース硬化、メトリック</td><td>VXB</td><td>kit11868</td><td></td></tr><tr><td>リニアレール シャフト ガイド/サポート - 直径 8 mm</td><td>Adafruit</td><td>1182</td><td></td></tr><tr><td>手動位置精密スライド 4.5インチストローク、15ポンドの耐荷重</td><td>McMaster-Carr</td><td>5236A16</td><td></td></tr><tr><td>MTPM-P10-1JK43 アイアンホースDCモーター</td><td>アイアンホース</td><td>MTPM-P10-1JK43</td><td></td></tr><tr><td>公式Raspberry Pi Foundation 7インチタッチスクリーンLCDディスプレイ</td><td>Raspberry Pi</td><td>B0153R2A9I (ASIN)</td><td></td></tr><tr><td>PicoBorg Reverse - Raspberry Pi</td><td>PiBorg</td>の高度なモーター制御 <td>BURN-0011</td><td></td></tr><tr><td>シャープGP2Y0D810Z0Fデジタル距離センサー付きポロルキャリア 10cm</td><td>Pololu</td><td>1134</td><td></td></tr><tr><td>Ruland PSR16-5-4-A 止めねじビームカップリング、ポリッシュアルミニウム、インチ、5/16" ボア A 直径、1/4" ボア B 直径、1" OD、1-1/4" 長さ、44 lb-in 公称トルク</td><td>Ruland</td><td>PSR16-5-4-A</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコールモノメチルエーテル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202495</td><td></td></tr><tr><td>塩化メタンスルホニル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471259</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>Toluene, 無水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (珪藻土)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>320269</tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド、無水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>791776</td><td></td></tr><tr><td>チオ酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805</td><td></td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>Σ Aldrich</td><td>360589</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム酸化物、中性、活性化、ブロックマンI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>199974</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムメトキシド溶液、0.5 M メタノール中</td><td>Sigma Aldrich</td><td>403067</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンサルファイド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P53209</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液 1.0 N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>エンドトキシンフリー水</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>ペーパー pH ストリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-640-508</td><td></td></tr><tr><td>エンドトキシンフリー ダルベッコのPBS</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>TMS-012</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスシンチレーションバイアル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>1 mL全プラスチック製シリンジ</td><td>Thermo Scientific</td><td>S75101</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-6B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL6B200</td><td></td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィーカラム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4169</td><td></td></tr><tr><td>CIJ ミキサー、HDPE</td><td>カスタム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Blue hTLR4</td><td>InvivoGen</td><td>hkb-htlr4</td><td></td></tr><tr><td>RAW-Blue Cells</td><td>InvivoGen</td><td>raw-sp</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>PYROGENT Gel Clot LAL Assays</td><td>Lonza</td><td>N183-125</td><td></td></tr></tbody></table>

高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

ナノ材料は、幅広い治療や画像アプリケーションに単一および結合された分子ペイロードの制御された配信をカスタマイズするためのオプションを提示します。この高められた特定性は、高い効力低下の副作用と低用量を含む、重要な臨床的意義を持つことができます。また、ターゲットにその場で特定の細胞のサブセットの変調、基本的な生命現象のin vitroとin vivoの調査を強化できます、細胞機能をプローブします。ナノスケール科学、化学および多くの場合エンジニア リングに必要な専門知識が製造から彼らの調査のためのツール、またはのための車としてナノ材料をカスタマイズするこれらの分野での経験のない所を禁止する残念なことに、治療戦略。ここでは、合成と安易な形成を受けやすい汎用性の高い非毒性ブロック共重合体システムのスケーラブルなアセンブリおよび医用ナノ車のロード用プロトコルを提供します。フラッシュ nanoprecipitation は poly(ethylene glycol)-blから多様なナノキャリアの迅速な製造のための方法論として提示-ポリ (プロピレング硫化) 共重合体。これらのプロトコルは、幅広い専門知識とリソースを持つ所を簡単にできるように、再現性をもって、アプリケーションの高度なナノキャリア システムを作製します。デザインとフラッシュ nanoprecipitation を容易にする高速シリンジ ポンプを採用している自動機器の建設プロセスし、均一性の制御を強化できるように、サイズ、形態、polymersome ナノキャリアの読み込み、説明します。

ここでは、我々 は、ナノキャリア親水性と疎水性の貨物をロードすることができる生体内でマウスとヒト以外の霊長類管理11,13は安全の定式化のための単純なプロトコルを提案しました。CIJ ミキサーでソリューションの機械的に制御衝突カスタム装置の製作の説明と共に、当社の代表的な結果で使用されるポリマーの合成のための詳しいプロトコルも含めました。図 1ペグ17-bl- 安35を生成する実行された合成手順の概要を示します-SH、ジブロック共重合体自己 polymersome ナノキャリアを組み立てるために使用します。ペグ bl PPS polymersomes 治療および/またはイメージング エージェントでロードを組み立てるため FNP プロトコルの概要は、図 2のトラ...

ナノ材料基礎科学と並進アプリケーション制御治療薬デリバリーの汎用性の高いメカニズムを提供するが、頻繁に彼らの作製最も生物医学研究所で利用されていない専門知識が必要があります。ここでは、スケーラブルな製造およびフラッシュ nanoprecipitation を使用して多様な片岡の治療読み込み用のプロトコルを提案する.

高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ Nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

フラッシュナノ沈殿法を用いて複雑なナノ構造を組み立てることで、化学、工学、ナノ材料科学の経験が豊富でない研究者でも、それぞれの用途やニーズに合わせて高度なドラッグデリバリーシステムを独立して作製できると考えています。この技術の主な利点は、高濃度、低多分散性で、低分子薬物やタンパク質などの生理活性分子を無菌条件下で形成した多様なナノ構造を大量に生成できることです。一般に、ポリマー合成に不慣れな人は、ポリプロピレン硫化物成分が空気にさらされることによる酸化に非常に敏感であるため、苦労する可能性があります。この手法の視覚的なデモンストレーションは、複数のインピンジメントステップを連続して非常に迅速に実行する必要があるため、習得が難しいため、非常に重要です。閉じ込められたインピンジメントジェット、またはCIJミキサーを滅菌するには、生物学的安全キャビネット内で作業し、ミキサーをすべての部品をゼロポイント1モルの水酸化ナトリウムに分解して一晩沈めます。CIJミキサーを組み立て直し、ルアーロックシリンジを使用してエンドトキシンを含まない水をミキサーに流し、水のpHをテストし、pHが中性として登録されるまで水を流し続けます。インピンジメント溶液1を調製するには、まず、合成されたポリマー20ミリグラムを1点5ミリリットルのチューブに秤量します。次に、疎水性染料、薬物、またはその他の貨物を追加します。最後に、500マイクロリットルの100%テトラヒドロフランをポリマーと貨物に加え、激しく渦巻いて溶解します。インピンジメント溶液2を調製するには、ポリマー小胞内に装填する親水性貨物を500マイクロリットルの水性緩衝液に溶解します。2.5ミリリットルの任意の水性緩衝液を適切なサイズのリザーバーに加えます。次に、ミキサーからの流出が直接リザーバーに入るように、リザーバーをCIJミキサーの下に置きます。インピンジメント溶液を別々の1ミリリットルのプラスチック製使い捨てシリンジに装填し、CIJミキサーの上部にあるルアーロックアダプターにシリンジを挿入することにより、溶液を互いに衝突させて同時にナノ構造を形成します。1回のスムーズで素早い動きで、両方のシリンジを同時に同じ力で押し下げます。複数のインピンジメントを実行する場合は、valtowerの有機溶媒の損失を減らすために、できるだけ早くインピンジメントを行うことが重要です。複数のインピンジメントを実行するには、初期のナノ構造溶液を2つのシリンジに分割し、このステップをさらに最大4回繰り返します。流出を水性緩衝液で満たされたリザーバーに集め、穏やかに攪拌して混合を確実にします。荷降ろしされた貨物と有機溶剤を除去するには、いくつかのオプションがあります。ナノキャリア製剤は、ここで示すように、物品税排除または脱塩カラム、タンジェンシャルフローろ過システム、真空乾燥、または透析によって除去できます。ナノキャリア製剤を、インピンジメントに使用したのと同じ水性緩衝液およびリザーバーで透析します。適切な分子量カットオフのチューブを少なくとも24時間使用し、少なくとも2回のバッファー交換を行います。荷降ろしされた貨物を有機溶媒から取り出したら、メーカーの指示に従ってスピン濃縮システムを使用してナノキャリア製剤を濃縮します。ナノキャリアは、摂氏4度で数週間から数ヶ月間保存することができます。保存後の使用前に、ナノキャリア製剤を短時間ボルテックスする必要があります。テキストプロトコルに記述されている高速シリンジポンプの作製を行います。自動実行モードを使用するには、メインメニューから「自動実行」を選択します。システムは、モーターがシリンジ排出プラットフォームを精密スライドの先頭に自動的に配置できるようにユーザーに促します。先に進む前に、金属プレートの前後の経路が明確であることを確認してください。CIJミキサーを後部排出キャリッジの長方形の開口部にロードします。次に、前と同じように1ミリリットルのプラスチックシリンジをロードし、シリンジをCIJミキサーのメスルアーコネクタに取り付けます。機器を運転する前に、目的のモーター速度を設定し、テキストプロトコルで説明されているようにシステムがクリアであることを確認してください。反応物をシリンジからCIJミキサーに排出するには、ソフトウェアインターフェースの実行ボタンを押します。代表的な極低温透過型電子顕微鏡写真は、繰り返しのインピンジメント後に、より小さく、より単分散したポリマーソームを示しています。動的光散乱解析により、衝突を繰り返すと、ポリマーソームのサイズ分布が左にシフトすることが確認されました。5回の衝突を繰り返すと、ポリマーソームの平均直径と多分散性は、薄膜の再水和によって形成された押出サンプルの平均直径と多分散性と一致します。フラッシュナノ沈殿は、ポリマソーム中のさまざまな疎水性および親水性の小分子および高分子をロードするために使用できます。この方法は、免疫療法やワクチンがどのように機能するかについての洞察を得ることができますが、ポリマーがどのように自己組織化して複雑なナノ構造になるかの研究にも適用できます。この手順に続いて、動物モデルへの静脈内投与または皮下投与などの他の方法を実行して、どの細胞サブセットがナノ粒子を内在化するか、または異なるナノ構造のクリアランス経路を決定することができます。この技術の意味するところは、心臓病やがんの治療だけでなく、感染症のワクチンの開発にも広がっています。なぜなら、これらのナノキャリアは非常に特異的な免疫細胞に対して複数の薬剤を標的とすることができるためです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。...

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

ここでは、迅速かつ再現性をもって生物学的に促された、生分解性のバスユニットなど抗原提示し、可変サイズ、形状、および T 細胞の拡大前のヴィヴォまたは体内表面蛋白質プレゼンテーションと細胞 (aAPC) を生成するためのプロトコルを提案します。.

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高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。...

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

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ここでは、ポリ(βアミノエステル)ポリマーに基づいてmRNAナノ粒子を製造するための簡単なプロトコルが提示され、カプセル化されたmRNAを変更することによって容易に調整できる。また、ポリマー、ナノ粒子、およびそれらの インビトロ...

mRNAを含んだポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子のワクチン接種目的での合成と特性評価

ナノゲルは、生物製剤の送達のための優れた汎用性の高いナノ粒子プラットフォームです。タンパク質ベースのペイロードをカプセル化できる刺激応答性ポリ(エチレン)グリコールベースの高分子ナノゲルを、水性条件下でのワンステップ架橋コナノ重合戦略を使用して合成しました。これらの新規ナノ粒子の最適な作製と特性評価について、以下で紹介します。...

水性ワンステップ架橋法とコナノ重合法による刺激応答性ナノゲルの合成

2ジェットCIJおよび4ジェットマルチインレットボルテックスミキサー(μMIVM)を含む閉じ込め衝突ジェット(CIJ)ミキサー技術を使用して脂質ナノ粒子(LNP)を合成するための詳細なプロトコルが実証されています。CIJミキサーは、再現性のある乱流マイクロミキシング環境を生成し、単分散LNPを生成します。...

閉じ込めインピンギングジェットミキサーにおける乱流による脂質ナノ粒子の合成

学ぶフラッシュナノ沈殿法による多様なナノキャリアの高速組み立てと生理活性タンパク質・薬物の読み込み技術。化学・工学の専門知識がなくても高度なドラッグデリバリーシステムを独自に製造できる方法です。

高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ Nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み

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