Name: 「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 学ぶマウス卵巣組織培養法による卵胞発生と閉鎖の動的観察技術。制御された培養条件下で卵巣現象をリアルタイムに可視化し、生殖医療研究への応用可能性を示します。

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我々 は博士直次郎南 (京都大学) がOog1pro3.9マウスを提供することをありがちましょう。本研究は、日本学術振興会 (科研費 # JP15H06275) と日東財団によって支えられました。

マウスは、23 ± 1 ° C 12 h 光/12 h 暗いサイクルで環境制御部屋で収容されました。動物のケアのプロトコルおよび実験愛知医科大学動物実験ガイドラインに従って実施し、現職のケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 培地や料理の準備
<ol><li>基本的な文化のメディアの準備、ウシ胎児血清 (FBS、5 %v/v)、FSH を追加 (100 Miu/ml) LH (10 mU/mL) とペニシリン-ストレプトマイシン (ペニシリン、100 U/mL; ストレプトマイシン、100 mg/mL) 最小必須培地 α (MEM-α) とミックスは 50 mL の管に。 注: 合計ボリュームの必要な文化メディア実験の間で変わるが、培養液 1 mL は 3.5 cm ガラス底培養皿だけで十分です。</li>
	<li>3.5 cm ガラス底培養皿に 1 mL 混合培地の因数を注ぐし、料理に場所 30 mm 細胞培養チップを設定します。中古メディアとインキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で料理を温めます。</li>
</ol>2. 卵巣組織の準備
<ol><li>あらかじめ暖かいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (−) と MEM-アルファ 5 %fbs、100 U/mL ペニシリン、インキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で 100 mg/mL ストレプトマイシンを含みます。 注: 約 3 mL 卵巣あたり因数 PBS (−) の使用のための十分な卵巣の解剖中に、MEM アルファの 1 mL 因数 3.5 cm 皿で単一の卵巣の一時的なストレージとして十分です。</li>
	<li>
4 週間の古い女性 ICR の (がん研究所の後の名前) マウスから卵巣を切除し、はさみと実体顕微鏡下で、ピンセットを使用して卵巣を周囲の組織をトリムします。培地の除去の卵巣をぜひご予約ください (手順 2.1 参照) に使用されるまで。
	<ol>
<li>PBS (−) で加温で湿らせたろ紙上に単一の卵巣の場所 (手順 2.1 参照) と実体顕微鏡下のミクロトーム刃を使用して 4 枚にスライス。 注: 4 週齢 ICR マウスの卵巣は、直径約 2 mm です。ピースの数によって異なります卵巣サイズ;ただし、約 500 μ m 厚い個できる適切な卵胞観察 (作品は 500 mm よりも厚く、組織透過性が減少; 個 500 ミリメートルよりも薄いの多くから胞状卵胞が壊れており、失われた)。</li>
		<li>郭清後に、予め温めておいた培 (手順 2.1 参照) 3.5 cm 料理にスライスした卵巣片を配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 卵巣の組織培養
<ol><li>卵巣組織がなる細胞文化挿入時の卵巣組織をスライス培養培地ごとの約 0.5 μ L をドロップ マイクロ ピペットを使用して設定します。</li>
	<li>ピンセットを使用して細胞培養インサート培のドロップに各スライス標本を配置します。</li>
	<li>37 ° C で 5% CO2の卵巣組織を文化します。</li>
	<li>2 日ごとに予め温めておいた培で培養液を置き換えます。 注: 4 週齢 ICR マウスから卵巣部文化の媒体の変更のスケジュールは、図 1に提示されます。<ol>
<li>LH サージを再現するには、100 mU/mL FSH と LH 12 時間ごとの 4 日 (図 1) を含む培地で培養 4 週齢 ICR マウス卵巣を扱います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 顕微鏡培養卵巣の画像
<ol><li>組織が細胞培養チップに付着したとき 1 日目後培養の卵巣の画像を開始し、24 h 間隔時間の点の間の十分な卵胞成長を許可する共焦点または倒立顕微鏡解析を実行します。 注: 共焦点顕微鏡倒立顕微鏡全体培養卵巣内の卵胞を観察するために優れています。</li>
</ol>5. タイムラプス イメージング培養卵巣の
<ol><li>
レーザー強度とイメージング システム (表 1) のための露出時間などを含む、タイムラプス撮影条件を最適化します。
	<ol>
<li>処置および制御グループとして使用のための単一のマウスからペア卵巣片を選択します。レーザーの強度と最高の画像 (表 1) を達成するために露光時間を変えます。</li>
		<li>卵胞エリア 24 時間間隔でコントロールのサンプルの画像とタイムラプス イメージング サンプル (手順 6 を参照) を測定することにより各培養条件下で卵胞の成長を比較します。同時に、各卵巣セット排卵卵子の数をカウントし、最適なタイムラプス イメージング条件を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(表 1) の一定の条件の下でタイムラプス イメージング システムを使用して 30 分間隔で画像をキャプチャします。</li>
</ol>6. 卵胞成長解析
<ol><li>
卵胞発育を分析するには、ImageJ ソフトウェア (http://resbweb.nih.gov/ij/) を使用してキャプチャされたイメージに包領域を測定します。
	<ol>
<li>当初は、ツール ・ バーの「分析」の下で「スケールを設定」をクリックしてイメージ スケールを設定します。それぞれの「知られている距離」と「ピクセルの距離」、空白のフィールドにキャプチャしたイメージとピクセルの対応する番号の側面の長さを入力します。</li>
		<li>「フリーハンド」ツール バーでをクリックし、明るいフィールドから取得されたイメージで卵胞の概要を説明します。</li>
		<li>ツール ・ バーの「分析」の下で「測定」をクリックします。 注: 他の測定データが必要な場合「設定測定」「分析」の下で、ツール ・ バーをクリックし、一覧で該当するボックスをチェックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. トランスジェニック マウスを用いた卵胞発育の解析
<ol><li>生後 0 および 4 (P0、P4) トランスジェニック マウスを含む挿入遺伝子Oog1pro3.9とR26 H2B mCherr、文化に従って手順 1.1 – 3.2、そうでない点を除いて女性スライス、P0、P4 卵巣から卵巣を収集します。</li>
	<li>含む 5% CO2 37 ° C で 2 日ごとインキュベーターで 3.5 cm 料理で新鮮な予め温めておいた培地で培養液を交換してください。 注: P0、P4 の卵巣の培地の LH の濃度は、LH サージは P0、P4 のマウスで発生しないために定数残ることができます。</li>
	<li>培養の P4 卵巣 (表 1) でのみ AcGFP1 肯定的なプライマリ卵胞を可視化する顕微鏡を設定します。 注: のみ原始、プライマリ卵胞 P4 雌マウスの卵巣ではあります。</li>
	<li>培養 P0 Oog1pro3.9の画像をキャプチャ/R26 H2B mCherryトランスジェニック マウス卵巣 30 分間隔で P4 卵巣 (5.2 を参照) に使用される設定を使用しています。</li>
	<li>トレースし、AcGFP1 と H2B mCHerry 信号を使用して卵胞の発育を分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biotechnology+of+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li>
<li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16885529">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li>
<li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19074213">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li>
<li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).</li>
<li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li>
<li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics%3A+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li>
<li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene%2C+Oog1%2C+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686(2013).</li>
<li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre%2C+Zp3cre%2C+and+Msx2Cre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li>
<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

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本研究ではマウス卵巣における卵胞発育を研究するための 2 つの新しい方法を開発しました。最初のメソッドは卵胞発育の解析に続いてスライスした卵巣成熟マウス組織の文化を含み、2 番目には段階では、性腺刺激ホルモンに依存しない初期の卵胞発育を視覚化する時間経過イメージ投射の使用が含まれます。以前は、卵胞開発8,9日白血病の抑制的な要因とプロゲステロンの効果を評価するために現在の卵巣組織培養法を用い, 濃度と卵胞の段階でその効果が異なることを示した.本研究では展示した卵巣組織卵胞動態, このモデルを用いて卵胞形成メカニズムの解析をさらに正当化をスライスしました。
以上 5 週齢のマウスの卵巣には、顕微鏡観察を妨げるコーパス黄体が含まれています。したがって、4 週齢マウス卵巣は卵胞発育と排卵の観察に適しているし、以降後半のプライマリ、セカンダリ、および幽門卵胞は、明視野顕微鏡を用いたを区別してより簡単に。私たちの方法は、成長因子および特異的治療卵巣 (<strong clas...

雌マウス卵巣いくつか千包1、および周期的な排卵発情サイクルごとに約 10 卵母細胞が成熟します。卵胞は、いくつかの発達段階に分類: 原初、プライマリ、セカンダリ、幽門洞、および各卵子を取り巻く顆粒膜細胞層の形態によって、グラーフ卵胞。ほとんどの原始卵胞が休止状態とそれらのいくつかはアクティブし各発情周期2プライマリ卵胞に成長します。二次濾胞ステージ後卵胞発育は主に性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン (FSH) と黄体形成ホルモン (LH) によって調整されます。しかし、原始、プライマリ卵胞発育、性腺刺激ホルモンとは無関係です、これらの段階を支配する制御機構のまま悪い inderstood3,4,5。成長因子およびホルモンのほか、原始、プライマリ卵胞は卵胞6,7間の相互作用によって調整されます。したがって、マウス卵巣組織の卵胞動力学の解析を実行し、卵巣の組織培養8,9,10を使用して関連付けられている規制メカニズムを検討しました。
ここで、2 つの卵巣組織培養モデルのメソッドを紹介します。最初、卵胞の測定により卵胞発育を分析するため、2 番目はトランスジェニック マウスとセカンダリ卵胞期に原始から初期の卵胞発育中規制機構の研究使用されます。小胞の開発の分析、主に使用しました 4 週齢の雌マウスの卵巣卵胞を簡単に表示できるため。定期的な排卵とモデル生体内で卵胞発育を誘導するには、培養条件下でのエストラジ オールの分泌卵胞閉鎖と観測された排卵 LH サージが再現されております。培養の卵巣のイメージが捕獲されたと濾胞領域でトレースの変更によって卵胞の開発プロセスを分析しました。ただし、明視野顕微鏡解析で原始と初期プライマリ卵胞の区別は明確です。したがって、小卵胞を検出、原初、プライマリ、区別する手法を開発したし、の二次卵胞培養を用いた卵巣組織Oogenesin1 (Oog1) pro3 。9 と 0 と 4 日誕生11 R26 H2B mCherryトランスジェニック マウスの卵巣。Oog1式減数分裂、参入後は、卵母細胞の検出と原初から培養卵巣組織11 時間経過画像を用いたプライマリ卵胞への移行が観察、卵胞の発育とともに徐々 に増大 ,12。形態学的方法は、休止状態の原始卵胞13,14,15,16を活性化する要因を検討し使用されている、卵巣の生理学的な卵胞発育が観察することは困難、様々 な要因の影響残る例を紹介。本培養法は、ターゲット要素のリアルタイム解析でこの不足に対処するため設計されました。
本研究で我々 はタイムラプス イメージング法による卵胞の発育を追跡され、卵胞発育のプロセスが特徴します。私たちの手法は、卵巣の生理学を調査するための前例のないツールを提供しています。

<table><tbody><tr><td>ヒト下垂体由来卵胞刺激ホルモン</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>ウマ下垂体由来のルテン化ホルモン</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン溶液</td><td>和光純薬工業</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a、GlutaMax、ヌクレオチドなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>35mmディッシュ 0号カバースリップ ガラス径10mm</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート</td><td>メルクミリポア</td><td>PICM0RG50</td><td>直径:315mm 孔径:0.4mm 素材:親水性PTTE</td></tr><tr><td>3.5cm細胞培養ディッシュ</td><td>グライナーバイオワン</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50ml/トリプルシールキャップ付き遠心チューブ</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>薄型使い捨てブレード 819</td><td>ライカ</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>横河電機株式会社</td><td></td><td>タイムラプスイメージング</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>キーエンス</td><td></td><td>タイムラプスイメージング</td></tr></tbody></table>

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

哺乳類の女性は、各発情周期中に卵母細胞数をほぼ一定を定期的に排卵します。このような規則性と周期性を維持するためには、視床下部-下垂体-性腺軸レベル、卵巣内の卵胞の開発に規制が発生します。アクティブな研究にもかかわらずいくつか手順休眠原始卵胞活性化から排卵して卵胞の各段階で異なる規制の複雑さのため、卵胞の発達メカニズムは明らかありません。卵胞発育のメカニズムと発情サイクルを通して卵胞のダイナミクスを調べるためには、顕微鏡を用いて卵胞の発育を観察するために使用できるマウス卵巣組織培養モデルを開発しました。体系的な卵胞発育、周期的な排卵と卵胞閉鎖すべてで再現できる卵巣培養モデルと培養条件を実験的変調することができます。ここでは、卵胞発育の調節機構とその他卵巣現象における本法の有用性を示す.

図 1は、卵巣の組織培養中にメディアに変更するためのプロトコルを示します。このプログラム、4 週齢 ICR マウス卵巣培養され、共焦点顕微鏡 (図 2) を使用して 24 h 間隔で撮像されます。3 週間、卵巣組織の培養中最も幽門洞およびセカンダリの卵胞が卵胞閉鎖によって退化したし、いくつかあった排卵 (図 2Dおよび表 2)。ImageJ (図 3) を用いた包地域の分析、いくつかの卵胞は、(図 3Bおよび補足の映画 1) 各 LH サージ サイクル中にグループで開発。また、排卵は別培養卵巣で単一のマウスの右と左の卵巣からほぼ同時に発生しまし...

卵巣の組織培養卵胞開発、排卵や卵胞閉鎖のモデルとして使用することができ、卵巣の動的過程の制御機構を示します。

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

この方法は、卵胞の発達、卵胞閉鎖症、および手術に関する卵巣研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、制御された培養条件下で卵巣現象をリアルタイムで観察できることです。4週間齢のInstitute of Cancer Researchマウスから卵巣を培養するために準備するには:はさみとピンセットを使用して、実体顕微鏡で卵巣から周囲の組織を切り取り、洗浄した卵巣を新鮮な培地の皿に入れます。すべての卵巣をトリミングしたら、摂氏37度のPBSで湿らせた濾紙に個々の卵巣を移し、ミクロトームブレードを使用して各卵巣を4つにスライスします。スライスを摂氏37度の培養培地の3.5センチメートルの皿に移し、マイクロピペットを使用して、卵巣組織切片ごとに1つの細胞培養インサートに約0.5マイクロメートルの液滴の培地を追加します。1mmの培地が入った2つ目の3.5cmガラス底の細胞培養皿:ピンセットを使用して、1つの組織標本を各液滴に移し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。皿の上清を2日ごとに新鮮な摂氏37度の培養培地と交換し、卵巣をFSHとLHの1ミリリットルあたり100ミリユニットで4日ごとに12時間処理します。1日の培養後24時間ごとに培養卵巣のイメージングを開始し、イメージングセッション間で十分な卵胞の成長を可能にします。適切な実験条件下で、タイムラプスイメージングシステムを使用して30分間隔で画像をキャプチャします。卵巣卵胞の発達を分析するには:ImageJで画像を開き、分析メニューを開いてスケールの設定を選択します。キャプチャした画像の辺の長さと、既知の距離に対応するピクセル数とピクセル フィールドに距離をそれぞれ入力します。次に、フリーハンドツールを使用して卵胞の輪郭を描き、[測定]をクリックします。3週間の卵巣組織切片培養期間中、ほとんどの胞状および二次卵胞は卵胞閉鎖症によって変性し、一部は排卵します。一部の卵胞は、各LHサージサイクル中にグループで発生します。排卵のタイミングと排卵した卵子の数はマウスの卵巣によって異なりますが、培養卵巣からの排卵は主に各LHサージから48時間以内に発生します。排卵されたすべての卵子が排卵後に最初に極性体を放出するわけではないことに注意してください。原始卵胞と一次卵胞は、出生後4日目のマウス卵巣に同時に存在します。一方、出生後のゼロ日目の卵巣には原始卵胞のみが存在します。ただし、一次卵胞は、実証されているように、培養後の出生後ゼロ日卵巣で30〜40時間後に検出可能になります。原始卵胞と一次卵胞は、顆粒膜細胞のmCherry陽性核によってmCherryトランスジェニック動物から単離された培養卵巣でも区別できます。卵巣スライス培養物における卵胞期の追跡を可能にします。この技術が、生殖技術分野の研究者

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

それらの三次元コンテキストで正常な細胞の培養は、細胞の形質転換および腫瘍形成に必要な初期の事象を研究するための代替メソッドを表します。このメソッドは、卵巣癌の形成の初期イベントを研究するために、通常の卵巣と卵管の細胞を成長させるために使用されます。...

卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

このプロトコルは、新生児マウスと思春期前のマウスからの個々の卵胞から卵巣を使って、マウスの卵巣組織の初代培養/共培養を説明しています。培養技術は、卵巣上の外因性薬剤の効果の研究を可能にする、高度に生理的な方法で開発を支援し、卵胞の間の相互作用の。...

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。...

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

ウシ卵巣皮質のインビトロ培養と卵巣微小環境に対する栄養ステアステップ食の効果が提示される。卵巣皮質片を7日間培養し、ステロイド、サイトカイン、および卵胞ステージを評価した。ステアステップダイエット治療は、培養中の卵胞の進行をもたらすステロイド発生を増加させました.

ウシ卵巣皮質組織培養

ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。...

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

in vitro の配偶子形成を補完する新しい足場を含まないアガロースカビで卵胞を培養する方法について説明します。...

足場のないマウス卵胞培養のためのカスタマイズ可能なアガロースモールドの製造と使用

私たちは、卵巣の間質豊富な部分からマウス卵巣体細胞を単離する方法と、足場を使わない方法でマウス卵巣体細胞オルガノイドを生成する方法を述べます。...

卵巣微小環境の探査:マウス卵巣体細胞の単離、2次元培養、オルガノイド培養の方法

ここでは、海馬の発達における特定の遺伝子の制御メカニズムを調べるためのツールを提供するプロトコルを提示します。子宮外エレクトロポレーションと器官型スライス培養を用いることで、単一細胞における目的遺伝子の発現をアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションし、発生中の遺伝子の運命を追うことができます。...

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。...

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。...

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

学ぶマウス卵巣組織培養法による卵胞発生と閉鎖の動的観察技術。制御された培養条件下で卵巣現象をリアルタイムに可視化し、生殖医療研究への応用可能性を示します。

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

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