Name: 精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶTRPV1の精製と再構成法。EPR・DEER分光法を用いてイオンチャネルの構造変化と動態を解析し、哺乳類感覚受容体の活性化メカニズム解明に貢献する手法を習得できます。

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EPR と鹿のスペクトロ メーターへのアクセスを提供するため博士 h. Mchaourab と博士 t. ローゼンバウム フルレングスのシステイン レス TRPV1 プラスミドを提供するために非常に感謝しております。

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
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哺乳類膜蛋白質の表現そして浄化のための現在の技術は分光学的研究14,15,16,42のための蛋白質の十分な量を取得する可能にしました。ここでは、エクスプレス、浄化、再構成、および TRPV1 の分光学的解析を実行するこれらの技術を適応しています。
プロトコルの重要なステップの間で以下の我々 に TRPV1 のトラブルシューティングを持っているものがあります、他の蛋白質を調整可能性があります。0.5 - 1 mg/mL 洗剤精製タンパク質を生成するテンプレートを生成する DNA シーケンスを変更します。昆虫の細胞培養の 6 リットル以上の成長変異体ごとに必要になるので、タンパク質の 0.5 mg/mL 未満を生成するテンプレートは挑戦しています。蛋白質必要があります集中する、スピン標識効率を高める TCEP なし 2 mg/mL ...

単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) の最近の進歩と哺乳類のイオン チャネルの構造は異常な率で得られています。特に、一過性受容体電位バニロイド 1 (TRPV1) などのポリモーダル イオン チャネルの構造研究を提供しているさらにその活性化機構1,2,3,の理解4,5します。 ただし、膜環境に埋め込まれたイオン チャネルに関する動的な情報はポリモーダル ゲーティングおよび薬剤結合メカニズムを理解する必要です。
電子常磁性共鳴 (EPR) と電子二重共鳴 (鹿) 分光、イオン チャンネル6,7,8,9の最も決定的な機構モデルのいくつかを提供しています。,10,11,12,13。 これらのアプローチは、原核生物の試験に主に制限されていると 3p293光イオン チャネルを細菌の高い洗剤浄化された蛋白質の多量を得られます。昆虫および哺乳類細胞の構造と機能14,15,16の真核生物の膜蛋白質の生産の発展に伴い、それは生化学的を得ることは今分光学的研究のための洗剤浄化された蛋白質の量。
EPR と鹿の信号は、タンパク質の単一システイン残基に付属する paramagneticspin ラベル (SL) (すなわちmethanethiosulfonate) から発生します。スピン ラベル 3 種類の構造情報をレポート: モーション、アクセシビリティ、および距離。この情報は、残基蛋白質の内で埋められるまたは膜または apo と配位子束縛状態13,17,18,19内の水環境にさらされているかどうかを判断できます。(すなわち、クローズド、オープン、リバーシブルのゲート遷移を監視しながら各自のネイティブ環境での動的モデルの導出のための制約のコレクションを提供する EPR と鹿のデータ (ある場合) の高分解能構造の中で、増感と鈍感)。さらに、x 線の結晶学または Cryoem で決定することは困難かもしれない柔軟な地域は、タンパク質20内の場所と同様、二次構造を割り当てるにはこれらの環境のデータ セットを使用して取得でした。脂質 nanodiscs の低温電子顕微鏡構造提供イオンのゲートに関する貴重な情報チャンネル3,21,22,23,24, 25;ただし、分光学的アプローチは、低温電子顕微鏡を使用して確認することは困難かもしれない構造の州 (例えば、温度変化) から動的な情報を提供できます。
EPR と浄化中とスピン標識後システイン残基 (特に哺乳動物チャンネルの豊富な), 低蛋白質収量タンパク質の不安定性を削除するとき、タンパク質の機能の欠如を含む鹿を実装する多くの困難を克服しなければなりません。、と洗剤やリポソームの蛋白質の集合。ここでは、これらの重要な障壁を克服し、哺乳類の感覚受容器の鹿と EPR スペクトル情報を取得するためのプロトコルを設計しています。ここでの目的は分光学的解析の式、浄化、ラベル付け、および機能最小限システイン レス ラット TRPV1 の再構成 (eTRPV1) を構築するための方法論を記述します。この方法は、それらの膜タンパク質のシステイン残基の除去にもかかわらず彼らの機能を維持することまたはシステイン二硫化物結束の形成を含む適切なです。このプロトコルのコレクションは、他の哺乳類のイオン チャンネルの分光分析の合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning サイト指向性突然変異誘発キット</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール (イソプロパノール)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>アルブミンウシ血清 (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>アミロース樹脂</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr>大豆<td>Sigma</td><td>11145</td><td></td>Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系<td>からのアソレクチン</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 吸着剤&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット (3.5'') (卵子吸光)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット (卵子記録)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン (二ナトリウム)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin Reagent</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 1型</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-マルトース一水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM(n-ドセシル-B-D-マルトピラノシド)</td><td>アナトレース</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>高グルコース培地(ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s ミディアム)</td><td>Σ</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てPD-10脱塩カラム</td><td>GEヘルスケア</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus プラスミドDNAミニプレップキット</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCRクリーンアップキット</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー (25 & micro;l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>ガラスフラスコ2800 mL</td>パイ<td>レックスUSA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG(イソプロピル-チオ-B-ガラクトシド)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス、ミラー</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチンヘミス硫酸</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 キット</td><td>アンビオン</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-オキシル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-3-イル) メチルメタネチオスルホン酸</td><td>トロントリサーチケミカルズ株式会社</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーケミカル</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ31985-062</td><td></td></tr>ペ<tr><td>プスタチンA</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr>プル<tr><td>ロン酸F-127(20%)</td><td>PromoKine&nbsp;&nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>密閉毛細管</td><td>VitroCom</td><td>特注</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (昆虫細胞培地)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9細胞(SFM適応)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Polar Lipid Extract</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin Hydrochloride</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP152</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プトン</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>アフリカ産卵母細胞</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cellsア</td><td>ジレントテクノロジーズ株式会社</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>エコノパッククロマトグラフィーカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Expression Vector</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Competent Cells</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal 毛細管シーラント</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI モデル 3130XL 遺伝子分析装置</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシュブランド</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

精製と trpv1 の分光学的解析のための再構成

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

ポリモーダル イオン チャネルは、アロステリック変更に異なる性質の複数の刺激を変換します。これらの動的分子構造を決定し、主不明のまま挑戦しています。アゴニスト結合部位の構造的特徴といくつかのイオン チャネルの活性化機構の単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 放出光の最近の進歩、ステージは、ゲートの動的分析の設定します。分光学的手法を用いたメカニズム。電子常磁性共鳴 (EPR) や電子二重共鳴 (鹿) などの分光学的手法は、大量に精製することができます原イオン チャネルの研究に主に制限されています。機能的で安定した膜タンパク質の大量のための要件は、これらのアプローチを使用して哺乳類のイオン チャネルの研究を妨げています。EPR と鹿は、x 線結晶構造解析または Cryoem によって入手が困難なこと、低解像度でとはいえ構造の決定とモバイル蛋白質領域の動的変更を含むとリバーシブルのゲートの監視、多くの利点を提供します。移行 (すなわち、クローズド、オープン、増感と鈍感)。ここでは、ミリグラムの機能洗剤可溶化過渡受容体潜在的な陽イオン チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) EPR と鹿分光のラベルすることができますを取得するためプロトコルを提供します。

最小限のシステイン レス TRPV1 の構築 (eTRPV1) と単一システインの変異体の機能解析
分光学的研究への第一歩は、エンジニア リングおよび機能、蛋白質の生化学的な量をもたらすシステイン少ないタンパク質構造 (図 2 a) を特徴付けます。eTRPV1 は、Ca2 +イメージングおよび TEVC (図 2 b・ C) が定める機能します。また、eTRPV1 は、EPR と鹿の実験 (0.5 - Sf9 細胞の 1 リットル当たり 1 mg) の洗剤精製タンパク質の十分な量を提供します26。特定のタンパク質の地域で 1 つのシステインを導入の機能は影響しません。図 2 b...

この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン チャネルの構造と機能の研究を容易にするために合わせることが生化学的な生物物理学的ツールを提供します。

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

この研究室では、分光学的アプローチを用いることで、一過性受容体電位イオンチャネルファミリーの重要な疑問に答えることができると考えています。例えば、ポリモーダル活性化に関連する動的な情報変化を決定するなど。このプロトコルの主な利点は、電子常磁性共鳴および二重電子共鳴エピトロスコピーのためのミリグラムの純粋で機能的な残りのイオンチャネルを可能にすることです。この方法は、3B1の熱および光に依存しないゲーティングと互換性のあるコンフォメーション変化についての洞察を提供することができます。また、3B2などの他のトリップチャネルにも適用できます。この手順は、オンラインツールを使用したデザイン突然変異導入プライマーから開始します。テキストプロトコールに記載されているようにPCR反応を調製し、混合物を遠心します。チューブをサーモサイクラーにセットし、テキストプロトコルに記載されているPCRパラメータを使用してPCR変異誘発を行います。次に、2マイクロリットルのDPN1酵素を反応物に加え、混合します。反応を摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、解凍した大腸菌コンピテントセル75マイクロリットルとDPN1処理PCR混合物10マイクロリットルを予冷した14ミリリットルの滅菌チューブに添加して形質転換を行います。穏やかに混合した後、氷上で反応を30分間インキュベートします。チューブを摂氏42度に45秒間保持し、すぐに氷の上に2分間置きます。カルベニシリンを含むLB寒天プレートに混合物をプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。単一のコロニーを回収し、テキストプロトコルに記載されているように一晩で調製した後、Gの8000倍で10分間一晩培養をスピンダウンします。次に、市販のミニ調製キットの指示に従ってDNAを抽出します。組換えバクミドを生成するには、100マイクロリットルのDH10bac E.Coliコンピテントセルを7.5ナノグラムの組換えドナーベクターで形質転換します。ベクターは、機能的な最小システインレスラットTRPV1、略称eTRPV1、および/または単一のシステイン変異体を含む。テキストプロトコールに記載されているように細胞を播種およびインキュベートした後、青色コロニーには目的の挿入がないため、直径2ミリメートルの白色コロニーを選択します。実体顕微鏡を使用して、白いコロニーに青い斑点が含まれていないことを確認します。少なくとも3つの単一コロニーを採取し、それらを4ミリリットルのLB培地を補充した14ミリリットルの滅菌チューブに移します。細胞を摂氏37度、250 RPMで一晩インキュベートします。1.5ミリリットルの一晩培養物を取り、組換えバクミドDNAを単離します。組換えバキュロウイルスを作製するには、2 mmの昆虫細胞培地に100万個のSF9細胞を播種

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は、ATP依存性P2X2受容体の全長のC末端に結合する脳の蛋白質を識別するための単純なプロトコルを記述する。すべてのP2X受容体へのこのアプローチの拡張と体系的なアプリケーションは、P2X受容体シグナル伝達の理解につながることが期待される。...

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

等速電気泳動（ITP）は、毒素の検出からサンプル調製に至るまでのアプリケーションで堅牢な電分離と濃縮技術です。小分子および細胞培養溶解液からの核酸の精製の分離と検出：我々はITPと2具体例のアプリケーションにこのテクニックを適用する方法論の物理的原理を確認します。...

イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。...

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

TRPV4のを研究するためによく使用されるメソッドを補完するために、二つの方法が記載されている：その機械的感受性は、低浸透チャレンジの際に遺伝子組換え酵母中のCa 2 +-エクオリン発光測定により研究することができる。また、オンセルまたは切除されたモードでクランプ全細胞の2電極電圧クランプまたはパッチによりアフリカツメガエル卵母細胞に注入TRPV4-RNAで検査することができる。...

酵母発光測定とアフリカツメガエル卵母細胞電気生理学的検定試験

タンパク質機能の主要なステップ、特に骨格の構造変化とプロトン移動反応は、しばしばマイクロ秒からミリ秒の時間スケールで起こります。これらの動的プロセスは、特に光によって機能が引き起こされるタンパク質について、時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法によって研究することができます。...

感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。...

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

この原稿では、T細胞抗原受容体(TCR)と抗原性ペプチドをロードしたMHC分子との間の結合ダイナミクスを測定するための(単一分子)フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイの実施方法について説明します。これらの機能化された平面支持脂質二重層と接触しているT細胞の免疫学的シナプス内で発生します。...

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。...

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

INADタンパク質複合体の組み立て機構に基づいて、このプロトコールでは、内因性 ショウジョウバエ...

内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製

このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。...

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

学ぶTRPV1の精製と再構成法。EPR・DEER分光法を用いてイオンチャネルの構造変化と動態を解析し、哺乳類感覚受容体の活性化メカニズム解明に貢献する手法を習得できます。

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

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