Name: 10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶTET2タンパク質の単段イオン交換クロマトグラフィー精製法とLC-MS/MSを用いた活性解析法。エピジェネティクス研究におけるDNA脱メチル化メカニズムの解明に貢献します。

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米国国防総省のアイデア賞を受賞 (W81XWH-13-1-0174)、再生不良性貧血と MDS の基盤助成金の形で資金が供給されたこの研究と UMRB MM の作者に許可感謝モヒト Jaiswal し Subhradeep バール pDEST14 ベクトル型 TET2 の初期クローニングのため。

1. クローン作成およびタグなし人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの浄化
<ol><li>上記22として部位特異的組換え技術を用いた pDEST14 キャスト先のベクトルに人間型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) を複製します。 注: 以前の研究は最小限の触媒活性ドメイン21,23である C ターミナル型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) ドメインを実証しています。PDONR221 ベクトルを使用して、タグなし TET2 ジオキシゲナーゼ ドメインを表現するためにシャイン ・ ダルガーノとコザック配列は前方のプライマーで PCR (表 1) の間に組み込まれました。</li>
	<li>細菌の変形のため、タグなし人間型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) に化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌の 100 μ L を含む組換え pDEST14 発現ベクターの 1 μ L を追加 BL21 1.7 mL チューブ (DE3) 細胞。30 42 ° C で熱ショックに続いて、少なくとも 15 分間氷の上の混合物を保つ水お風呂で s。<ol>
<li>ヒート ショックの直後に 2 分の最小値のための氷に細胞を保ちます。次に、セルに超最適スープ カタボライト抑制 (S.O.C メディア) の 250 μ L を追加します。シェーカーで 37 ° C で 1 時間の細菌細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>インキュベーション後、ピペッティングにより 1 分破棄 70% 培養上清の 9,000 の x g でチューブを遠心分離によって細胞をスピンダウンし、メディアの経過とともに左にペレットを解消します。</li>
		<li>100 μ g/mL アンピシリンを含むルリヤ (LB) のスープ寒天プレートに細胞懸濁液を広げます。37 ° C で 16 時間プレートを孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 つの隔離されたコロニーを選択し、50 mL のチューブで LB アンピシリン メディアの 10 mL に接種します。シェーカーで 37 ° C でチューブを一晩インキュベートします。この後、100 mL の LB アンピシリン培地に接種するのに文化 50 mL のチューブからの 100 μ L を使用します。180 rpm でシェーカーの 37 ° C でフラスコをインキュベートし、初代培養として使用します。次の日は、接種 15 フラスコ、各 600 mL LB アンピシリン メディアを含んだ初代培養の 6 mL を使用します。今、180 rpm でシェーカーの 37 ° C で 15 フラスコを孵化させなさい。 注: 変換されたクローンを確認するには、孤立したプラスミド DNA と DNA シーケンス情報や制限消化を実行します。</li>
	<li>細菌文化の密度をチェックするには、分光光度計を使用してその外径600を測定します。各フラスコに 1 の M (600 の mL に 0.5 mM の最終的な集中) IPTG の 300 μ L と TET2 タンパク質の発現を誘導する、17 ° C で 16 時間の文化をさらに拡大する文化では、外径6000.8 の密度に達すると、</li>
	<li>16 時間後に、遠心ボトルに細菌培養を転送します。5,250 x g で 45 分間の使用で TET2 酵素を表現する細菌培養型 TET2 浄化細菌のペレットを遠心分離機します。 注: すべての残りのタンパク質精製手順を実行は、氷の上または 4 ° C で</li>
	<li>50 mM MES の 100 mL の細菌のペレットを再懸濁します (2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸) バッファー、pH 6 と 60 s 冷却間隔で電源 20 5 × 30 秒の超音波。</li>
	<li>スピン 5,250 x g で 45 分間でライセート可溶性型 TET2 酵素を含む上清を収集し、0.45 μ m 通過は、FPLC システムにロードする前にフィルター処理します。 注: これらの実験型 TET2 酵素は非常に安定して、細胞にライセートを - フェナントロリンを追加できますプロテアーゼ阻害剤カクテル含む 1 mM benzamidine-塩酸、1 mM phenylmethylsulphonyl フッ化物 (PMSF) と 0.5 mM 1, 10-oを必要な場合TET2 酵素の低下を防ぐ。これらは次の陽イオン交換クロマトグラフィーを妨げる可能性がある抑制剤のカクテルで EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸を使用しないでください。</li>
	<li>FPLC 列に強陽イオン交換樹脂パック 30 mL。10 ベッドの量を 0.3 mL/min FPLC システムを使用して一定の流量での洗浄バッファー (50 mM MES バッファー、pH 6) とコラムを平衡させ。</li>
	<li>明らかにしロード ライセート事前釣合い列、洗浄バッファー内の流れが明確になるまでの ∼10 ベッド ボリュームで洗う。</li>
	<li>溶出型 TET2 0-100 を使用して 15 ベッド ボリュームで溶出バッファー (50 mM MES バッファー、pH 6、1 M 塩化ナトリウム) に洗浄バッファーから % の勾配に続いて 2 ベッド ・ ボリュームの 100% 溶出バッファーで保持します。 注: 細胞ライセート列と共にすべての溶出画分の読み込み前後のサンプル (各 100 μ L) を収集し、10 %sds ページの解決に分析します。</li>
	<li>TET2 蛋白質を含む画分をプール、凍結乾燥、水 10 mL、-80 ° C の店で酵素パレットをディゾルブ</li>
</ol>2. 5mC TET2 ジオキシゲナーゼによって酸化
<ol><li>基板 (25 mer 二本鎖 DNA,表 2) 3 μ g と 3 通すべて脱メチル化反応を行います。<ol>
<li>50 mM HEPES (pH 8.0)、200 μ M FeSO4、2 mM 2OG を含む全反応バッファーの 50 μ L 加えて精製 TET2 酵素の 100 μ g (2-オキソグルタル酸/α-ケトグルタル酸) と 2 mM アスコルビン酸 1 h21の 37 ° C で孵化させなさいと。</li>
		<li>500 ミリメートルの EDTA の 5 μ L 型 TET2 触媒酸化反応を抑制します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>TET2 反応を焼入れ後オリゴ浄化列を使用して型 TET2 反応混合物から DNA を分離することでクロマトグラフィー-タンデム質量分析のためのサンプルを準備します。<ol>
<li>急冷反応の 55 μ L にオリゴ結合バッファーの 100 μ L を追加します。</li>
		<li>この後、100% エタノールの 400 μ L を混合物に追加します。オリゴ バインド] 列この混合物を渡します。</li>
		<li>750 μ L 洗浄バッファーにバインドされた DNA を洗浄し、20 μ L の水に溶出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNase の 2 ユニットと分離された DNA を消化私と 12 h 37 ° C で S1 ヌクレアーゼの 60 単位個々 のヌクレオシド monophosphates を生成します。</li>
	<li>次の消化、サンプルでふくらはぎ小腸アルカリホスファターゼ (CIAP) の 2 台を追加し、またヌクレオシドを取得するヌクレオシド monophosphates からターミナル隣酸塩グループを削除する 37 ° C で 12 時間インキュベートします。</li>
	<li>すべてヌクレオシド、以下 LC ・ MS/MS メソッドを使用して、特に変更されたシトシンを定量化します。</li>
</ol>3. 定量的 LC MS/MS による分析法の開発
<ol><li>すべての変更されたシトシン ヌクレオシド [5-メチル-2-デオキシシチジン (5mdC)、5-ヒドロキシメチル-2 '-デオキシシチジン (5hmdC)、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン (5fdC)、および 5-カルボキシメチル-2 '-デオキシシチジン (5cadC)] の 100 μ M 原液を準備し、正常な DNA 塩基 (アデニン、チミン、シトシン、グアニン ・ LC ・ MS/MS 法の開発のための HPLC 級水で。</li>
	<li>1 つずつ原液を注入してヌクレオシドに依存する MS/MS パラメーターを最適化し、EMS で 10 μ L/分の流量で質量分析計のスキャン モード。次のパラメーターを最適化: 定量の最適化を自動化された各 DNA ヌクレオシドを用いた衝突セル出口潜在的な (CXP)、衝突エネルギー (CE) 衝突携帯入り口潜在的な (CEP) (EP) 入り口潜在的なポテンシャル (DP) ・ デクラスタ リングソフトウェアの特徴です。</li>
	<li>グラデーションを用いた溶媒は 10 mM 酢酸アンモニウム (pH 4.0)、溶剤 B が 20% アセトニ トリルと 10 mM 酢酸アンモニウム (pH 4.0) の 0.3 mL/min の流量で 25% 溶剤 B 原液の 10 μ L 注入してソース依存 MS/MS パラメーターを最適化します。次のパラメーターを最適化: カーテン ガス (CUR): 10-50、温度: 0-600 ° C、ガス流 1 (GS1): 0-50、ガス流 2 ([gs2]): 0-50, 活性化解離 (CAD): 低、中、高、イオン スプレー電圧 (IS): マニュアルを使用して各 DNA ヌクレオシドの 4000 5500FIA (流れ分析) モードでソフトウェアの定量的な最適化機能。</li>
	<li>すべて 8 DNA 核酸を分離する実行次のグラデーションを用いた液体クロマトグラフィー: 0% 溶剤 B (0-2 分)、0 20% 溶剤 B (2-5 分)、20-60% 溶剤 B (5-9 分)、60-0% 溶剤 B (9 ~ 10 分)、溶媒 0.3 の流量で 5 分間の平衡とC18 カラム mL/分 (粒径: 5 μ m、細孔のサイズ: 120 Å)。</li>
	<li>応答の直線性、検出 (LOD) の制限と定量化 (LLOQ) を使用しての下限を決定するパラメーターを使用して、最適な MS/MS (ステップ) 上記の液体クロマトグラフィー グラデーション (ステップ 3.4) と相まって、すべての 8 つのヌクレオシドを含む 100 μ M 標準混合物のシリアル希薄を 2 倍。すべて 8 DNA ヌクレオシドの標準曲線を描画します。</li>
	<li>検出し、すべてヌクレオシド、特に変更されたシトシンステップ 2.4 LC MS/MS 法と標準曲線を使用して生産を定量化します。</li>
</ol>

<ol><li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+landscapes%3A+provocative+insights+from+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li>
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<li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li>
<li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-Eleven-Translocation+2+%28TET2%29+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li>
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</ol>

著者は宣言する金銭的な利益があります。

TET2 遺伝子の変異は、多様な造血器悪性腫瘍患者で最も頻繁に検出された遺伝子の変化の一部です。異なる型 TET2 の変異があり、ナンセンス、フレーム シフト、ミスセンス変異が含まれ、数百日に患者12で識別されています。TET2遺伝子変異を有する患者は、wt 型 TET214とのそれらと比較して骨髄でゲノム 5hmC の低レベルを示します。変異型 TET2ノックアウトの実験が transfected セル145hmC 濃度に対するこれらの突然変異の効果を締めくくっています。TET2 ノックアウト マウス モデルから型 TET2 酵素のレベルが造血器腫瘍17,18,19,20の進行に反比例することを示した。一...

CpG のジヌクレオチドのシトシン塩基の C5 の位置は、哺乳類のゲノムの1で優勢なメチル化サイト (5mCpG) です。さらに、多くの最近の研究は広範な C5 シトシンのメチル化 (5mC) 非 CpG サイトを発見した (5mCpH、ところ H = A、T、または C)2,3。5mC 変更は、内在性レトロトランスポゾン遺伝子プロモーター3,4,5で転写サイレンサーとして機能します。5mC のメチル化は、X 染色体不活性化、遺伝子刷り込みや核リプログラミング ティッシュ特定の遺伝子表現5,6,7で重要な役割を果たしています。C5 の位置にシトシンのメチル化は、DNA メチル化酵素により行われ、これらの酵素の突然変異を引き起こす重要な発達の欠陥8。5mC マークの除去は、TET1 3 5mC オキシダーゼ9,10によって開始されます。これらのテト家族 dioxygenases 連続酸化ステップ11,12,13によって 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC に変換します。最後に、チミン DNA グリコシラーゼは 5 fC または未変更のシトシン塩基除去修復経路11を使用する 5caC を置き換えます。
人間型 TET2遺伝子は骨髄異形成症候群 (MDS)14,15,16、MDS 骨髄増殖性腫瘍 (を含む多様な造血器腫瘍における頻繁変異遺伝子として同定されました。MDS-MPN)、およびデータシートとデータシート MPN16由来急性骨髄性白血病 (AML)。5hmC 骨髄 DNA 修飾のレベルは TET2 の突然変異で野生型 (wt) と比較した患者の下に-TET214。グループの数は、その正常造血と骨髄性変換17,18,19,20における役割を明らかにする TET2 ノックアウト マウス モデルを開発しています。TET2 遺伝子に変異を持つマウスが最初通常で実行可能な明らかに多様な造血器腫瘍、高齢、早期死亡の原因が。これらの研究は、正常な造血分化に wt 型 TET2 演じる重要な役割を示した。これらマウス モデル、(TET2± HSCs) ヘテロ接合体の造血幹細胞およびホモ型 TET2-/-の HSCs が両方 TET2+/-として造血系統の再作成でホモ wt TET2 HSCs 上の優位性TET2-/- HSCs は多様な造血器腫瘍17,18を開発しました。これらの研究は、そのハプロ TET2 ジオキシゲナーゼ HSCs の開発を変更し、造血器腫瘍における結果を示しています。
TET2 遺伝子の変異を持つマウスと同様に、ほとんどの白血病患者マニフェスト型 TET2 ジオキシゲナーゼ活性のハプロ。これらの主にヘテロ接合体の体細胞突然変異は、ナンセンス、フレーム シフト突然変異のほとんどがミスセンス突然変異型 TET2 遺伝子体全体に分散ジオキシゲナーゼ ドメイン12でクラスター化します。日には、少し評価 wt と変異 TET2 は TET2 ジオキシゲナーゼとその分析21の生産の難しさによる主に文学で報告されます。ここで、単純なシングル ステップ精製イオン交換クロマトグラフィーを用いたネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼを報告します。さらに、定量的なクロマトグラフィー-タンデム質量分析は最適化され、ネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼの酵素活性を測定するために使用されました。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>カルボシンス</td><td>鉄FH31182</td><td></td></tr><tr><td>(II)硫酸塩七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>&α;-ケトグルタル酸(2-オキソグルタル酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr>エ<tr><td>チレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード水</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ・クリーン・コンセントレーター</td><td>ザイモ・リサーチ</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 ヌクレアーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP(子牛腸内アルカリホスファターゼ)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td><td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>Nadium chloride</td><td>Fisher科学</td>的な<td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>のグリセロール</td><td>ΣAldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SPのセファロー</td><td>ス フィッシャー科学的な</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシ-5-メチルシチジン</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシ-5-ヒドロキシメチアルシチジン</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシシチジン-5-カルボン酸、ナトリウム塩</td><td>ベリーアンプ;アソシエイツ</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-ホルミル-2'-デオキシシチジン</td><td>ベリー &アソシエイツPY</td><td>7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシシチジン</td><td>ベリー&アソシエイツ</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシアデノシン</td><td>カルボシンス</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシグアノシン</td><td>カルボシンス</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-デオキシチミジン</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>ゲートウェイ技術</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン アレグラ X-15R 遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>ソニック・ディメンブレーター550</td>、<td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA FPLCシステム</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 4.5凍結乾燥システム</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Zymo Oligo精製カラム&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 カラム</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Q-Trap 質量分析計</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>島津製作所HPLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK16/20 FPLCカラム</td><td>ファルマシア(GEヘルスケア)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの lc ms/ms による分析法の開発や効率的に精製

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

5-メチルシトシン (5mC) を介したエピジェネティックな発現制御は、真核生物の開発で重要な役割を果たしてきました。10-11 転流 dioxygenases (TET1-3)、チミン DNA グリコシラーゼ依存塩基除去修復に続いて連続酸化これらのエピゲノムの脱メチル化を実現します。TET2 遺伝子遺伝子の突然変異によりまたは他のエピジェネティックなメカニズムの不活化は多様な癌、特に造血器腫瘍患者の予後に関連付けられます。ここでは、酵素によって実行中の陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたタグなしの人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの効率的な単一ステップ浄化について述べる。さらに別のおよび 4 つの変更されたシトシン塩基 (5-メチル 5-ヒドロキシメチル、5-ホルミルと 5 カルボキシル基) だけでなく、通常の 4 つの DNA 塩基 (A、T、G および C) を定量化できる液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (MS/LCMS) アプローチをいたします。この試金は、野生型と変異型 TET2 dioxygenases の活性を評価する使用できます。

テト家族 dioxygenases による DNA の 5mC の動的な変更は、エピジェネティックな転写で重要な役割を果たしています。TET2 ジオキシゲナーゼ頻繁様々 な造血器腫瘍12で変異します。正常な発達と病気 TET2 酵素の役割を調べるためには、pDEST14 ベクトル22に任意の親和性タグなしその最小限の触媒活性ドメインをクローンします。タグの付いていない型 TET2 ジオキシゲナーゼは細菌の SDS-PAGE 解析による全可溶性タンパクの ∼5% で生産されたエシェリヒア属大腸菌BL21 (DE3) 細胞。TET2 の触媒ドメインはほとんどの先住民族大腸菌タンパク質24,25,26, 陽イオンを利用した効率的な精製プロセスと比較して比較的高い等...

ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析 (クロマトグラフィー-タンデム質量)-ベースのアプローチ。

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

この方法は、正常および臨床的なTET2突然変異の活性の分析のようなエピジェネティクスおよびTET2媒介した5-メチルシトシン脱メチル化分野における主要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ネイティブTET2を一段階で精製することができ、その活性は、すべての3つの製品の形成の観点から分析することができるということです。数人の大学院生がこの手続きをデモンストレーションします。タンパク質の精製は、チャヤン・バタタリヤ、アニンダ・サンデー・デイによるTET2アッセイ、ナビッド・アヨンによるLC-MS/MS分析によって行われます。細菌変換のために、1.7ミリリットルチューブ内の化学的に有能な大腸菌BL21 DE3細胞の100マイクロリットルにタグなしヒトTET2ジオキシゲナーゼを含む組換えpDEST 14終点発現ベクターを1マイクロリットル加えます。氷上で少なくとも15分間インキュベーションした後、水浴で30秒間摂氏42度で熱ショックを受ける。ヒートショックの直後に、細胞を氷の上に2分間置きます。これに続いて、細胞にカタボライト抑制と超最適なスープの250マイクロリットルを追加します。シェーカーで37°Cで1時間細菌細胞をインキュベートします。インキュベーション後、チューブを9,000倍の重力で1分間遠心して細胞を回転させます。ピペット処理により上清の70%を廃棄し、残りの培地にペレットを溶解する。1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含むリルアスープ寒天プレート上に細胞懸濁液を広げます。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。1つの孤立したコロニーを選択し、LBアンピシリン培地の10ミリリットルにそれを接種する。一晩シェーカーで摂氏37度でチューブをインキュベートします。これに続いて、100マイクロリットルの細菌培養液を使用して、100ミリリットルのLBアンピシリン培地を一次培養物として接種する。一晩シェーカーで摂氏37度でチューブをインキュベートします。翌日、15個のフラスコを接種し、それぞれ600ミリリットルのLBアンピシリン培地を含み、フラスコ当たり6ミリリットルの一次培養液を含有する。180 RPMのシェーカーで37°Cでフラスコをインキュベートします。細菌培養の密度を確認するには、分光光度計を使用して、600ナノメートル(OD600)で光学密度を測定します。培養がOD600で0.8の密度に達した後、各フラスコに1モルIPTGの300マイクロリットルでTET2タンパク質の発現を誘導し、さらに17°Cで培養を16時間培養する。インキュベーションに続いて、細菌培養物を遠心分離機ボトルに移す。遠心分離機は、TET2酵素を5で発現する細菌培養物を、45分間重力の250倍にする。TET2精製用の細菌ペレットを使用してください。氷または摂氏4度で作業し、細菌ペレットを50ミリモルMESバッファーの100ミリリットル、pH 6に再懸濁させる。その後、細胞懸濁液を5ミリリットル服用し、バッファーで45ミリリットルにします。サスペンションをパワー20で30秒間5回、60秒の冷却間隔で超音波処理します。5、250倍の重力で45分間回転させます。可溶性TET2酵素を含む上清を収集し、FPLCシステムにロードする前に0.45ミクロンフィルターを通過させます。30ミリリットルの強いカチネーション交換樹脂をFPLCカラムに詰めます。FPLCシステムを使用して、1分間0.3ミリリットルの一定の流量で10床の洗浄バッファーでカラムを平衡化します。明確化したライセートを事前平衡カラムに積み込み、フロースルーが明らかになるまで約10床の洗浄バッファで洗浄します。15床の容積の洗浄緩衝液から溶出バッファーへのゼロから10%の勾配を使用してElute TET2、2つのベッド容積のための10%溶出緩衝液での保持が続く。カラムローディング前後の細胞溶解物の100マイクロリットルサンプルを、すべての溶出画分と共に収集し、10%解決SDS-PAGEゲルで分析します。TET2タンパク質を含む分画をプールし、タンパク質を凍結乾燥させる。その後、10ミリリットルの水に酵素を溶解し、マイナス80度で保存します。3マイクログラムの基質を用いて三重化中のすべての脱メチル化反応を行います。精製されたTET2酵素の100マイクログラムを総反応バッファーの50マイクロリットルに加えます。37度で1時間のインキュベーションの後、500ミリモルEDTAの5マイクロリットルでTET2触媒酸化反応をクエンチ。分析用のサンプルを調製するために、最初に55マイクロリットルのクエンチ反応にオリゴ結合バッファーの100マイクロリットルを加えることによってTET2反応混合物からDNAを分離する。これに続いて、混合物に100%エタノールの400マイクロリットルを加える。この混合物をオリゴ結合列に通します。結合したDNAを750マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄した後、20マイクロリットルの水でDNAを溶出させる。今度は、DNase Iの2単位と摂氏37度のS1ヌクレアーゼの60単位で単離されたDNAを12時間消化し、個々のヌクレオシド一リン酸を生成する。消化後、サンプルに2単位の子牛腸管アルカリホスファターゼを加える。37°Cで12時間加えて、ヌクレオシド一リン酸から末端リン酸基を除去し、ヌクレオシドを得る。LC-MS/MS法の開発のために、すべての修飾シトシンヌクレオシドの100マイクロモルストック溶液と、HPLCグレードの水中の正常なDNA塩基を調製します。拡張 MS スキャン モードで 1 分間に 10 マイクロリットルの流量で質量分析計にストックソリューションを 1 つずつ注入することにより、ヌクレオシド依存 MS/MS パラメータを最適化します。いくつかのパラメータは、各DNAヌクレオシドのソフトウェアの自動定量最適化機能を使用して最適化することができます。この時点で、フローインジェクション解析モードのソフトウェアの手動定量的最適化機能を使用して、DNAヌクレオシドごとに残りのパラメータを最適化します。現在では、1分間に0.3ミリリットルの流量で25%の溶媒Bの勾配を使用して10マイクロリットルのストック溶液を注入することで、ソース依存MS/MSパラメータを最適化します。8つのDNAヌクレオシドをすべて分離するには、C18カラムのテキストプロトコルに詳述されているように液体クロマトグラフィーを実行します。最後に、LC-MS/MS法を標準曲線で使用して、全てのヌクレオシドを検出し、定量化します。TET2の触媒ドメインは、ほとんどの先住民族の大腸菌タンパク質と比較して比較的高い等電点を有するため、カチオン交換クロマトグラフィーを利用した効率的な精製プロセスが開発された。この精製は、単一のステップで90%以上の純粋なTET2酵素を生み出した。異なるデオキシシチジン誘導体とTET2酵素反応に続く4つの天然DNA塩基を分離および定量化するために、感度の高いLC-MS/MSベースのアッセイを最適化しました。標準曲線は、全てのヌクレオシドを含む混合物の連続希釈を用いて描かれた。液体クロマトグラフィー MS/MS 法の結果を以下に示します。この方法は、4つの正常DNA塩基と、4つの修飾されたシトシン塩基の分離および定量化を可能にする。本実験手順では、部位特異的組換え技術を用いたタグなしヒトTET2ジオキシナーゼ触媒ドメインのクローニングと、大腸菌における標的ベクターにおける十分な発現について説明する。カチ換算クロマトグラフィーを利用したタグなしTET2酵素を効率よく精製し、1回の工程で90%以上の純度を得た。また、4つの正常DNA塩基と4つの修飾シトシン塩基を分離する新規液体クロマトグラフィー法を開発しました。TET2触媒反応から8つのヌクレオシドを定量化するために、改善された液体クロマトグラフィー法とタンデム質量分析法を組み合わせた。その後、感受性LC-MS/MSアッセイを利用して、組み換え非タグ化ヒトTET2酵素の活性を決定した。ここで説明するアプローチは、野生型および変異型TET2ジオキシゲナーゼの評価を大幅に高める。

efficient-purification-lc-msms-based-assay-development-for-ten-eleven

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

学ぶTET2タンパク質の単段イオン交換クロマトグラフィー精製法とLC-MS/MSを用いた活性解析法。エピジェネティクス研究におけるDNA脱メチル化メカニズムの解明に貢献します。

10-11 転流 2 5-メチルシトシンジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

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