Name: 蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶバッチ処理酵母2ハイブリッドスクリーンによる複数ベイトタンパク質の相互作用プロファイル比較法。pTEF-GBDプラスミドと深層シーケンスを用いて、タンパク質間相互作用ネットワークを包括的に解析し、疾患関連の差次的相互作用体を同定する。

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NGS ライブラリの準備およびシーケンスのための人間遺伝学研究所内スタッフに感謝いたします。ここで作られた Y2H プラスミド ライブラリのゲノム ライブラリー フラグメントの準備で彼女の専門知識を Einat snir/を感謝いたします。この仕事は健康の国民の協会によって支えられた: NIH R21 EB021870 01A1、NSF 研究プロジェクト助成: 1517110。

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</ol>

著者がある何も開示するには

ここで最適化されたメソッドを使用してバッチで Y2H アッセイを実行する方法のためのガイドを提供します。開始ライブラリの代表を選択下に置かれると酵母の人口には変動を制限するための選択を受けること開始の酵母集団の十分なされているかを確認する手順をいくつかの重要なステップがあります。.重要なは、これらのベンチマークは、比較的適応方法やこのアプローチになり、ほとんどの実験室標準的な分子生物学のための装備にアクセスできる伝統的な Y2H アッセイの材料と一緒に実現しやすい。Deepn 深さが異なる餌プラスミドを使用しながら同じ獲物ライブラリ人口から選択が可能します。したがって、対別のもの 1 つの餌と Y2H の相互作用を生成する相互作用の候補の集合を直接比較できます。ディープ シーケンスを使用するため、各餌固有酵母集団の開始のライブラリ構成を確認してください、ライブラリにある各候補の獲物遺伝子の濃縮を個別に従ってくださいできます。バッチ処理では、統計的ランキング4を計算することができます、半定量的な方法で異なる餌に対して同じライブラリを照会することができます。
<p class="jov...

細胞生物学的プロセスの完全な理解は、その分子機構の根底にある蛋白質相互作用ネットワークの検索に依存します。蛋白質の相互作用を識別する 1 つの方法は興味の蛋白質の 2 つの領域は互いにバインド1一度機能しているキメラ転写因子を組み立てることによって動作する酵母 2 ハイブリッド (Y2H) 試金。Y2H の典型的なスクリーンがプラスミド転写活性化因子に融合相互作用の蛋白質の両方図書館を収容する酵母の人口を作成することによって実行されます (例えば.、'捕食' 融合タンパク質) とタンパク質から成る特定の '餌' プラスミド興味の DNA 結合ドメイン (例えば、Gal4 上流活性化シーケンスにバインド Gal4 DNA 結合ドメイン) に溶けます。Y2H アプローチの主な利点の 1 つは、比較的簡単だし、ルーチンワーク分子生物2の典型的な研究室で実施する安価な装備です。しかし、伝統的に実行されると、ユーザーは正の Y2H 相互作用の選択により発生する個々 のコロニーをサンプリングします。これは、調査することができますライブラリ '捕食' クローンの数を厳しく制限されます。この問題は、特定の相互作用する獲物の豊富さが非常に高い他、低豊富な獲物プラスミドからの相互作用を検出する機会を減少と関連した合成されます。
プロテオームの包括的なカバレッジの Y2H 原理を使用して 1 つのソリューションは、知られている個々 の獲物プラスミドを含む配列を前記デジタルに尋問できるマトリックス形式のアプローチの使用です。ただし、このようなアプローチは蛋白質またはドメイン3の少数のインタラクトームを定義する際に興味を持っている個々 の捜査官に容易にアクセスや費用対効果のないインフラストラクチャが必要です。さらに、複数のフラグメントの相互作用の蛋白質を符号化するかもしれない非常に複雑な獲物ライブラリは、非現実的なサイズにこのような行列の配列のサイズを拡大します。代わりに、バッチで複雑なライブラリとアッセイを行い、大規模な並列高スループット シーケンス4を使用して相互作用するクローンの存在を評価します。これはアッセイの典型的なを使用して複数のコロニーで発生する獲物プラスミドの存在に適用できる Y2H 形式アプローチする酵母の細胞融合蛋白質の相互作用のペアを住宅プレート5,6に成長すること。この一般的な考えは、両方の複数の餌のクエリを増やすし、同じ時間7,8のコンポーネントを獲物に強調することができます。
それでも、多くの調査は簡単にまだ努力に注力ほんのタンパク質 '餌' を必要とし、単一の複雑な獲物ライブラリの包括的な半定量的なクエリによって恩恵を受けることができます。我々 は開発し、バッチ形式4で Y2H 原理を用いた大規模タンパク質相互作用研究を実行するアプローチを検証します。Y2H 相互作用9の相対的な強さのためのプロキシとして特定の獲物プラスミドの膨張率を使用します。集団内のすべてのプラスミドのディープ シーケンスが正常な成長を受けるまたは選択成長条件は、強くて弱い Y2H 相互作用を得られるクローンの完全なマップを生成します。インターアクターのレパートリーを入手し、直接複数の餌プラスミド間で比較することができます。Deepn 深さ (評価のタンパク質ネットワークの動的な濃縮) と呼ばれる作成されたワークフローは、対別のもの 1 つのタンパク質の比較を許可する蛋白質を識別する同じ獲物ライブラリから差分 interactomes を識別するためにこのように使用できます。
Deepn 深さを示すここでは、図 1に記載されている、その使用を容易にする実験室方法の改善を紹介。大幅な改善が含まれます。
獲物酵母集団の生成します。プラスミド獲物ライブラリの分布が同じ別の餌プラスミドと酵母の集団の生成 deepn 深さの重要な要件の 1 つです。獲物プラスミド ライブラリの同等基準集団が異なる餌の interactomes 間の正確な比較を行うために不可欠です。これは最高のライブラリ プラスミドは既に建物半数体酵母の人口で、その人口に与えられた餌のプラスミドの移動は、二倍体を生成する交配によって達成されるとき達成します。ここでは、我々 は半数体酵母の市販のライブラリを使用してこのような集団を作る方法で、明確な指針を提供します。我々 は二倍体数が多いを生成するメソッドを発見したが、これら商用ライブラリを含む酵母菌の全体的な交尾効率が低かった。したがって、交配反応あたりはるかに多くの切片が得られます獲物ライブラリを収容できる新しいひずみを構築しました。
新しい餌プラスミドの設定をします。エクスプレス '餌' 融合蛋白質で構成される興味の DNA 結合ドメインとタンパク質の多くの現在のプラスミドは、2 μ ベース、コピー数を増幅させることです。このコピーの数は、人口の非常に変数をでき、Y2H 転写応答の可変性に 。これは、ターンでは選択範囲の下のセルの成長の応答に基づいて特定の蛋白質の相互作用の強さを測定する能力が偏る可能性があります。これは、部分的アドレスのいくつかは以前市販 pDEST3210など記載されている低コピー プラスミドを用いた。上流の餌フラグメントの両方のクローンを作成ことができます Kanr 耐性遺伝子を運ぶTRP1セントロメア ベース低コピー プラスミド内 Gal4 DNA 結合ドメイン融合蛋白質を作り出す新しい餌プラスミド (pTEF GBD) を構築したとGal4 DNA 結合ドメインの下流。
新しい高密度 Y2H フラグメント ライブラリ。家 Y2H 獲物ライブラリに新しいプラスミドを構築し、ゲノム DNA の断片をランダムにせん断の酵母から作られた非常に複雑な Y2H ライブラリをビルドするために使用します。シーケンス解析は、このライブラリが前述の酵母ゲノム Y2H プラスミド ライブラリ11よりも遠く複雑以上 100 万の異なる要素を持っていたことを示した。この新しいライブラリ DEEPN ワークフローが堅牢な信頼性が高く、再現性のある方法で多くの異なるプラスミドを持つ複雑なライブラリに対応することを示すことができました。

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>ディープシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>モノクローナル抗HA抗体</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>pGal4ADコンストラクトにおけるHAの発現を検出するための一次抗体</td></tr><tr><td>ポリクローナル抗myc抗体</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>pTEF-GBDコンストラクトにおけるMYCの発現を検出する一次抗体</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 3350、粉末</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>酵母形質転換のためのキャリアDNA セクション3.2.1。</td></tr><tr><td>カナマイシン一硫酸</td>塩<td>研究製品国際</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LEアガロー</td>ス<td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>DNAアガロースゲルの製造に使用される</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>研究製品国際</td><td>S23025</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プトン</td><td>研究製品国際</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>研究製品国際</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム二水和物</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ナトリウム塩</td><td>研究製品 国際</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出粉末</td><td>研究製品 国際</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>酵母窒素塩基 (硫酸アンモニウム) w / o アミノ酸</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-HIS+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>アデニン</td><td>研究製品国際</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>研究製品国際</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td>セクション1のメディアプレートを作るために使用</td></tr><tr><td></td><td></td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ-1,2,4トリアゾール</td><td>シグマ</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>研究製品 International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>ギブソンアセンブリクローニングキット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E5510S</td><td>セクション2のプラスミドのクローニングのための迅速なアセンブリ法</td></tr><tr><td>NEBNext ハイフィデリティ 2x PCRマスターミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0541S</td><td>セクション2.3のギブソンアセンブリのための製品の増幅、およびセクション6.2.1のDEEPNディープシーケンシングのサンプル調製に使用されます</td></tr> 臭<tr><td>化エチジウム</td><td>アムレスコ</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>セクション6.2.3のPCR産物の精製に使用</td></tr><tr><td>Qiaquick DNAゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>セクション2.1の消化されたpTEF-GBDの精製に使用</td></tr><tr><td>KAPA Hyper Prepキット</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>ディープシーケンシング</td></tr>のための<tr><td>調製キット コドン最適化</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コドン最適化</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>セクション2.2のクローニングに使用されるDNAフラグメント</td></tr><tr><td>ストリング</td>ス <td>セクション2.2のクローニングに使用されるThermfisher</td><td></td><td></td> DNAフラグメント</tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNAミニプレップキット</td><td>EPOCHライフサイエンス</td><td></td><td>セクション2.3のDNA量を調製するために使用されます</td></tr><tr>セクション7の<td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>高性能超音波超音波装置</td></tr><tr><td>オリゴヌセロチド 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>プラスミド構築中のPCR増幅およびシーケンシングに使用される</td><td>統合DNA技術またはサーモフィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌセロチド5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>プラスミド構築中のPCR増幅およびシーケンシングに使用される</td><td>統合DNA技術またはサーモフィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌセロチド5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td><td>プラスミド構築中のPCR増幅およびシーケンシングに使用される</td><td>統合DNA技術またはサーモフィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌセロチド5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>プラスミド構築中のPCR増幅およびシーケンシングに使用される</td><td>統合DNA技術またはサーモフィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>pGAL4AD</td>オリゴヌセロチド5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'のインサート増幅に使用される<td>統合DNA技術またはサーモフィッシャー5'Pimer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>pGAL4AD</td>オリゴヌセロチド5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'のインサート増幅に使用される<td>統合DNAテクノロジーまたはサーモフィッシャー3</td><td></td>' Pimer</tr><tr><td></td><td>pGADT7</td>オリゴヌセロチド 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3' の挿入増幅に使用される<td>統合 DNA 技術または Thermofisher</td><td></td> 5' Pimer</tr><tr><td></td>James P、Halladay J、Craig EA http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P、Halladay J、Craig EA の <td>pGADT7</td>PJ69-4A MatA 酵母株の挿入増幅に使用される<td>統合 DNA 技術または Thermofisher</td><td></td> 3' Pimer</tr><tr><td></td><td>: ゲノムライブラリおよび酵母の高効率 2 ハイブリッド選択用に設計された宿主株。遺伝学 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression plusid</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-activation domain expression plusid</td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Kord-Vallmark sold by VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 mL PYREX 三角フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX Erlenmeyer フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX 三角フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 mL PYREX 三角フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm ディスポーザブル培養チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペット</td><td>デンビル</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>デンビル</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清ピペット</td><td>デンビル</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL パイレックス グリフィンビーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL パイレックスReuasable Media Storage Bottle</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL メスシリンダー</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>細胞の光学密度を測定するために使用される</td><td>分子デバイス</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>DNAの量を定量するために使用される分光光度計</td></tr><tr><td>電子UVエ</td><td>チジウムブロマイドアガロースゲル中のDNAを可視化するために使用される</td>トランスイルミネーターUltra <td>Lum</td><td>MEB 20</td></tr><tr><td>P1000 ギルソン・ピペットマン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 ギルソン・ピペットマン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 ギルソン・ピペットマン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 ギルソン・ピペットマン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィック・サイエンティフィ</td><td>ック・サイ</td>エンティフィック F144802G <td></td></tr><tr><td>1250 &マイクロ;L ローリテンションピペットチップ</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;LLow保持ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L XLローリテンションピペットチップ</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td>デン<td>ビルサイエンティフィック</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mLマイクロ遠心チューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>フルーカアナリティカル</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>木製アプリケーター</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量遠心機 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>微量遠心機</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>卓上遠心分離機</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP linked entire Ab (from donkey)</td><td>GEヘルスケア</td><td>NA934-1ML</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>アマシャム ECL マウス IgG、HRP 結合全 Ab (ヒツジ由来)</td><td>GE ヘルスケア</td><td>NA931-1ML</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学発光基質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>34080</td><td>ECL 検出ソリューション</td></tr><tr><td>アイソテンプインキュベータ</td>ー <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>インキュベータ</td></tr>ー <tr><td>ミューチトロン 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>振とうインキュベーター</td></tr><tr><td>Isotemp デジタル制御ウォーターバス モデル 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>ウォーターバス</td></tr><tr><td>Y187 の Y2H マウス cDNA ライブラリ (パン組織)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>市販の cDNA ライブラリ</td></tr><tr><td>Y187 (マウスの脳) の Y2H マウス cDNA ライブラリ</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>市販の cDNA ライブラリ</td></tr><tr><td>pGADT7 AD ベクター</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>市販のADベクター 多くのcDNAライブラリを収容</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BDベクター</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>市販のDNA-BDベクター</td></tr><tr><td>Biolase DNAポリメラーゼ</td><td>バイオライン</td><td>BIO-21042</td><td>セクション2.4に使用されるDNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>PCRマシン</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 mL PCRチューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

酵母 2 ハイブリッド法によるタンパク質-タンパク質相互作用のためのスクリーニングは、効果的なツールを長年が、その使用は主として相互作用する候補者のライブラリで濃縮され高い高親和性インターアクターの発見に制限されています。伝統的な形式の酵母 2 ハイブリッド試金は低親和性インターアクターを発見可能性があります低金詰りで実施を分析するあまりにも多くの植民地を得ることができます。また、別の餌プラスミドに対して同じライブラリの包括的かつ完全な尋問、なし比較分析を実現できません。これらの問題のいくつかは、アレイ獲物ライブラリを使用して対処できる、コストとインフラストラクチャは、このような画面を操作するために必要なことが禁止できます。代わりに、我々 は同時に過渡の多数を明らかにする酵母 2 ハイブリッド試金を適応しているし、戦略を利用した単一の画面内で静的な蛋白質の相互作用に deepn 深さ (評価のタンパク質ネットワークの動的な濃縮) と呼ばれています。ハイスループット DNA の配列と相互作用のパートナーをエンコード プラスミドの人口の進化に従ってくださいに計算が組み込まれています。ここでは、カスタマイズされた試薬と簡単にかつ低コストで実行する deepn 深さが画面を可能にするプロトコルについて述べる。

Y2H 試金は蛋白質: 蛋白質の相互作用を見つけるため広く使用されているし、いくつかの適応やシステムが開発されています。ほとんどの部分については、これらの従来のアプローチを成功させるに役立つ同じ考慮事項が deepn 深さが重要です。重要なベンチマークのいくつかが含まれます: DNA 結合ドメインの発現融合蛋白質、スプリアスの低バック グラウンド彼 + 空獲物プラスミド、餌の配偶効率と利子の餌を含む切片で成長性の確保を確保します。マタ ライブラリ含有酵母を含む MATalpha は酵母、そして最後に、多くの肯定的な Y2H 反応選択条件下で成長する人口を許可する低逼迫条件もものその農産物の低レベルの His3 活動と弱いY2H 転写応答。
Deepn 深さの重要な側面の一つは、再現性をもって Y2H ライブラリを別の餌のプラスミドを持つ系統に投入し、プラス Y2H の相互作用を作成するこれらのライブラリのプラスミッドのためのそれらの人口を確実に選択です...

酵母 2 ハイブリッド スクリーンのバッチ処理は、獲物の融合蛋白質の非常に複雑なセットを持つ複数の餌の蛋白質の相互作用のプロファイルの直接比較のためことができます。ここでは、我々 は洗練された方法、新しい試薬とこのような画面の使用を実装する方法について説明します。

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

この方法では、両方の集団における酵母2-ハイブリッドシステムの原理を使用して、さまざまな分子および細胞プロセスに関する重要な質問に答えるタンパク質間相互作用を特定します。この手法では、ディープシーケンシングを活用して、あるタンパク質と別のタンパク質の相互作用を確認します。このアプローチは並行して比較するように調整されているため、あるタンパク質と別のタンパク質と相互作用するタンパク質のセット、または同じタンパク質の異なる確認を特定したり、病気の原因となる変異型バージョンをタイピングしながら、異なるインタラクトームを明らかにすることができます。新しい酵母2-ハイブリッドベイトプラスミドpTEF-GBDは、テキストプロトコルに記載されているように、この手順のために構築されました。このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を保有するTRP1セントロメアベースの低コピープラスミド内でGal4 DNA結合ドメイン融合タンパク質を産生し、Gal4 DNA結合ドメインの上流と下流の両方でベイトフラグメントのクローニングも可能にします。このベイトプラスミドを用いてMATa酵母を形質転換し、抗MIC抗体を用いたイムノブロッティングによりGal4ベイト融合タンパク質の発現を検証しました。さらに、流線型のPreyプラスミドベクターPGAL4 ADに新しい酵母2-hybridライブラリーが作成されました。ゲノムDNAを剪断により断片化し、サイズを選択し、アダプターで修飾し、PGAL4-ADに挿入してsaxairtab酵母2-ハイブリッドライブラリーを作製しました。ベイトライブラリーと被食者ライブラリーで酵母集団を作製する手順を開始するには、ベイトプラスミドとCSMマイナストリップ培地を含むさまざまなトリップ1を運ぶ各MATa酵母形質転換体について3ミリリットルの培養物を接種します。ベクタープラスミドのみを含む2つの別々の培養物を含め、手続き型コントロールとして使用します。培養物を摂氏30度、200rpmで6時間インキュベートします。次に、各培養物を滅菌三角フラスコで25ミリリットルの培養物に希釈し、一晩インキュベートします。lu2を運ぶ獲物ライブラリーを含むMATα細胞の凍結した胆汁を室温で解凍します。解凍した細胞の悪質な部分全体を使用して、無菌の三角フラスコに125ミリリットルのCSMマイナスluマイナスミート培地を接種します。摂氏30度、200rpmで一晩で培養します。翌日、オーバーナイトマットのOD600が形質転換培養物の範囲が1.0〜1.5であることを確認した後、培養物を50ミリリットルの円錐管に移し、各培養物のOD600相当量を室温で4,696回gで5分間遠心分離する。マットA細胞の各ペレットを10ミリリットルの滅菌水に再懸濁し、懸濁液を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、室温で4,696倍gで5分間遠心分離する。ピペットを使用して、ペレット化された細胞を破壊することなく上清を穏やかに除去し、ペレットをpH 3.7の緩衝YPDA培地4ミリリットルに再懸濁します。所望の10回の嵌合反応ごとに、50ミリリットルのコニカルチューブ内にライブラリープラスミドを運ぶマットアルファ株のペレット39 OD 600相当量。マットアルファ細胞を10ミリリットルの滅菌水に再懸濁し、新しい50ミリリットルの円錐管に室温で4,696倍gで5分間再ペレットする。ピペットを使用して、ペレット化された細胞を破壊せずに上清を穏やかに除去し、ペレットをpH 3.7の緩衝YPDA培地10ミリリットルに再懸濁します。各嵌合反応を設定するには、新しい50ミリリットルのコニカルチューブに以下を追加します:1ミリリットルのMAT-A形質転換細胞、1ミリリットルのMAT-αライブラリ含有細胞、およびpH 3.7で1ミリリットルの緩衝YPDAです。摂氏30度で、穏やかに軌道攪拌しながら90分間インキュベートします。90分後、細胞を室温で4,696倍gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、ペレットを1対1の緩衝YPDA-YPDの2ミリリットルに再懸濁します。2ミリリットルの細胞すべてを100ミリリットルのYPDプレートに播種し、摂氏30度で約20時間インキュベートします。細胞を回収するには、2〜3ミリリットルのCSM minus lu minus trip mediumを各YPDプレートにピペットで移し、セルスクレーパーを使用して細胞を取り除きます。取り除いた細胞を50ミリリットルの円錐管にピペットで移します。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して媒体をピペットで持ち上げ、YPDプレート表面を横切って穏やかに排出することにより、2〜3ミリリットルのCSMマイナスluマイナストリップ媒体でプレートを4〜5回すすぎます。細胞を室温で4,696倍gで5分間遠心分離します。各円錐管から上清を捨て、ピペッティングで上下させて、40ミリリットルのCSM minus lu minus trip mediumに細胞を再懸濁します。形成される二倍体細胞の数を推定するために、二倍体混合物の4マイクロリットルをそれぞれ200マイクロリットルおよび2,000マイクロリットルのCSMマイナスluマイナストリップ培地に希釈する。CSMマイナスluマイナストリッププレートに各希釈の200マイクロリットルをプレート化して、収穫された二倍体のストックの1〜10,000および1〜100,000の完全な希釈を表します。プレートを摂氏30度で36〜40時間インキュベートします。細胞再懸濁液の残り40ミリリットルの残りをすぐに使用して、1リットルの三角フラスコに500ミリリットルのCSMマイナスluマイナストリップ培地を接種します。.各カルチャーのOD600を測定します。これらのフラスコを摂氏30度でインキュベートし、180rpmで振とうしながら、飽和に達するまで(通常は36〜40時間かかります)。OD 600を測定して、24時間および36時間での細胞増殖をモニターします。手順を続行する前に、2つの酵母株の交配効率を確認してください。1つから10、000の希釈版に200コロニーの最小数が必要です。培養物が飽和に達したら、ピペットを使用して各培養物から20ミリリットルのアロクアデを取り出し、2リットルの三角フラスコを接種します。1つのフラスコには750ミリリットルのCSMマイナスluマイナストリップミディアムが入っており、もう1つのフラスコには750ミリリットルのCSMマイナスluマイナストリップが入っています。バックグラウンドを排除する3つのアミノ124トリアソルの最も低いレベルで、テキストプロトコルに記載されているように以前に決定されました。渦を巻いて新しい文化をよく混ぜます。最初のOD 600を測定した後、180 rpmで振とうしながら、培養物を摂氏30度でインキュベートし、飽和するまで培養します。飽和するまで、これは通常、選択されていないCSMマイナスluマイナストリップ培養の場合24時間以内に発生しますが、酵母2ハイブリッド相互作用の選択中の培養物では70時間以上かかる場合があります。培養物が飽和に達したら、ピペットで各培養物の11ミリリットルを除去し、室温で4,696倍gで5分間のスピンで細胞を沈殿させます。上清を捨て、次のセクションに示すようにDNA抽出を続行します。DNA抽出手順を開始するには、ピペットを使用して、以前に調製した各細胞ペレットを500マイクロリットルの強力なTEバッファーに再懸濁します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、各チューブに10マイクロリットルのジモレイストックを追加します。ドラフトで、各チューブに3マイクロリットルのベータマルケトールエタノールを加え、よく混ぜます。摂氏37度のインキュベーターで24〜36時間インキュベートします。次に、テキストプロトコルに記載されているように、500マイクロリットルのフェノールクロロホルムアイソレイマルアルコールでサンプルを2回抽出します。7マイクロリットルの4モル塩化ナトリウムと900マイクロリットルの氷冷、100%エタノールを加え、反転して混合します。マイクロ遠心分離機で21、130倍g、室温で10分間回転してDNAを沈殿させます。ピペッティングで上清を捨て、各ペレットを900マイクロリットルの70%エタノールで3回洗浄します。21,130倍gで2分間遠心分離することにより、DNAを沈殿させます。残留エタノールを取り除いた後、ペレットを摂氏42度で7分間乾燥させます。各ペレットを 0.1 倍の強度 TE の 120 マイクロリットルに再懸濁し、摂氏 37 度の水浴中で 90 分間懸濁します。抽出したDNAの60マイクロリットルを滅菌済みの1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで移します。120 μLのストロングTEと3.5 μLのRN ace Aストックを加え、フリックして混合し、37°Cで1時間インキュベートします。5モルの酢酸アンモニウムを7マイクロリットルと氷冷した900マイクロリットル、100%エタノールを各チューブに加えます。前に示したように、DNAを反転させて沈殿させて混合します。RNace-Aで処理したDNAを、0.1倍強TEの55マイクロリットルに37°Cの水浴中で90分間再懸濁します。260ナノメートルの吸光度によりDNAを定量します。次のステップは、CDNAインサートでPCRを実行することです。DNAサンプルごとに50マイクロリットルのPCR反応を2回行います。各反応液に、水、5 マイクログラムの DNA サンプル、Prey Library プラスミドに一致するフォワードプライマーとリバースプライマー 25 ピカモール、25 マイクロリットルのハイフィデリティ 2x PCR マスターミックスを加えます。このプログラムで反応を増幅します。摂氏98度で30秒間の脱性、摂氏98度で10秒間のD-ナトリンの25サイクル、摂氏55度で30秒間のアニーリング、摂氏72度で3分間の延長時間、その後摂氏72度で5分間のインキュベーション。アチジウムブロミンを含むゲルを用いた1%DNAアグロースチル電気泳動により各PCR反応を解析し、UVトランスイルミネーションによりゲルを可視化します。選択されていないサンプルは、DNAの一般化された塗抹標本を示しますが、選択すると個々のバンドを識別できます。重複するPCRサンプルを組み合わせ、製造元の指示に従ってキットを使用して精製します。分光光度計で260ナノメートルの吸光度によりDNAを定量します。その後、ディープシーケンシングを実行し、続いてテキストプロトコルに記載されているバイオインフォマティクスの処理と検証を行います。実証された手順では、新しいランダム断片化酵母2-hybridライブラリーを使用し、PCRによって増幅されたプラスミドインサートをDEEPNシーケンシングおよびDEEPNソフトウェアを使用したバイオインフォマティクス処理で分析し、以前に発表されたライブラリーと比較しました。このプロットは、酵母ゲノムのシーケンシングによって見つけられた遺伝子あたりのリードで割った、ライブラリ内の各遺伝子ごとのリードのランク順を示しています。このヒストグラムは、タンパク質コード領域と適切な翻訳読み取りフレームの両方に存在するフラグメントをコードする遺伝子あたりの一意のプラスミドの数を示しています。酵母遺伝子をコードする各ライブラリー内の異なるプラスミドの数と、正しい翻訳読み取りフレームにある割合とない比率、または逆方向に挿入されている割合の比較が示されています。全体として、新しいライブラリーにはさらに多くの異なるプラスミドがあります。これらの方法により、異なるベイトタンパク質を含む細胞にライブラリーを再現性よく導入できること、および選択手順により、濃縮された再現性のある遺伝子セットが得られ、それらを特定の候補相互作用タンパク質として区別することができます。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば約1週間で完了します。この作業のほとんどは細胞の培養物のインキュベーションであり、実際のハンズオン時間はわずか数時間です。この手順を試行する際には、異なるベイトタンパク質を含む細胞にライブラリーを再現性よく移行できるように、多数の個々の二倍体細胞の集団を作成することを覚えておくことが重要です。また、酵母2-ハイブリッド陽性条件で選択されている集団の細胞の希釈条件と増殖速度に細心の注意を払うことも重要です。この手順に続いて、付属の研究で説明されている計算方法により、相互作用するタンパク質の候補が特定され、従来の酵母2-ハイブリッドアッセイまたは他の生化学的方法を使用してこれらの相互作用を検証するための道筋が提供されます。このビデオを見た後、Prey プラスミドライブラリーを含む二倍体酵母集団を再現性よく作成し、それらをバッチで増殖させて酵母2-ハイブリッド相互作用を正に選択する方法について、非常に良いアイデアが得られるはずです。DNA精製プロトコル中に有機溶媒を扱う作業は危険な場合があるため、手袋と白衣を着用してドラフト内で行う必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

神話では、モデル生物出芽酵母で発現されるタンパク質間の過渡と安定な相互作用を高感度に検出することができます。それが正常にハイスループットな方法でそれらの相互作用パートナーを同定するために、外因性および酵母内在性膜タンパク質の研究に適用されています。...

スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

我々は包括的、公平なゲノムワイドな遺伝子薬剤と遺伝子 -...

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

このビデオでは、特定のタンパク質の自己相互作用を検出するための酵母2ハイブリッドアッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質は、β-ガラクトシダーゼ酵素をコードする転写因子の2つのドメインにタグ付けされます。2つのタンパク質が相互作用すると、転写と翻訳が酵素を形成し、生化学的アッセイを使用して検出されます。...

酵母細胞におけるタンパク質自己会合を決定するための酵母2ハイブリッドアッセイ

このビデオでは、標的DNAと相互作用する複数のタンパク質を検出する改変酵母ワンハイブリッドアッセイを実演します。形質転換酵母細胞は、レポーター遺伝子の上流に標的DNA配列を含んでいます。さらに、転写因子タンパク質を発現します。タンパク質が複合体を形成し、標的DNAに結合すると、レポーター遺伝子が発現し、酵素的に検出することができます。...

ヘテロメアタンパク質複合体-DNA相互作用を検出するための改変酵母-Oneハイブリッドアッセイ

この記事では、ホストと二つの直交の方法を組み合わせて使用​​して病原体のタンパク質間の高い自信インタラクションデータセットの識別に焦点を当てています：酵母ツー​​ハイブリッドHT-GPCA呼ばれる哺乳動物細胞におけるハイスループット相互作用アッセイが続く。...

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

タンパク質は互いに相互作用し、これらの相互作用が彼らの機能の大部分を決定します。タンパク質相互作用パートナーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメント相補アッセイ(DHFR-PCA)に基づく酵母適応度アッセイを使用して、in...

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。...

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

本明細書に記載の改変酵母一ハイブリッドアッセイは、任意の機能的ゲノミクス研究のための異種系におけるヘテロメリックタンパク質複合体-DNA相互作用を研究および検証するための古典的酵母一ハイブリッド（Y1H）アッセイの延長である。...

異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

肯定的な酵母 2 ハイブリッド相互作用の可能性があります選択酵母集団のディープ シーケンスには、パートナーの相互作用の蛋白質についての情報の富が得られます。ここでは、特定のバイオインフォマティクス ツールとこのような画面からシーケンス...

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

タンパク質間相互作用などの生体分子の相互作用は、生体機能の分子基盤です。特に関連する相互作用を欠く相互作用ヌル/障害のある変異体を分離できれば、この相互作用の機能を理解するのに大いに役立ちます。この記事では、interaction-null/障害のある変異体を効率的に分離する方法を紹介します。...

Yeast Two-Hybrid Assayを用いたInteraction-Null/Impaired Mutantsの単離

学ぶバッチ処理酵母2ハイブリッドスクリーンによる複数ベイトタンパク質の相互作用プロファイル比較法。pTEF-GBDプラスミドと深層シーケンスを用いて、タンパク質間相互作用ネットワークを包括的に解析し、疾患関連の差次的相互作用体を同定する。

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッドスクリーン

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