バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

この方法は、タンパク質インタラクトームの性質に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、すべてのバイオインフォマティクス処理が使いやすいインターフェースによって操作されることです。このソフトウェアは、バイオインフォマティクスの専門知識があまりない分子生物学者、細胞生物学者、生化学者が簡単に分析を完了するために使用できる、ユーザーフレンドリーなグラフィックユーザーインターフェイスを採用しています。

一般的に、シーケンスデータの処理に不慣れな人は、コンピュータープログラムが混乱し、面倒であるため、苦労します。インフォマティクスを簡単にすることで、技術全体がよりアクセスしやすく、便利になると考えました。この手順の最初のステップは、テキストプロトコルで説明されているように、MAPster ソフトウェアプログラムをダウンロードしてインストールすることです。

次に、[メイン]タブで必要なファイルとパラメータを入力します。適切な[ペアワイズ]ボタンを選択して、DEEPN解析用のファイルを入力します。ペアワイズ オプションを オフ にすると、シングル読み取り形式で実行されます。

MAPsterにファイルをロードするには、適切なウィンドウにドラッグアンドドロップします。「ゲノム」ボックスにリストされているインデックス付きゲノムから、Y2H prey library insertsのソースに対応する参照DNAゲノムソースを選択します。HISAT2 はマルチスレッドをサポートしているため、[スレッド] ボックスの下に、マッピング プログラムに割り当てるコンピューター プロセスの数を指定します。

出力ファイル名は、スペースや特殊文字を含まない短くてわかりやすい名前で指定してください。このファイル名はDEEPNプロセス全体で使用されるためです。[出力ディレクトリを開く] ボタンを使用して、マップされたファイルを出力するフォルダーを指定します。適切なファイルとパラメーターを選択したら、「キューに追加」ボタンを使用して、マッピングジョブをジョブキューに追加します。

すべてのジョブがジョブキューに入力されたら、[キューの実行]ボタンをクリックします。この解析は、DEEPNソフトウェアを開くことから始めます。メインウィンドウで、上部の選択ボックスから対応する獲物ライブラリ情報を選択します。

処理されたファイルが移動できるフォルダを選択するには、[Work Folder]ボタンをクリックしてフォルダディレクトリに移動します。ワークフォルダを選択すると、DEEPNは指定された名前で3つのサブフォルダを作成します。分析を成功させるには、正しい SAM ファイルを正しいフォルダに配置し、マップされた読み取りとマップされていない読み取りがあるファイルを確認してください。

MAPster プログラムのデフォルト設定で作成されたものなど、マップされた読み取りとマップされていない読み取りの両方を含む sam ファイルを使用する場合は、それらを sam_files フォルダに配置します。Gene Count plus Junction Makeボタンをクリックして処理を開始します。処理時間は、シーケンスデータファイルのサイズと数、および使用するコンピューターの処理速度によって異なります。

DEEPNがデータを処理すると、フォルダのフルセットが作成されます。次のステップは、Stat Maker で解析を実行することです。Stat_Makerを開き、[インストールの確認]ボタンをクリックします。

初めて実行する場合、Stat_Maker は R、JAGS、Bioconductor のリソースをインターネットからプルして自動的にインストールします。R、JAGS、およびBioconductorが検出されると、Stat_Makerがアクティブになり、さらにユーザー入力が可能になります。「フォルダを選択」ボタンをクリックして、DEEPNが処理した作業フォルダに移動します。

Stat_Makerは、統計分析用のファイルをウィンドウに自動的に検索して一覧表示します。上のファイルリストウィンドウから、各ベクトルと餌データセット、および各成長条件(選択されていない状態と選択されている状態)について、適切なファイルを下のファイルウィンドウにドラッグアンドドロップします。重要なのは、Stat_Maker空のベクトルのみ、選択されていない母集団の2つのサンプル、および選択された2つのサンプルに対して重複するデータセットが必要であることです。

これにより、実験内の変動性の推定値が得られます。「実行」ボタンをクリックします。コンピューターの速度にもよりますが、計算には5分から15分かかります。

Stat_Maker出力の結果は、Stat_Maker Resultsというラベルの付いたメイン作業フォルダー内の新しいサブフォルダーに配置されます。結果を確認します。各候補のデータを確認するには、DEEPNソフトウェアを開き、対応する獲物ライブラリ情報を選択し、その作業フォルダを使用して正しい作業フォルダを選択します。

「Blast Query」ボタンをクリックして、新しいウィンドウをロードします。上部のテキストボックスに、遺伝子名またはGenBank NM番号を入力して、目的の候補遺伝子を選択します。遺伝子名は、Stat Maker 出力ファイルにリストされている名前に対応しています。

Enter または Return と入力すると、目的の遺伝子の検索が開始されます。[データセットの選択] メニューを使用して、分析に使用するデータセットを選択します。通常、これらには、ベクターのみ、非選択的条件下で増殖したベイトサンプル、および選択条件下で増殖したベイトサンプルが含まれます。

最初は、Blast Queryプログラムでデータと遺伝子名の読み込みに少し時間がかかることがありますが、データセットが読み込まれると、はるかに高速になります。Blast_Query、対象のシーケンスに沿った融合ポイントと、各融合ポイントがどれだけ豊富であるかが表示されます。これは、[結果]タブを使用して表形式で表示することも、[プロット]タブを使用してグラフィック形式で表示することもできます。

これらの結果をcsvファイルにエクスポートするには、右上の[csvを保存]ボタンをクリックします。DEEPNウィンドウで、Analyze Dataの下にあるRead Depthボタンをクリックします。[読み取り深度] ウィンドウが開いたら、上部のテキスト ボックスに NM 番号を入力します。

プルダウンメニューを使用して、目的の濃縮遺伝子を含む関連データセットを選択します。左側の表と右側のグラフィック表示を使用して、目的の遺伝子に対応するデータで見つかったリードの数を判断します。Stat Makerプログラムは、相互作用するタンパク質の候補を特定するために必要な関連情報をまとめたExcelで表示可能なファイルを作成します。

また、獲物候補に対応するプラスミドが適切なオープンリーディングフレームを含んでいるかどうかの対応する分析も示されています。Blast Queryは、すべての遺伝子を評価し、データベース内で見つかったジャンクションの総数のppmで定量化されたデータセット内のそれらの存在量に応じて、さまざまな位置を並べ替えます。この例では、In ORFおよびIn Frameである最も豊富な位置は位置867であり、GenBank NCBI参照配列NM_019648のヌクレオチド867が獲物フラグメントの開始であることを示しています。

この図は、仮想的な配列と、Gal4活性化ドメインと目的の獲物配列との間の正しいフレームと融合点を捕捉するための5プライムオリゴの設計方法を示しています。この「Read Depth」ウィンドウには、対象配列のヌクレオチド位置に対応するデータ内で見つかった配列の数が表示されます。一度習得すれば、データの処理は10時間から20時間で完了し、ほとんどの場合、無人で行うことができます。

DEEPNスクリーニングとそれに対応するインフォマティクス解析は、幅広い分野の研究者が関心のあるタンパク質との相互作用ネットワークを探索するための道を開くでしょう。MAPsterプログラムは、DEEPN実験の配列ファイルのマッピングを容易にするように設計されています。また、RNA-SeqやChIP-Seqなどのさまざまなアプリケーションのために、配列ファイルを参照DNAにマッピングするためのユーザーフレンドリーな方法も提供します。

DEEPNソフトウェアは、バッチ酵母ツーハイブリッドデータの処理に特化して構築されていますが、RNA-Seqデータの処理にも使用できます。Stat Makerプログラムは、どの遺伝子が本物の酵母2ハイブリッド相互作用をもたらすかを予測するだけでなく、フレーム情報の読み取りなど、他の多くのパラメーターも照合して、研究者が候補のヒットをすばやくフィルタリングできるようにします。相互作用タンパク質の候補が同定されたら、標準的な酵母2ハイブリッドアッセイ、生化学的プルダウンアッセイ、または関連メソッドを使用して相互作用を検証することが重要です。