分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

この方法は、脂肪組織のリモデリング中に強力な脂肪形成反応を防ぐ主要な要因やメカニズムを特定するなど、肥満分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、少量の組織から始めて、ヒト脂肪組織からCD34+CD31+内皮細胞を単離できることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、脂肪形成刺激に応答するヒト脂肪血管系の細胞を特定したいと思ったときでした。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、新鮮なヒト脂肪組織へのアクセスが限られていることが多いため、細胞単離ステップの実践が困難であるため、非常に重要です。肥満手術を受けている被験者からヒトの軟部および皮下脂肪組織を採取します。組織抽出の直後に、ヒトのオトガイ組織と皮下脂肪組織を、ペニシリンストレプトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムのハンク緩衝塩溶液を含む別々のバイアルに保管します。

組織抽出後にサンプルがラボに到着したら、70%エタノール綿棒のはさみとピンセットを使用して、組織の線維性および焼灼性切片を慎重に洗浄して除去します。脂肪組織の重量を量り、コラゲナーゼ消化のために5グラムのアリコートに分割します。2組のハサミを使用して、室温でシンチレーションバイアル中のコラゲナーゼ溶液5ミリリットルに5グラムの脂肪組織を細かく刻みます。

ミンチ組織にさらに10ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加え、合計15ミリリットルにします。.サンプルを摂氏37度で1時間、水浴中で連続的に振とうします。分解後、サンプルを20ミリリットルの鈍い端のシリンジに注ぎます。

250ミクロンのナイロンメッシュでサンプルを50ミリリットルの円錐管にろ過し、未消化組織から脂肪細胞と間質血管細胞を分離します。シンチレーションバイアルを10ミリリットルのKRBBSで洗い流し、フィルターに洗浄液を注いで残留細胞を収集し、ろ過したサンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、20ミリリットルのシリンジと20ゲージ×6インチのピペッティングニードルを使用して、間質血管画分層を除去し、きれいな50ミリリットルのコニカルチューブに移します。

10ミリリットルのKRBBSを加え、サンプルを室温で5分間ベンチに置きます。両方のデポからの間質血管画分を氷上に置いて、さらに処理します。間質血管画分をGの500倍で摂氏4度で5分間回転させます。

遠心分離機からサンプルを取り出し、上清を慎重に注ぎ、間質血管画分細胞を含むペレットを保持します。細胞ペレットを5ミリリットルのPBSに穏やかに再懸濁します。サンプルを再度回転させた後、上清を除去し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞をカウントします。

サンプルを3回目にペレット化し、ペレットを100マイクロリットルのCD34分離バッファーに再懸濁します。10マイクロリットルのCD34カクテルを加え、サンプルを室温で15分間インキュベートします。次に、5マイクロリットルの磁気ビーズを加え、サンプルを室温で10分間インキュベートします。

次に、各サンプルに2.5ミリリットルのCD34アイソレーションバッファーを加え、サンプルを磁石に室温で5分間入れます。磁石を5秒間反転させて、アイソレーションバッファを注ぎ出します。このプロセスを4回繰り返した後、チューブを磁石から取り外し、2ミリリットルのCD34アイソレーションバッファーを追加します。

別の遠心分離に続いて、CD34+細胞ペレットを1ミリリットルのCD34分離バッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。細胞を再度ペレット化し、ペレットを250マイクロリットルのバッファーBおよび250マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。次に、チューブをボルテックスしてCD31ビーズを完全に再懸濁し、再懸濁した細胞ペレットに20マイクロリットルのCD31ビーズを加え、室温で30分間揺さぶってサンプルをインキュベートします。

細胞を分離する前に、1ミリリットルの洗浄バッファーを添加してストレーナを平衡化します。次に、CD31ビーズに再懸濁した細胞の調製混合物をストレーナーに適用します。ストレーナーを5ミリリットルの洗浄バッファーで円を描くように、合計20ミリリットルで洗浄します。

コネクタを滅菌済みの50ミリリットルの円錐形チューブに取り付け、ルールロックを閉じます。ストレーナをコネクタに取り付けた後、ストレーナの壁に沿って1ミリリットルの洗浄バッファを追加し、次にストレーナの壁に沿って1ミリリットルの活性バッファDを追加します。サンプルを穏やかに渦巻かせ、室温で10分間インキュベー

次に、1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、ピペッティングで10回上下させて細胞をビーズから分離します。ルールロックを開き、切り離されたセルが50ミリリットルの円錐管に流れ込むのを待ちます。ストレーナーを毎回1ミリリットルの洗浄バッファーで10回洗浄します。

コネクタとストレーナを廃棄し、サンプルをGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。最後に、細胞ペレットを2ミリリットルの完全EGM2培地に再懸濁して培養します。摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーター内の完全なEGM2培地を備えた6ウェル組織培養プレートで細胞を増殖させます。

細胞が80〜90%のコンフルエントに達するまで、3〜4日ごとに培地を交換します。次に、約10万から20万個の細胞を6ウェルプレートに播種し、各デポに重複するウェルを確保し、それらを完全なEGM2培地で2日間培養します。2日後、成長培地を吸引します。

メディアを 2 ミリリットルの DMEM/F-12 メディアと交換し、コントロール細胞の 5%FBS と 50 マイクログラム/ミリリットルのペニシリン ストレプトマイシンを使用します。治療細胞については、培地を2ミリリットルの脂肪形成培地と交換します。加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度で13日間インキュベートし、それぞれの培地を3〜4日ごとに交換します。

培養中の2つの継代後のCD34+CD31+細胞の典型的な内皮の丸石のような形態を示す代表的な結果が示されています。また、マトリゲルで予想通りに培養すると、細胞が細管を形成する能力も実証されています。蛍光標識されたアセチル化LDLの均一な取り込みは、内皮同一性を有する均質な細胞集団の存在を示しています。

ここに示されているのは、13日間の脂肪誘発後のCD34+CD31+細胞の中性脂肪滴のオイルレッドO染色です。3つの異なるヒト被験者のオトガイおよび皮下デポからの細胞の代表的な応答は、同じドナーの脂肪デポ間およびドナー間の脂肪形成誘導に対する応答の大きな変動性を示していることが示されています。この画像は、脂肪形成誘導後のCD34+C31+細胞の13日間の蛍光細胞内脂質染色を示しています。

画像は、単房性脂質、多房性脂質、および脂質蓄積のない細胞を示しています。リアルタイムPCRでは、汎脂肪細胞マーカーのアディポネクチンとブラウンベージュのマーカーCIDEAとUCP-1の発現が示されています。これらの結果は、脂肪形成誘導後の細胞が、混合ホワイトベージュ脂肪細胞の表現型と一致する分子マーカーを発現することを裏付けています。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試みるときは、収集され、2時間以上保存されていない新鮮な人間の脂肪組織を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、フローサイトメトリー、免疫組織化学、RT-PCRなどの他の方法を実行して、応答細胞の特定のサブセットを同定し、ベージュの茶色の脂肪細胞表現型を同定するために利用できる成熟脂肪細胞マーカーの発現を行うことができます。

開発後、この技術は、肥満分野の研究者がヒトの脂肪組織、血管細胞、および脂肪形成の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、CD34+31+細胞の単離、培養、増殖の方法についてよく理解できるはずです。人間の組織を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、バイオセーフティ規制などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

この技術の意味は、潜在的な治療介入に対する細胞の脂肪形成反応を特定するため、インスリン抵抗性などの肥満に関連する併存疾患の治療にまで及びます。