Name: 分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ CD34+CD31+血管内皮細胞の分離・培養法。人の大網・皮下脂肪組織から少量サンプルで内皮細胞を単離し、白色・ベージュ脂肪細胞へ分化誘導する技術。肥満や代謝疾患の研究に応用可能。

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著者はベッキー マルケス、センタラ肥満センター、患者スクリーニングと同意のプロセスに彼女の援助のための医療コーディネーターを認識したいです。この研究は、Anca + Dobrian に R15HL114062 によって支えられました。

東バージニア医学校制度のレビュー ボード委員会承認研究および研究で使用されるひと脂肪組織サンプルのコレクション。通知の書面による同意は、患者から採取しました。
1. バッファー、メディア、および計測器の準備
<ol><li>Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered ソリューション (KRBBS) を準備: 塩化ナトリウム 135 ミリメートル、5 mM 塩化カリウム、硫酸マグネシウム 1 mM、0.4 mM カリウム リン酸水素、5.5 mM グルコース、1 mM アデノシン、0.01% 抗生物質/抗真菌薬ミックス (50 μ g/mL のペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンの 30 μ G/ml、アムホテリシン 15 ng/mL の 50 μ g/mL) 10 mm HEPES (pH 7.4 を =)。このソリューションは、組織の採取や消化をするたびに新鮮な準備されます。</li>
	<li>新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製: KRBSS; で 1 mg/mL コラゲナーゼのタイプ 1、3 mL/g の脂肪を作る。事前組織消化前に水のお風呂で 37 ° C でコラゲナーゼの解決を温めます。</li>
	<li>Cd34 陽性細胞分離バッファーを準備: 2% ウシ胎児血清 (FBS)、1 mM EDTA 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。</li>
	<li>脂肪細胞形成メディアの準備: DMEM/F12、5 %fbs、ペニシリン/ストレプトマイシン、ヒトインスリン (5 μ G/ml または 144 mU/mL) の 1.25 μ L/mL と 2.8 mM ロシグリタゾン (1 μ M) の 0.36 μ L/mL の 50 μ g/mL。</li>
	<li>100 mL のイソプロパノールにオロの 0.3 g を溶解することにより 0.3% オイル赤い O (オロ) 原液 (重量/体積) を準備します。</li>
</ol>2. 脂肪間質血管の一部分離
注: 研究は、病的肥満 2 型糖尿病 (T2D) と非糖尿病患者対象、18-65 歳以上センタラ代謝で減量外科センター (センタラ医療グループ、ノーフォーク、VA) 肥満症治療手術の断面のコホートを含まれています。1 型糖尿病は、慢性的な免疫抑制療法、抗炎症薬、thiazolinendiones、アクティブなタバコの使用、慢性や急性の感染症、または歴史を必要とする条件を含む自己免疫疾患が除外基準に含まれています。悪性腫瘍の最後の 12 ヶ月以内で処理。ダグラス T2D は、空腹時血糖 126 mg/dl 以上、200 ミリグラム/dL の以上 2 h 耐糖能をテストすると、血糖値や抗糖尿病薬の使用と定義しました。
<ol><li>肥満手術を受ける被験者からひと大網 (OM) と皮下 (SC) 脂肪 (AT) を収集します。</li>
	<li>組織抽出後すぐに室温でペニシリン/ストレプトマイシンの 50 μ g/mL のハンクの緩衝塩液を含む別のバイアルに OM と SC AT をしてください。</li>
	<li>慎重にきれいにし組織抽出後、ラボに到着すると、サンプル 70% エタノール採取はさみとピンセットを使用して、組織の線維化と焼灼のセクションを削除します。</li>
	<li>脂肪組織を圧迫し、コラゲナーゼの消化力のためのそれを 5 g (または少ない) 因数を分割します。</li>
	<li>はさみの 2 つのペアを使用して室温でシンチレーション バイアルにコラゲナーゼ溶液の 5 mL で AT の 5 g を細かくみじん切り。</li>
	<li>コラゲナーゼの解決の追加 10 mL を 15 mL 合計でみじん切りにした組織に追加します。</li>
	<li>連続振動で水浴中の 37 ° C で、1 h のサンプルを消化します。</li>
	<li>鈍い端に 20 mL の注射器に先端を削減します。</li>
	<li>250 μ m メッシュから 9 cm × 9 cm の正方形を切り取って鈍い端の注射器を使用して 50 mL の円錐管が途中で押し込みます。</li>
	<li>鈍い端の 20 mL シリンジと未消化の組織から脂肪細胞と血管の間質細胞を分離する 50 mL の円錐管に 250 μ m ナイロン メッシュをフィルターにサンプルを注ぐ。 注: 余分な線維化未消化材料によりメッシュが詰まって取得、50 mL コニカル チューブあたり 5 g 以上でを使用しないでください。</li>
	<li>KRBBS 10 mL でシンチレーションのバイアルを洗浄し、残留細胞を収集するフィルターを介して注ぐ。</li>
	<li>室温で 5 分間フィルターが適用されたサンプルをインキュベートします。 注: この手順は、フロート チューブの上部といくつか間質血管細胞の管の底に解決するために脂肪細胞を可能にすることが重要です。</li>
	<li>20 mL シリンジと間質血管の一部のレイヤーを削除し、きれいな 50 mL の円錐管に転送分注針で 20 x 6 を利用します。</li>
	<li>KRBBS 10 mL を追加し、室温で 5 分間ベンチに座るにサンプルを許可します。</li>
	<li>2.12-2.14 の手順を 2 回繰り返します。 注: これらの手順が浮動の脂肪細胞と間質の血管細胞の汚染がないことを確認します。</li>
	<li>以下の手順で説明するよう、両方の拠点、さらなる処理のため氷の上から間質血管の分数を維持します。 注: セル実行可能性に影響を与える可能性があります、1 h 以上の氷の上のセルを残してはいけない。脂肪細胞は長期保存用液体窒素でフラッシュ凍結することができます。 または実験用新鮮です。</li>
</ol>3. 脂肪組織の血管内皮細胞の分離
<ol><li>4 ° C で 5 分間 500 x gで間質血管の分数 (SVF) をスピンします。</li>
	<li>遠心分離機からサンプルを外し、慎重に; 上澄みを離れて注ぐSVF セルを含むペレットを維持します。</li>
	<li>軽く 5 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。 注: AT デポの 5 g 以上が複数の因数 (ステップ 2.4 参照) に処理された場合細胞ペレットを一緒に分かち合います。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 500 x gでサンプルをスピンします。</li>
	<li>上澄みを除去、1 mL の PBS、細胞を再懸濁します、セルをカウントします。 注: ここでは、セルの自動カウンターは、セルカウントに使われました。アクリジン オレンジ/propidium ヨウ化 (AO/PI) ソリューションの 12 μ L で 12 μ L の細胞懸濁液を混合することによって得られたセル実行可能性 (材料の表を参照してください)。各デポの AT のグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 1.69 × 105 ± 4.51 × 104;(b) SC デポ: 105 ± 6.45 x 104× 1.24。両方の拠点から細胞の viability が > 90%。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 500 x gでサンプルをペレットします。 注: CD34 免疫選択プロトコルは手順 3.7 – 3.15 適応されました (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>CD34 分離バッファーを 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。 注: 総細胞数次の再懸濁液ボリュームを必要とする: (a) < 2 x 10 の7セル: 100 μ L; でペレットを再懸濁します(b) 108–5 × 108セル × 2: 1 mL にペレットを再懸濁します。3.9-3.16 の手順で使用する試薬の量だったため縮小 < 2 x 10 の7セル。</li>
	<li>CD34 カクテル 10 μ L を追加し、室温で 15 分間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>磁気ビーズの 5 μ L を追加し、室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>各サンプルに 2.5 mL の CD34 分離バッファーを追加し、室温で 5 分間、磁石にサンプルを配置します。</li>
	<li>5 のための磁石を反転分離バッファーを注ぐ s。</li>
	<li>磁石から、サンプルを削除、手順 3.10 と 3.11 の 4 倍を繰り返します。</li>
	<li>磁石からチューブを削除し、2 mL の CD34 分離バッファーを追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 500 x gで細胞をペレットします。</li>
	<li>CD34 分離バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。 注: ここでは、AT のグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 4.75 × 104 ± 3.36 × 104;(b) SC デポ: 104 9.53 × 10 ±3x 1.06。CD31 プラスチック immunobead プロトコル手順 3.16-3.34 (材料の表を参照してください) 適応されました。</li>
	<li>500 x gで 5 分で細胞をペレットし、バッファー B 250 μ、250 μ L の洗浄バッファーでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ボルテックス チューブ CD31 ビーズを徹底的に再懸濁します。</li>
	<li>CD31 ビーズの 20 μ L を追加します。 注: [集計] セルのためカウント > 1 × 106、ボリューム製造元の入力に応じて規模を縮小しました。</li>
	<li>30 分間、室温のロッキング サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>ストレーナーを滅菌 50 mL の円錐管に接続します。 注: こし器の大きな開口部上にある必要があります。</li>
	<li>細胞分離前にストレーナーを平衡に洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。[ステップ 3.16 ストレーナーに生成された混合物を適用します。</li>
	<li>20 mL の容量の円運動で 5 mL の洗浄バッファーとストレーナーを洗浄します。コネクタを滅菌 50 mL の円錐管に接続し、ルアーロックを閉じます。</li>
	<li>ストレーナーをコネクタに取り付けます。こし器の壁に沿って洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。こし器の壁に沿ってアクティブ バッファー D の 1 mL を追加します。サンプルをゆっくり旋回し、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。ビーズから 10 倍上下ピペッティングにより細胞を分離します。 メモ: は、空気の泡を生成しないでください。</li>
	<li>ルアーロック-を開き、50 mL の円錐管に流入する剥離細胞を許可します。ストレーナー 10 を洗うたびに洗浄バッファーの 1 ml x。</li>
	<li>コネクタとストレーナーを破棄し、遠心分離機の 300 × g 10 分間、4 ° C でのサンプル文化の完全な EGM 2 メディアの 2 mL の細胞ペレットを再懸濁します。 注: この時点でのグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 5.92 × 103 4.27 × 10 ±3;(b) SC デポ: 4.12 103 ± 2.1 x 103x。両方の拠点からの細胞の生存率は 90 パーセント以上だった。</li>
</ol>4. 血管内皮細胞脂肪細胞形成の誘導
<ol><li>37 ° C、5% CO2インキュベーターで完全な EGM 2 メディアの 6 ウェル培養処理板の細胞を成長します。メディアを交換して、電池が 80-90% の合流点に達するまで 3-4 日おき。 注: 人口倍増は 2-3 日です。</li>
	<li>100 mm ペトリ皿上それらをメッキすることによって細胞を展開し、1:3 回セルを分割します。この段階でセルが 2 の一節にあります。</li>
	<li>自動細胞を用いた細胞カウンター (材料の表を参照してください) の数。</li>
	<li>デポおよびそれらは 2 日間の EGM 2 メディアを完了で文化ごとに重複する井戸の確保 6 ウェル プレートに種子約 100-200,000 セルです。</li>
	<li>任意の成長媒体を離れて吸い出しなさいし、2 ml の 5% を DMEM/f12 キーの交換 FBS ペニシリン/ストレプトマイシン コントロールのための 50 μ g/mL 細胞治療細胞の脂肪細胞形成メディア (手順 1.4 参照) 2 mL に置き換えると。</li>
	<li>37 ° c 5% の加湿で細胞をインキュベート CO2インキュベーター 13 日間のそれぞれのメディアごと 3 〜 4 日の交換します。 注: 細胞治療の 4 日後に脂質を蓄積する開始されます。</li>
	<li>オロとナイルレッド公開メソッド15-17によると染色を行います。</li>
	<li>RNA 抽出のためのセルを分離するには、6 よく誘導プレートからメディアを取り出し、1 mL の滅菌 PBS で洗浄します。</li>
	<li>Guanidium チオシアン酸-フェノール-クロロホルム溶液の 350 μ L を追加 (材料の表を参照) もそれぞれ、5-10 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>細胞スクレーパーを使用してプレートから細胞をこすりし、セルを 1.5 mL 遠心チューブに転送します。 注: サンプルは、RNA の抽出、さらに後日処理-80 ° C のフリーザーで格納できます。</li>
	<li>適応の RNA 抽出を用いたサンプルから mRNA を抽出プロトコル (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 次のプローブを用いた遺伝子発現を評価するを実行: アディポネクチン、UCP-1、および CIDEA (材料の表を参照してください)。 注: ここでは、RT-PCR 法手続を実施した次の標準的なプロトコルを使用して: 変性 (95 ° C; 15 s)、アニーリング、および 40 のサイクルの拡張 (60 ° C; 1 分)。CTの値を持つ遺伝子を表すサンプル > 35 が検出されないと考えられていた。</li>
</ol>

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</ol>

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本稿の焦点は、分離、拡張および CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織内臓や皮下のデポから血管内皮細胞の脂肪分化誘導方法論を提供することです。
齧歯動物または CD31 抗体、蛍光ラベルまたは磁気ビーズ18,に結合を使用して主にテクニックを使って人間の様々 な血管ベッドから血管内皮細胞の隔離のための方法論が報告されています。19,20,21,22,23. これらの分離技術の普遍的な使用のための主要な課題は異なる血管ベッドで内皮細胞人口の不均一性と線維芽細胞や血管壁細胞の混入のリスクが高い。しかし、このような汚染を避けるために分離技術の改良は、報告された<sup class="xref...

最近の証拠は、マウスとヒトでは、白またはベージュ/ブラウン脂肪1,2,3に脂肪組織の血管に存在するセルのサブセットを区別できますを示しています。このような細胞の表現型の中間表現型4,5,6、7のスペクトルや平滑筋/周皮細胞、血管内皮細胞を支持する証拠との論争の主題であります。この方法論の開発の範囲は、CD31 cd34 陽性 + + 肥満人間から別の脂肪質のターミナルから分離した内皮細胞の脂肪分化能をテストするためだった。文献の他の研究は、潜在的な合計の間質血管の分数または知られている脂肪細胞の前駆細胞の2,8,9の脂肪細胞に着目します。現在既存の技術は、薬配信10特に脂肪組織の血管内皮細胞をターゲットすることができますので、このような細胞の脂肪分化を受ける可能性を理解白またはベージュの脂肪細胞へ誘導重要です。将来の目標とされた療法。
別のグループは、ひと脂肪組織11,12,13から血管内皮細胞を分離するサロゲートとして CD31 と CD34 マーカーの組み合わせを報告しました。通常、2 つの連続した手順と磁気ビーズを用いた正の選択を使用して分離が実行されます。本報告では、CD31 プラスチック ビーズと組み合わせて CD34 陽性磁気ビーズを用いた immunoseparation に利用されました。典型的な石畳の内皮形態の保全に関して逐次磁気 immunoseparation に優れたこの手法がわかった。また、脂肪の 1-2 g ほどから始まって拡大と脂肪細胞の誘導に必要な十分な細胞を生成することができました。皮下脂肪の小さなサンプル生検は、下流用電池の必要な量を生成するのに十分です。この面は可能性のある重要な特に場合は、このメソッドは人間の脂肪分化誘導に対する反応性のスクリーニングに使用されます。
文献で報告された他のシステムとは異なり、この方法は CD31 cd34 陽性 + + 細胞の脂肪分化誘導のための 2 つの成分を利用: ppar γ アゴニスト-ロシグリタゾン — とヒトインスリンです。重要なは、インスリンの使用量は、人間14post-absorptive インスリンを循環通常/高の範囲内にあります。カクテルの誘導に対応する能力と、細胞の in vitro、Akt のリン酸化による測定のインスリンに対する反応性の程度は相関しなかった。興味深いことに、この誘導のカクテルや実験条件を使用して、白とベージュ/ブラウン細胞のミックスは、サイズと分子マーカーの発現と細胞内脂質液滴の数によって決定された得られました。(白とベージュ)、細胞の表現型の定量的評価と一緒にこの簡単かつコスト効果の高い誘導プロトコルは、差別化されたベージュのバランスを変更することができます潜在的エージェントのスクリーニング: 白色脂肪細胞です。
このメソッドは、ひと脂肪組織の血管内皮前駆細胞の脂肪細胞形成の基になるメカニズムを理解するためトランスレーショナル アプローチを提供します。この特定の分離/差別化手法を使用して、捜査官は様々 な経路の細く、肥満の人間の様々 な脂肪質のターミナルから血管内皮細胞のサブセットの脂肪細胞の形成を担当に問い合わせることができます。

<table><tbody><tr><td> 大型機器 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> バイオセーフティキャビネット </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> 細胞培養インキュベーター </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> ウォーターバス </td><td>Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Reciprocal Shaker </td></tr><tr><td> RT-PCR Machine </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> 電気泳動ボックス </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 Cell </td><td></td></tr><tr><td> Transblot Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini トランスブロットセル </td><td></td></tr><tr><td> 電気泳動電源 </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> ブロットリーダー </td><td>LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> 近赤外線 </td></tr><tr><td> 冷蔵遠心分離機 </td><td> エッペンドルフ </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> 卓上遠心分離機 </td><td> エッペンドルフ </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> 蛍光顕微鏡 </td><td> オリンパス </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> 倒立顕微鏡 </td><td> ニコン </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> 重炭酸ナトリウム </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> 塩化カルシウム二水和物 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> リン酸カリウム一塩基 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> 塩化ナトリウム< </td><td> p>Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> リン酸ナトリウム一塩基性一水和物 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> カリウム塩化物 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> グルコース </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> アデノシン </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> ウシ血清アルブミン </td><td> GEヘルスケアバイオサイエンス </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> ペニシリン/ストレプトマイシン </td><td> サーモフィッシャーサイエンティフィック </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Digestion </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL シリンジ </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> ナイロンメッシュ、250 & マイクロ;m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> ピペッティングニードル </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Fine Science Tools </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Forceps </td><td> ジョージ・ティーマン &Co </td><td> 160-20 < </td><td></td></tr><tr><td> p>コラゲナーゼ、I型 </td><td> ワージントン生化学 </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> ペトリ皿、100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC処理 </td></tr><tr><td> エッペンドルフチューブ、 1.5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> Conical Tubes, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> Conical Tubes, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Scintillation Vials </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Tissue Dicing </td></tr><tr><td> Cell Isolation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Slides </td><td> Nexcelom </td><td>CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> セロメーター生存率染色 </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> アクリジンオレンジ/プロピッド ヨウ素 (Ium Iodine </td></tr><tr><td> Anti-CD34 Magnetic Beads </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySepマグネット </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 プラスチックビーズ </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x ウォッシュバッファー </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelectコネクタリング </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Detachment Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Incubation Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td>pluriSelect S 細胞ストレーナー </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Culture </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-well Plates </td><td> USA Scientific </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC Treated </td></tr><tr><td> 4-ウェルチャンバースライド </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> フィブロネクチンコーティング </td></tr><tr><td> 4ウェルチャンバースライド </td><td> サーモフィッシャーサイエンティフィック </td><td> 154526PK </td><td> コーティングされていないガラス </td></tr><tr><td> ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMVEC) </td><td>Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> Primary cell line </td></tr><tr><td> Endothelial Cell Cell Media (ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Complete Kit </td></tr><tr><td> DMEM/F12 基礎培地 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> ウシ胎児血清(FBS) </td><td> ロッキーマウンテンバイオロジカルズ </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> インスリン </td><td> リリー </td><td> U-100 </td><td> ヒューマログ </td></tr><tr><td> ロシグリタゾン </td><td> シグマ-アルドリッチ </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Analysis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Prepared in isopropanol </td></tr><tr><td> 96 well plates </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルPCRプレート </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> RNA Extraction </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA Synthesis </td><td> BIO-RAD </td><td>1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR ポリメラーゼ </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN </td><td> Hot Start、PCR バッファー N </td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム溶液 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> PCR 反応で 3 mM の最終値 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td>キット </td></tr><tr><td> ビスアクリルアミド </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> 40% ストック溶液 </td></tr><tr><td> 過硫酸アンモニウム </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> グリシン </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecal 硫酸ナトリウム </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> フィッシャーサイエンティフィック </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> ブロモフェノールブルー </td><td> シグマ-アルドリッチ </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> ブロットメンブレン </td><td> EMDミリポア </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> メタノール </td><td> フィッシャーサイエンティフィック </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey ブロッキングバッファー、トリス </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-AKT antibody </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 2920S </td><td> マウスモノクローナル </td></tr><tr><td> Anti-pAKT antibody </td><td>細胞シグナル技術 </td><td> 9271S </td><td> ウサギポリクローナル </td></tr><tr><td> 抗UCP1抗体 </td><td> Abcam </td><td> ab10983 </td><td> ウサギポリクローナル </td></tr><tr><td> 抗マウスIgG抗体 </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> ヤギポリクローナル、IRDye 680RD </td></tr><tr><td> 抗ウサギIgG抗体 </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> <>p ヤギポリクローナル、IRDye 800CW </td></tr><tr><td> 抗ウサギIgG抗体 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> ヤギポリクローナル、 TRITC </td></tr><tr><td> リン酸緩衝液 生理食塩水 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> 37% ホルムアルデヒド溶液 </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15686 </td><td> 細胞固定用4%溶液 </td></tr><tr><td> Normal Goat Serum </td><td>Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10% ブロッキング溶液 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> 0.1% 透過処理液 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> カルセイン AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Cell fluorescent visualization </td></tr><tr><td> Matrigel Basement Membrane Matrix </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231 </td><td> Growth factor reduced </td></tr><tr><td> DiI 標識アセチル化LDL </td><td> サーモフィッシャーサイエンティフィック </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

分離、拡張、および cd31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

肥満は脂肪細胞の肥大によって主に脂肪組織の大規模な改造を伴います。極端な脂肪細胞成長は、インスリン、ローカル低酸素症および炎症に悪い応答が返される前駆細胞から機能的な白い脂肪細胞の分化を刺激し、脂肪細胞の人口の根本的な肥大を防ぐことができるしの削減とともにその結果、脂肪代謝の健康を改善できます。炎症。また、ベージュ/ブラウンの脂肪細胞の分化を刺激しと、全身のエネルギー消費量を増やすことができる減量、その結果します。このアプローチは、肥満 2 型糖尿病と心血管疾患などの併存の開発を防ぐことができます。
本稿では、分離、拡張、および共同 CD31 と CD34 のマーカーを表現するひと脂肪組織の血管内皮細胞のサブセットから白とベージュの脂肪細胞の分化をについて説明します。メソッドは、比較的安価ですし、労働集約的ではないです。人間の脂肪組織へのアクセスを必要として皮下のデポはサンプリングに適しています。このプロトコルの新鮮な脂肪組織は、病的肥満者からサンプル [ボディマス指数 (BMI) > 35] 肥満手術の手順中に収集されます。間質血管の一部から順次 immunoseparation を使用して、十分な細胞は、脂肪の 2-3 g ほどから生成されます。これらの細胞文化 10-14 日間で拡大することがでくことができますが, 凍結保存、通路 5-6 まで継と、脂肪細胞のプロパティを保持します。細胞は、脂肪細胞の ppar γ アゴニスト ロシグリタゾンとヒトインスリンの組み合わせを使ってカクテルを 14 日間扱われます。
この方法は脂肪の血管内皮細胞、脂肪細胞応答を駆動する分子メカニズムに関する実験についての証明書を取得するため使用ことができますまたは、脂肪細胞を強化することができます新しい薬物をスクリーニングするため応答指示ホワイトのどちらかベージュ/ブラウン脂肪細胞分化。小さな皮下のバイオプシーを使用して、この手法を使用して肥満と併存の治療のためベージュ/茶色と白色脂肪細胞を刺激することを目的とする臨床試験のための非レスポンダー科目を画面できます。

私達のプロトコルは CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織別拠点から血管細胞の脂肪分化能を決定するためのアプローチを提供することを目的します。簡単なフローチャート図は、図 1 a<p class="jove_conten...

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム アプリケーションを説明します。

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

この方法は、脂肪組織のリモデリング中に強力な脂肪形成反応を防ぐ主要な要因やメカニズムを特定するなど、肥満分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、少量の組織から始めて、ヒト脂肪組織からCD34+CD31+内皮細胞を単離できることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、脂肪形成刺激に応答するヒト脂肪血管系の細胞を特定したいと思ったときでした。この方法の視覚的なデモンストレーションは、新鮮なヒト脂肪組織へのアクセスが限られていることが多いため、細胞単離ステップの実践が困難であるため、非常に重要です。肥満手術を受けている被験者からヒトの軟部および皮下脂肪組織を採取します。組織抽出の直後に、ヒトのオトガイ組織と皮下脂肪組織を、ペニシリンストレプトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムのハンク緩衝塩溶液を含む別々のバイアルに保管します。組織抽出後にサンプルがラボに到着したら、70%エタノール綿棒のはさみとピンセットを使用して、組織の線維性および焼灼性切片を慎重に洗浄して除去します。脂肪組織の重量を量り、コラゲナーゼ消化のために5グラムのアリコートに分割します。2組のハサミを使用して、室温でシンチレーションバイアル中のコラゲナーゼ溶液5ミリリットルに5グラムの脂肪組織を細かく刻みます。ミンチ組織にさらに10ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加え、合計15ミリリットルにします。.サンプルを摂氏37度で1時間、水浴中で連続的に振とうします。分解後、サンプルを20ミリリットルの鈍い端のシリンジに注ぎます。250ミクロンのナイロンメッシュでサンプルを50ミリリットルの円錐管にろ過し、未消化組織から脂肪細胞と間質血管細胞を分離します。シンチレーションバイアルを10ミリリットルのKRBBSで洗い流し、フィルターに洗浄液を注いで残留細胞を収集し、ろ過したサンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、20ミリリットルのシリンジと20ゲージ×6インチのピペッティングニードルを使用して、間質血管画分層を除去し、きれいな50ミリリットルのコニカルチューブに移します。10ミリリットルのKRBBSを加え、サンプルを室温で5分間ベンチに置きます。両方のデポからの間質血管画分を氷上に置いて、さらに処理します。間質血管画分をGの500倍で摂氏4度で5分間回転させます。遠心分離機からサンプルを取り出し、上清を慎重に注ぎ、間質血管画分細胞を含むペレットを保持します。細胞ペレットを5ミリリットルのPBSに穏やかに再懸濁します。サンプルを再度回転させた後、上清を除去し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞をカウントします。サンプルを3回目にペレット化し、ペレットを100マイクロリットルのCD34分離バッファーに再懸濁します。10マイクロリットルのCD34カクテルを加え、サンプルを室温で15分間インキュベートします。次に、5マイクロリットルの磁気ビーズを加え、サンプルを室温で10分間インキュベートします。次に、各サンプルに2.5ミリリットルのCD34アイソレーションバッファーを加え、サンプルを磁石に室温で5分間入れます。磁石を5秒間反転させて、アイソレーションバッファを注ぎ出します。このプロセスを4回繰り返した後、チューブを磁石から取り外し、2ミリリットルのCD34アイソレーションバッファーを追加します。別の遠心分離に続いて、CD34+細胞ペレットを1ミリリットルのCD34分離バッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。細胞を再度ペレット化し、ペレットを250マイクロリットルのバッファーBおよび250マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。次に、チューブをボルテックスしてCD31ビーズを完全に再懸濁し、再懸濁した細胞ペレットに20マイクロリットルのCD31ビーズを加え、室温で30分間揺さぶってサンプルをインキュベートします。細胞を分離する前に、1ミリリットルの洗浄バッファーを添加してストレーナを平衡化します。次に、CD31ビーズに再懸濁した細胞の調製混合物をストレーナーに適用します。ストレーナーを5ミリリットルの洗浄バッファーで円を描くように、合計20ミリリットルで洗浄します。コネクタを滅菌済みの50ミリリットルの円錐形チューブに取り付け、ルールロックを閉じます。ストレーナをコネクタに取り付けた後、ストレーナの壁に沿って1ミリリットルの洗浄バッファを追加し、次にストレーナの壁に沿って1ミリリットルの活性バッファDを追加します。サンプルを穏やかに渦巻かせ、室温で10分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、ピペッティングで10回上下させて細胞をビーズから分離します。ルールロックを開き、切り離されたセルが50ミリリットルの円錐管に流れ込むのを待ちます。ストレーナーを毎回1ミリリットルの洗浄バッファーで10回洗浄します。コネクタとストレーナを廃棄し、サンプルをGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。最後に、細胞ペレットを2ミリリットルの完全EGM2培地に再懸濁して培養します。摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーター内の完全なEGM2培地を備えた6ウェル組織培養プレートで細胞を増殖させます。細胞が80〜90%のコンフルエントに達するまで、3〜4日ごとに培地を交換します。次に、約10万から20万個の細胞を6ウェルプレートに播種し、各デポに重複するウェルを確保し、それらを完全なEGM2培地で2日間培養します。2日後、成長培地を吸引します。メディアを 2 ミリリットルの DMEM/F-12 メディアと交換し、コントロール細胞の 5%FBS と 50 マイクログラム/ミリリットルのペニシリン ストレプトマイシンを使用します。治療細胞については、培地を2ミリリットルの脂肪形成培地と交換します。加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度で13日間インキュベートし、それぞれの培地を3〜4日ごとに交換します。培養中の2つの継代後のCD34+CD31+細胞の典型的な内皮の丸石のような形態を示す代表的な結果が示されています。また、マトリゲルで予想通りに培養すると、細胞が細管を形成する能力も実証されています。蛍光標識されたアセチル化LDLの均一な取り込みは、内皮同一性を有する均質な細胞集団の存在を示しています。ここに示されているのは、13日間の脂肪誘発後のCD34+CD31+細胞の中性脂肪滴のオイルレッドO染色です。3つの異なるヒト被験者のオトガイおよび皮下デポからの細胞の代表的な応答は、同じドナーの脂肪デポ間およびドナー間の脂肪形成誘導に対する応答の大きな変動性を示していることが示されています。この画像は、脂肪形成誘導後のCD34+C31+細胞の13日間の蛍光細胞内脂質染色を示しています。画像は、単房性脂質、多房性脂質、および脂質蓄積のない細胞を示しています。リアルタイムPCRでは、汎脂肪細胞マーカーのアディポネクチンとブラウンベージュのマーカーCIDEAとUCP-1の発現が示されています。これらの結果は、脂肪形成誘導後の細胞が、混合ホワイトベージュ脂肪細胞の表現型と一致する分子マーカーを発現することを裏付けています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試みるときは、収集され、2時間以上保存されていない新鮮な人間の脂肪組織を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、フローサイトメトリー、免疫組織化学、RT-PCRなどの他の方法を実行して、応答細胞の特定のサブセットを同定し、ベージュの茶色の脂肪細胞表現型を同定するために利用できる成熟脂肪細胞マーカーの発現を行うことができます。開発後、この技術は、肥満分野の研究者がヒトの脂肪組織、血管細胞、および脂肪形成の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、CD34+31+細胞の単離、培養、増殖の方法についてよく理解できるはずです。人間の組織を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、バイオセーフティ規制などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。この技術の意味は、潜在的な治療介入に対する細胞の脂肪形成反応を特定するため、インスリン抵抗性などの肥満に関連する併存疾患の治療にまで及びます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、マウスの大動脈周囲弓脂肪組織から蛍光標識された神経堤由来脂肪由来幹細胞(ADSC)を単離および培養する技術を示しています。単離後、NCADSCsを検出し、蛍光活性化細胞ソーティング法を用いて選別した後、プレート上で培養することで細胞増殖を促進します。...

マウス腹膜脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離

ヒト脂肪由来の間質細胞内の転写の不均一性は、細胞表面マーカーと骨形成遺伝子を使用して単一細胞レベルで定義することができます。...

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。...

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。...

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

蛍光活性化細胞選別を用いて、マウス上体脂肪パッドから生存性の高い脂肪前駆細胞を単離する簡単な方法を提示する。...

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。...

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

このプロトコルは、マウス脂肪デポーの解剖および内皮細胞集団を遊離させてから同定するためのそれぞれの動脈の単離および消化のための方法を詳述する。ダウンストリームアプリケーションで使用される新たに単離された細胞は、血管細胞生物学と血管機能障害のメカニズムの理解を促進します。...

下流アプリケーションのための異なる脂肪デポからの血管内皮細胞の分離と同定(英語)

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。...

マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。...

マウス精巣上体脂肪組織からの間葉系幹細胞の単離、In vitro拡大、および特性評価

成熟した脂肪細胞のサイズと脆弱性は、その研究と分離に利用できる技術とツールを制限しています。ここでは、成熟したマウス脂肪細胞の単離のためのプロトコルが記載されており、これは異なる脂肪貯蔵庫およびマウスの食事療法に容易に適応することができる。...

赤身および肥満マウスからの初代マウス脂肪細胞の単離と培養

学ぶ CD34+CD31+血管内皮細胞の分離・培養法。人の大網・皮下脂肪組織から少量サンプルで内皮細胞を単離し、白色・ベージュ脂肪細胞へ分化誘導する技術。肥満や代謝疾患の研究に応用可能。

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

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