Name: 斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学ぶ斜め走査レーザー眼底とOCTによるマルチモーダル網膜イメージング手法。ラットを用いた生体内三次元蛍光・断層像の同時取得により、血網膜関門破壊の定量化や毛細血管機能評価が可能となり、糖尿病網膜症などの診断に貢献する。

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ボストン医療センターとして NIH の 5R01CA183101 からサブ契約から資金調達・ エバンス医療財団からの資金調達、1UL1TR001430、BU ジョスリン パイロット プログラムおよび BU CTSI KL2TR001411 を付与する BU CTSI パイロット。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会 (ACUC) ボストン医療センターによって承認されています。
1. システムのセットアップ
<ol><li>オスロ システム<ol>
<li>システムの光源としてスーパーコンティ ニウム光源を使用します。<ol>
<li>ダイクロイック ミラー (DM1) によって高い波長 (nm 650-2000) から可視光域 (450-650 nm) を分離します。ビーム偏光ビームスプリッター (PBS) 通過後分散プリズムのペアでスペクトルを展開します。</li>
			<li>励起波長範囲 (475 495 nm) を選択するスリットを配置します。プリズム対にフィルター処理されたビームを反映し、シングル モード光ファイバー (SMF 1) に光をカップルに反射ミラーを使用します。</li>
			<li>分光計を使用して、シングル モード光ファイバーの出力波長選択を確認します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>シングル モード光ファイバーを図 2に示すように、2 つのカスケード接続された光ファイバーのカプラーに接続します。第 2 繊維のカプラーからファイバー出力ポートの 1 つはオスロ システムに光を提供します。</li>
		<li>オスロのシステムでレーザーをまずコリメートします。<ol>
<li>ガルバノ メーター ミラー (GM1) によってレーザーを偏向させます。中継 1:1 望遠鏡システムで 2 番目のガルバノ メーター ミラー (GM2) にレーザーと 3:1 望遠鏡システムによる眼の瞳に更にリレーします。</li>
			<li>蛍光信号を反映する 3:1 望遠鏡システム内のダイクロイック ミラー (DM2) をインストールします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>光軸をオフセットし、図 3に示すように、照明をスキャン斜めにカスタマイズされた鳩の尾スライダーで 3:1 望遠鏡システムとダイクロイック ミラー (DM2) をマウントします。キャリパーを使用して、必要に応じてオフセットの長さを正確に制御します。</li>
		<li>蛍光イメージング光学パス。<ol>
<li>ダイクロイック ミラーと遅いスキャン スキャン解除する 3 番目のガルバノ メーター ミラーへの中継による蛍光を反映してください。</li>
			<li>別の 1:1 の望遠鏡システムで、イメージングの対物レンズに光を中継します。翻訳段階で上記の光学系をインストールします。 注: 3 番目のガルバノ メーター ミラー イメージングを最適化するための自由度の冗長性を提供する (GM3) 下 2 つの付加的な翻訳段階にインストールされます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 つの自由度 (回転および翻訳の 2 つの軸) は、ステージの最終的なイメージング システムをマウントします。平面のカメラを使用すると、断面の蛍光画像をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光コヒーレンス断層撮影システム<ol>
<li>システムの光源として同じスーパーコンティ ニウム光源を使用します。<ol>
<li>残光 (650-2000 nm) から近い赤外線 (NIR) 範囲 (650 900 nm) を別のダイクロイック ミラー (DM3) によって区切ります。ロングパス フィルターを使用して、さらに 800 〜 900 nm に帯域幅を制限します。シングル モード光ファイバー (SMF 2) にビームをカップルします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>シングル モード光ファイバーを青いオスロ励起と結合する 2 つのカスケード接続された光ファイバーのカプラーの他の入力ポートに接続します。直接、変数減光フィルター (VNDF)、分散補償板と反射ミラーが 10 月参照アームに 2 つ目のファイバー結合器の 2 番目の出力ポートから光。 注: 参照の腕から返された光と目 2 番目の光カプラーで再結合され信号を収集する OCT 装置の開発。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データ集録<ol>
<li>LabVIEW で作成、OCTA7,8,9,10のスキャンのプロトコルから変更データ集録システム ソフトウェアを使用します。各 B-スキャン 500 ステップで歯は x を制御するアナログ出力ボード (AO1) によって出力 80% のデューティ サイクルを見た ' 高速スキャン ミラー、GM2。</li>
		<li>OCT のデータを取得する各ステップでライン スキャン カメラをトリガー ミラー走査方向前方の場合にのみ。17 μ s にライン スキャン カメラの露光時間を設定します。</li>
		<li>OCTA 信号を取得するには、同じ B スキャン場所で 5 回測定を繰り返します。</li>
		<li>50 kHz では 100 kHz で AO 出力レートと 10 月、a ラインを設定します。Y を制御 ' 遅いスキャン ミラー、GM1、ランプ波形によって。解除遅いスキャンをスキャンする GM1 と重複スキャン ミラー、GM3 を同期します。</li>
		<li>他のアナログ出力ボード各 y で 1 つの蛍光イメージをキャプチャする (AO2) によって平面のカメラをトリガー ' の場所。イメージのサイズをトリミングまたは bin に速度と必要に応じて感度を高めるための隣人ピクセル。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. システムの配置
<ol><li>青色励起波長を選択するオスロ光源でスリットを調整します。分光計を使用して周りにスペクトルの範囲を監視する 475-490 nm。</li>
	<li>〜 5 mm で光軸をシフトする鳩尾山スライダー調整します。これは ~1.7 mm、網膜上 ~ 15 ° の傾斜角度で生じるラット瞳孔でオフセットになります。</li>
	<li>同じ 5 mm 蛍光検出光学系の翻訳段階を調整します。</li>
	<li>最終的な蛍光イメージング ~ 30 ° にするシステムを調整します。</li>
	<li>力計を用いた光パワーを測定します。青いオスロ励振電力が 0.2 mW と網膜の損傷を発生しません 10 月レーザー パワー 0.8 mW であることを確認します。 注: は、ANSI 規格に基づき、網膜に最大限の寛容な露出 (MPE) のレベルでは 〜 可視光域に 2 mw7,8 。Deloriらによる式によると9MPE の近赤外線は可視光に比べて約 2 倍約 4 mW。</li>
</ol>3生体内で動物実験。
<ol><li>誘導室に 12 週間長いエバンス ラットを転送します。イソフルラン気化器によって 2 L/分の流量で 10 分間の酸素で 4.5% イソフルランとラットを麻酔します。<ol>
<li>すだれのピンチの中に逃避反射の欠如によって決定される麻酔の深さを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>誘導した後に、5 軸 (x、y、z の翻訳、ヨーおよびピッチ) ホルダーにラットを配置します。加熱ステージ、循環温水毛布や長期にわたる実験で他の適切な方法の使用によって補足熱を提供します。実験の残りの部分の間に 2 リットル/分の流量で isofluorane の 1.5% で麻酔を維持します。アクティブ排気誘導室を使用していない、誘導室はバック ドラフトまたは下降テーブル上またはイソフルランを清掃するシュノーケルの下に配置必要があります。</li>
	<li>2 分の 1% トロピカミド点眼液で瞳孔を散大させます。必要な場合は、追加のローカル麻酔ラットの目に 0.5% テトラカイン塩酸点眼液を適用します。実験中に少なくとも一度毎分商業人工涙液による保湿を離さない。</li>
	<li>フルオレセイン塩 (10%/w) や FITC を挿入 (10%/w) は滅菌生理食塩水で希釈 (0.1 0.3 mL) 1 mL で尾静脈注射器と 29 G 針。</li>
	<li>レーザー ソースを入れます。配置の間に青い光励起を減衰する中立的な密度のフィルターを配置します。~0.8 mW になるのに 10 月光と青い光の力を測る < 0.01 mW の白内障の形成を避けるために。</li>
	<li>ガルバノ スキャンと位置合わせモードを開始します。固定レーザーを角膜にスポットする目のボールの高さを調整します。~1.5 mm 程度に目の頂中央にレーザーをオフセットし、瞳孔の縁をレーザーにほぼ垂直になるようにラットの目の位置を調整します。</li>
	<li>さらに OCT 画像最適な品質に到達するまで動物のホルダーを調整します。X の ' 高速走査方向、断面 B スキャン画像がフラットに表示されることを確認してください。Y に切り替えるとき ' 低速走査方向、斜めの走査のために断面 B スキャン画像が傾いていることを確認します。</li>
	<li>青い光励起に中立的な密度のフィルターを削除し、カメラからリアルタイムを監視します。蛍光断面画像を示す血管異なる深さで表示になります。<ol>
<li>蛍光イメージング システム最適な焦点に到達するための最後のフォーカスを調整します。オスロの最適なイメージ品質に到達する横の面の目の位置の微調整を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>整列後同時オクタと体積フルオレセイン造影 (vFA) の取得を開始します。</li>
	<li>OCTA の Matlab によるオスロ体積のイメージを構築します。アルゴリズムは、以前詳細10で説明します。画像の領域分割による網膜血管の深さ分解を生成します。</li>
	<li>イメージングを完了するとレーザーをオフにする、動物の解放、目に眼軟膏を塗ると回復ボックスに動物を配置します。</li>
	<li>放置しないでください動物それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで、または施設の方針に従って。</li>
</ol>

<ol><li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li>
<li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4638169/">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+%28OCTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Retina+and+Vitreous%22%5BJournal%5D)">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li>
<li>Chen, C. -L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+based+angiography+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li>
<li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li>
<li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li>
<li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+%28ANSI+2000%29%2C+with+emphasis+on+ophthalmic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+a-Optics+Image+Science+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+%28oSLO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li>
</ol>

Ji 李は、オスロの保留中の特許を保持しています。他の著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

ここでは、オスロ、体内容積蛍光網膜視野 30 ° 以上でイメージングを説明しました。10 月、現在のイメージング法の眼科では、ケアの標準と比較してオスロ同様 3 D イメージング機能を提供しています、まだ蛍光コントラスト 10 月に敏感ではないことができます。オスロの利点はそれが 1 つだけラスター スキャンを必要とし、したがって構造と蛍光の体積イメージングの 2 つの相補的な技術を提供する 10 月のシームレスな組み合わせを使用できます。
このプロトコルでは良好な画像品質を取得する重要なポイントは、ネズミ目の透明度です。オスロ イメージが隠されている場合は、白内障形成があるかどうかを調べます。ケタミン ・ キシラジン麻酔、角膜乾燥、青色のライトに過剰露出などいくつかの要因は、白内障、画質大幅悪化の形成を引き起こすでしょう。白内障を防ぐためには、2 分以上の光を青に連続暴露を避ける角膜の乾燥; を防ぐために、少なくとも 1 分ごとの人工眼涙を適用します。少なくとも 30 秒間光を遮断してイメージング セクション間残りの部分に目ができます。
<p class...

眼科・視覚科学コンピューターの近代的な光学イメージング技術網膜を光で簡単にアクセスできるので恩恵を大きく。蛍光眼底イメージングは診断とどちらの主要な米国の失明の原因糖尿病網膜症 (DR) など加齢に伴う黄斑変性症 (AMD)、網脈絡膜血管の疾患の管理に不可欠なツールです。
しかし、まだ大きな視野 (FOV)、三次元 (3 D) 網膜蛍光イメージングを用いたイメージングを取得に挑戦です。眼底写真は深さを解決する機能がないと拡散光を拒否しません。結果として、異なる深さからの信号の混合と、画質が低下します。走査レーザー眼底検査 (SLO) と共焦点ゲート1を使用して拡散した光の効果を減らす共焦点 SLO (cSLO) することができます。ただし、SLO や cSLO の焦点深度の制限のため 3 D 人間の網膜像を取得することは困難です。補償光学 SLO (AOSLO) は、人間の目によって導入された波面収差を補正することにより最高の解像度とコントラストを提供できます。ただし、AOSLO 必要があります z スタッキング体積画像2。光コヒーレンス断層法 (OCT)3と 10 月血管造影 (OCTA) システムは三次元 (3 D) 解剖学的血管画像4,5,6、色素フリー自然を提供するこれらの制限を克服します。10 月の漏出血管機能不全を示すものを視覚化できません。
このプロトコルでは、3 D 容積蛍光網膜イメージング、すなわち斜め走査レーザー眼底検査 (オスロ) の新しいマルチ モーダル プラットフォームについて説明します。イメージング システム、鳩の尾スライダーによって生成される斜めスキャンと最終的なイメージング システムは断面画像クロス蛍光を検出する角度に配置されます。システムは、スキャン方法、レーザーを使用して、これらの技術補完体積構造イメージング法として OCT を使用の容易な組み込みを許可します。現在の深さ分解能はラット網膜の約 25 μ m、ビューのフィールドは 30 °。基本的に、オスロ 10 月の蛍光バージョンができ、10 月と同時に組み合わせることができます、大きな視野でオクタ。
このプロトコルではオスロ、配置と施工法、ラット網膜の生体内イメージングの方法と代表的な結果の設定を説明します。

<table><tbody><tr><td>スーパーコンティニュアムレーザー光源</td><td>NKTフォトニクス</td><td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー (DM1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP650R</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー (DM2)</td><td>Chroma</td><td>ZT514/1064rpc</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー (DM3)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP900R</td><td></td></tr><tr><td>シングルモードファイバー (SMF 1)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-460B-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>シングルモードファイバー(SMF 2)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-780A-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバーカプ</td><td>ラーThorlabs</td><td>TW850R5A2</td><td></td></tr><tr><td>1:1望遠鏡システム</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A&times;</td><td></td>2</tr><tr><td>3:1望遠鏡システム</td>ThorlabsAC254-150-A<td></td><td>&times;</td><td></td>2</tr><tr><td>3:1望遠鏡システム</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-50-A&times;</td><td></td></tr><tr><td>2ガルボミラー(GM1、GM2)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS201&times;</td><td></td>2</tr><tr><td>De-sacnガルボミラー(GM3)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズオ</td><td>リンパス</td><td>UplanSApo 20&times;/ 0.75</td><td></td></tr><tr><td>最終イメージングシステム</td>オ<td>リンパス</td><td>UplanFL N 10&��;/ 0.3</td><td></td></tr>最終<tr><td>イメージングシステム</td><td>Computar</td><td>12-36mm / 1:2.8</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>PCO</td><td>Pco.pixelfly usb</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>ソーラブ</td><td>FEL0800</td><td></td></tr><tr><td>搭載 無段変速NDフィルター</td> ソー<td>ラブ</td>ス <td>NDC-50C-4M-A</td><td></td></tr><tr><td>ラインスキャンカメラ</td> ソー<td>ラブ</td>ス <td>SPL2048-140K</td><td></td></tr><tr><td>アナログ出力ボード (AO1)</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>PCI-6731</td><td></td></tr><tr><td>アナログアウトプットボード (AO2)</td><td>ナショナルインスツルメン</td>ツ <td>PCIe-6351</td><td></td></tr><tr><td>ロングパスフィルター</td><td>ソーラブ</td><td>ス FEL0800</td><td></td></tr></tbody></table>

斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (oct) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

眼科では蛍光イメージングを用い、広い視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光網膜像はまだ z 積み重ねが必要になりますので、画像診断の最新網膜における最大の課題体積データセットをコンパイルします。新しい光コヒーレンストモグラフィ (OCT) と 10 月 (OCTA) 血管造影システム三次元 (3 D) 解剖学的血管画像を提供するためにこれらの制限を克服するが、10 月の色素フリー自然漏出血管を示すために視覚化できません。機能不全。このプロトコルでは、走査レーザー眼底検査 (オスロ) 3 D 容積蛍光眼底イメージングを提供する新しい斜めについて説明します。イメージング システムのセットアップは鳩の尾のスライダーによってスキャン斜めを生成し、蛍光断面画像を検出する角度で最終的なイメージング システムを配置します。スキャン方式、レーザーが使用され、したがって、相補的な体積構造イメージング法として 10 月の容易な組み込みを使用できます。ラット網膜のin vivoイメージングを次に紹介します。フルオレセインのソリューションは、容積血管造影 (vFA) を生成する静脈内注入されます。

図 4 aは、ラット網膜の断面の OCT 画像を示しています。図 4b-4 cは同時取得オクタとオスロの vFA の同じ網膜の断面の画像を表示します。オスロを有効断面 FA 10 月 B-スキャンに似ています。オクタと比較してオスロ vFA の断面画像を神経線維層 (NFL) の神経節細胞層 (GCL)、血管と毛細血管外網状層 (OPL) で明確に識別します。図 4 dと4 gは、オクタとオスロの vFA イメージの浅層を示しています。異なり、オクタ、オスロ vFA イメージ (図 4 g) は蛍光発光のコントラストを利用して運動の成果物 (図 4 dの縦ストライプ) を回避できます。オスロ vFA (<str...

ここでは、新規イメージングのマルチ モーダルなプラットフォームを使用して大規模な視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光と OCT 網膜像を取得するためのプロトコルを提案する.システム セットアップ、配置の方法と運用のプロトコルを紹介します。In vivoイメージングが実証されると代表の結果が提供されます。

斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

この方法は、眼科および網膜イメージングの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。血液網膜関門破壊と網膜毛細血管機能のイメージングと定量化など。この技術の主な利点は、1回のラスタースキャンで斜め走査レーザーを使用することにより、広い視野、3次元、マルチコントラスト網膜イメージングを取得できることです。この技術の意味は、糖尿病性網膜症やその他の網膜前疾患の診断にまで及びます。なぜなら、oSLOは、3Dで単一の毛細血管に至るまで、網膜微小血管系の高コントラスト画像を取得できるからです。この方法は、網膜イメージングに関する洞察を得ることができますが、従来の対物レンズを使用する他のイメージングシステムにも適用できます。マウス皮質のin vivoイメージングなど。スーパーコンティニュアムレーザー光源は、斜め走査型レーザー検眼鏡検査(oSLOセットアップ)のシステムレーザー光源として使用されます。可視光範囲は、最初のダイクロイックミラーによって高波長範囲から分離されます。光スペクトルは、ビームが偏光ビームスプリッターを通過した後、一対の分散プリズムで拡大されます。スリットは、励起波長範囲を選択するために使用されます。また、反射ミラーは、フィルタリングされたビームをプリズムペアに反射して、光をシングルモードファイバーに結合します。分光器を使用して、シングルモードファイバーの出力での波長選択を確認します。シングルモードファイバは、カスケード接続された2つの光ファイバカプラーに接続されています。2 番目のファイバー カプラーからのファイバー出力ポートの 1 つは、光を oSLO システムに供給します。oSLOシステムでレーザーをコリメートするために、レーザーはガルバノミラーによって偏向されます。1対1の望遠鏡システムはレーザーを2番目の検流計ミラーに中継し、3対1の望遠鏡システムはさらにレーザーを目の瞳孔に中継します。3対1の望遠鏡システム内のダイクロイックミラーは、蛍光信号を反射します。3対1の望遠鏡システムとダイクロイックミラーは、カスタマイズされたダブテールスライダーに取り付けられており、光軸をオフセットして斜めのスキャン照明を作成します。斜め照明により、セクショニングを必要とせずに体積蛍光イメージングが可能です。レーザーをオフセットすることにより、斜めビームが網膜に集束され、斜め検出により、斜めビーム経路に沿って断層撮影蛍光画像をキャプチャできます。蛍光イメージングの光路を作成するために、蛍光はダイクロイックミラーによって反射され、3番目のガルバノミラーに中継されます。次に、蛍光灯は、別の1対1の望遠鏡システムによってイメージング対物レンズに中継されます。3 番目のガルバノメーターミラーの下には、画像を最適化するための自由度の冗長性を提供するために、2 つの追加の並進ステージが設置されています。最終的なイメージングシステムは、3つの自由度を持つステージに取り付けられます。回転、および2つの並進軸。平面カメラを使用して、断面蛍光画像を撮影します。別のダイクロイックミラーは、背面の赤外線範囲を残りの光から分離します。ロングパスフィルターを使用して、帯域幅をさらに800〜900ナノメートルに制限します。ビームをシングルモードファイバーに結合します。シングルモードファイバは、カスケード接続された2つの光ファイバカプラーの他の入力ポートに接続され、青色のoSLO励起と結合します。2 番目のファイバー カプラーの 2 番目の出力ポートからの光は、OCT リファレンス アームに向けられます。分散補償プレート、可変減光フィルター、反射ミラーを備えています。リファレンスアームとアイからの光は、2番目の光ファイバーカプラーで再結合し、OCT分光器に送られて信号が収集されます。Labviewで作成され、スキャンOCTAスキャンプロトコルから変更されたデータ収集システムソフトウェアを使用します。各b-スキャンについて、500ステップの80%デューティサイクルの鋸歯状がアナログ出力ボードによって出力され、x-prime高速スキャンミラーを制御します。各ステップでラインスキャンカメラをトリガーして、ミラーが前方スキャン方向にある場合にのみ、OCTのデータを取得します。ラインスキャンカメラの露光時間を17マイクロ秒に設定します。OCTA信号を集録するには、同じb-スキャン位置で測定を5回繰り返します。AO 出力レートを 100 キロヘルツに設定し、OCT A ライン レートを 50 キロヘルツに設定します。yプライム低速走査ミラーGM1をランピング波形で制御します。デスキャンミラーGM3をGM1と同期して、低速スキャンをデスキャンします。別のアナログ出力ボードで平面カメラをトリガーして、各yプライム位置で1つの蛍光画像をキャプチャします。イメージングサイズを切り抜くか、隣接するピクセルをビン化して、必要に応じて速度と感度を上げます。まず、デジタル内ピンチ時の離脱反射の欠如により、ラットの適切な麻酔レベルを確認します。麻酔導入後、ラットをホルダーに置きます。ノーズコーンを取り付けて、実験の残りの部分で麻酔を維持します。局所麻酔のためにラットの眼に5テトラカイン塩酸塩点眼液を塗布します。次に、1%トロピカミド点眼液で瞳孔を拡張します。2分間の拡張後、1ミリリットルの注射器と29ゲージの針を使用して、生理食塩水で希釈した10%フルオレセインまたは10%FITCを尾静脈から注入します。次に、レーザー光源をオンにし、配向中の青色光励起を減衰させるために減光フィルターを配置します。ブルーライトのパワーを測定し、10マイクロワット未満であることを確認します。次に、光コヒーレンストモグラフィーライトに切り替えて、8ミリワットに近いことを確認します。レーザーの方向を制御するために使用される検流計ミラーへの電源をオンにします。眼球の高さを調整して、角膜に静止したレーザースポットを作成します。瞳孔の縁がレーザーに対してほぼ垂直になるように、目の位置を調整します。そして、レーザーを目の頂端中心から約1.5ミリメートルにオフセットします。光干渉断層撮影画像が最適な品質に達するまで、アニマルホルダーをさらに調整します。x-prime高速スキャン方向では、断面のb-スキャン画像が平らに見えることを確認してください。y-primeスロースキャン方向に切り替えるときは、斜めスキャンにより断面のb-スキャン画像が傾いていることを確認してください。青色光励起の減光フィルターを取り外します。また、カメラからのリアルタイムフィードを監視します。断面の蛍光画像が表示され、さまざまな深さの血管が表示されます。最終的な蛍光イメージングシステムの焦点を調整して、最適な焦点に到達します。また、側面の目の位置を微調整して、最適な斜め走査型レーザー検眼鏡の画質を実現します。アライメント後、同時光干渉断層撮影血管造影と体積フルオレセイン血管造影の取得を開始します。この画像は、ラット網膜の断面光干渉断層撮影画像を示しています。これは、同じ領域の光干渉断層撮影血管造影法、またはOCTA画像です。また、斜め走査型レーザー検眼鏡検査および体積フルオレセイン血管造影法、画像横断型フルオレセイン血管造影法、またはoSLO-VFA。光干渉断層撮影法b-scanに類似しています。OCTAと比較して、斜め走査型レーザー検眼鏡検査と体積フルオレセイン血管造影の断面画像は、外側の網状層の毛細血管を明確に識別します。網膜の表層は、ここではOCTA画像で示されています。縦縞の形のアーティファクトが画像に見えます。oSLO-VFAは、蛍光発光コントラストを利用してモーションアーティファクトを回避します。網膜中間層内では、垂直に潜る血管がoSLO FA画像にはっきりと示されています。しかし、OCTAでは明らかではありません。この手順を試みるときは、2分以上目への継続的なレーザー曝露を避けることが重要です。角膜の乾燥を避け、光を遮断して、イメージングセクション間で少なくとも30秒間目を休ませます。.この手順に続いて、遺伝子改変マウスをイメージングして蛍光タンパク質を発現させるなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。例えば、特定の網膜細胞の種類がどのように変化するか、既知の疾患で過去に見られる変数を引っ張ることなどです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

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