斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

ここでは、新規イメージングのマルチ モーダルなプラットフォームを使用して大規模な視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光と OCT 網膜像を取得するためのプロトコルを提案する.システム セットアップ、配置の方法と運用のプロトコルを紹介します。In vivoイメージングが実証されると代表の結果が提供されます。

この方法は、眼科および網膜イメージングの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。血液網膜関門破壊と網膜毛細血管機能のイメージングと定量化など。この技術の主な利点は、1回のラスタースキャンで斜め走査レーザーを使用することにより、広い視野、3次元、マルチコントラスト網膜イメージングを取得できることです。

この技術の意味は、糖尿病性網膜症やその他の網膜前疾患の診断にまで及びます。なぜなら、oSLOは、3Dで単一の毛細血管に至るまで、網膜微小血管系の高コントラスト画像を取得できるからです。この方法は、網膜イメージングに関する洞察を得ることができますが、従来の対物レンズを使用する他のイメージングシステムにも適用できます。

マウス皮質のin vivoイメージングなど。スーパーコンティニュアムレーザー光源は、斜め走査型レーザー検眼鏡検査(oSLOセットアップ)のシステムレーザー光源として使用されます。可視光範囲は、最初のダイクロイックミラーによって高波長範囲から分離されます。

光スペクトルは、ビームが偏光ビームスプリッターを通過した後、一対の分散プリズムで拡大されます。スリットは、励起波長範囲を選択するために使用されます。また、反射ミラーは、フィルタリングされたビームをプリズムペアに反射して、光をシングルモードファイバーに結合します。

分光器を使用して、シングルモードファイバーの出力での波長選択を確認します。シングルモードファイバは、カスケード接続された2つの光ファイバカプラーに接続されています。2 番目のファイバー カプラーからのファイバー出力ポートの 1 つは、光を oSLO システムに供給します。

oSLOシステムでレーザーをコリメートするために、レーザーはガルバノミラーによって偏向されます。1対1の望遠鏡システムはレーザーを2番目の検流計ミラーに中継し、3対1の望遠鏡システムはさらにレーザーを目の瞳孔に中継します。3対1の望遠鏡システム内のダイクロイックミラーは、蛍光信号を反射します。

3対1の望遠鏡システムとダイクロイックミラーは、カスタマイズされたダブテールスライダーに取り付けられており、光軸をオフセットして斜めのスキャン照明を作成します。斜め照明により、セクショニングを必要とせずに体積蛍光イメージングが可能です。レーザーをオフセットすることにより、斜めビームが網膜に集束され、斜め検出により、斜めビーム経路に沿って断層撮影蛍光画像をキャプチャできます。

蛍光イメージングの光路を作成するために、蛍光はダイクロイックミラーによって反射され、3番目のガルバノミラーに中継されます。次に、蛍光灯は、別の1対1の望遠鏡システムによってイメージング対物レンズに中継されます。3 番目のガルバノメーターミラーの下には、画像を最適化するための自由度の冗長性を提供するために、2 つの追加の並進ステージが設置されています。

最終的なイメージングシステムは、3つの自由度を持つステージに取り付けられます。回転、および2つの並進軸。平面カメラを使用して、断面蛍光画像を撮影します。

別のダイクロイックミラーは、背面の赤外線範囲を残りの光から分離します。ロングパスフィルターを使用して、帯域幅をさらに800〜900ナノメートルに制限します。ビームをシングルモードファイバーに結合します。

シングルモードファイバは、カスケード接続された2つの光ファイバカプラーの他の入力ポートに接続され、青色のoSLO励起と結合します。2 番目のファイバー カプラーの 2 番目の出力ポートからの光は、OCT リファレンス アームに向けられます。分散補償プレート、可変減光フィルター、反射ミラーを備えています。

リファレンスアームとアイからの光は、2番目の光ファイバーカプラーで再結合し、OCT分光器に送られて信号が収集されます。Labviewで作成され、スキャンOCTAスキャンプロトコルから変更されたデータ収集システムソフトウェアを使用します。各b-スキャンについて、500ステップの80%デューティサイクルの鋸歯状がアナログ出力ボードによって出力され、x-prime高速スキャンミラーを制御します。

各ステップでラインスキャンカメラをトリガーして、ミラーが前方スキャン方向にある場合にのみ、OCTのデータを取得します。ラインスキャンカメラの露光時間を17マイクロ秒に設定します。OCTA信号を集録するには、同じb-スキャン位置で測定を5回繰り返します。

AO 出力レートを 100 キロヘルツに設定し、OCT A ライン レートを 50 キロヘルツに設定します。yプライム低速走査ミラーGM1をランピング波形で制御します。デスキャンミラーGM3をGM1と同期して、低速スキャンをデスキャンします。

別のアナログ出力ボードで平面カメラをトリガーして、各yプライム位置で1つの蛍光画像をキャプチャします。イメージングサイズを切り抜くか、隣接するピクセルをビン化して、必要に応じて速度と感度を上げます。まず、デジタル内ピンチ時の離脱反射の欠如により、ラットの適切な麻酔レベルを確認します。

麻酔導入後、ラットをホルダーに置きます。ノーズコーンを取り付けて、実験の残りの部分で麻酔を維持します。局所麻酔のためにラットの眼に5テトラカイン塩酸塩点眼液を塗布します。

次に、1%トロピカミド点眼液で瞳孔を拡張します。2分間の拡張後、1ミリリットルの注射器と29ゲージの針を使用して、生理食塩水で希釈した10%フルオレセインまたは10%FITCを尾静脈から注入します。次に、レーザー光源をオンにし、配向中の青色光励起を減衰させるために減光フィルターを配置します。

ブルーライトのパワーを測定し、10マイクロワット未満であることを確認します。次に、光コヒーレンストモグラフィーライトに切り替えて、8ミリワットに近いことを確認します。レーザーの方向を制御するために使用される検流計ミラーへの電源をオンにします。

眼球の高さを調整して、角膜に静止したレーザースポットを作成します。瞳孔の縁がレーザーに対してほぼ垂直になるように、目の位置を調整します。そして、レーザーを目の頂端中心から約1.5ミリメートルにオフセットします。

光干渉断層撮影画像が最適な品質に達するまで、アニマルホルダーをさらに調整します。x-prime高速スキャン方向では、断面のb-スキャン画像が平らに見えることを確認してください。y-primeスロースキャン方向に切り替えるときは、斜めスキャンにより断面のb-スキャン画像が傾いていることを確認してください。

青色光励起の減光フィルターを取り外します。また、カメラからのリアルタイムフィードを監視します。断面の蛍光画像が表示され、さまざまな深さの血管が表示されます。

最終的な蛍光イメージングシステムの焦点を調整して、最適な焦点に到達します。また、側面の目の位置を微調整して、最適な斜め走査型レーザー検眼鏡の画質を実現します。アライメント後、同時光干渉断層撮影血管造影と体積フルオレセイン血管造影の取得を開始します。

この画像は、ラット網膜の断面光干渉断層撮影画像を示しています。これは、同じ領域の光干渉断層撮影血管造影法、またはOCTA画像です。また、斜め走査型レーザー検眼鏡検査および体積フルオレセイン血管造影法、画像横断型フルオレセイン血管造影法、またはoSLO-VFA。

光干渉断層撮影法b-scanに類似しています。OCTAと比較して、斜め走査型レーザー検眼鏡検査と体積フルオレセイン血管造影の断面画像は、外側の網状層の毛細血管を明確に識別します。網膜の表層は、ここではOCTA画像で示されています。

縦縞の形のアーティファクトが画像に見えます。oSLO-VFAは、蛍光発光コントラストを利用してモーションアーティファクトを回避します。網膜中間層内では、垂直に潜る血管がoSLO FA画像にはっきりと示されています。

しかし、OCTAでは明らかではありません。この手順を試みるときは、2分以上目への継続的なレーザー曝露を避けることが重要です。角膜の乾燥を避け、光を遮断して、イメージングセクション間で少なくとも30秒間目を休ませます。.

この手順に続いて、遺伝子改変マウスをイメージングして蛍光タンパク質を発現させるなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。例えば、特定の網膜細胞の種類がどのように変化するか、既知の疾患で過去に見られる変数を引っ張ることなどです。