レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

その機能が生物の老化に影響を与える何百もの遺伝子が特定されています。しかし、彼らの関係の多くはよく理解されていません。この方法は、老化分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

つまり、gerA遺伝子間の遺伝的相互関係は何ですか?この手法の主な利点は、スループットの増加であり、同時に定量的に測定できる遺伝的プレディションの数が少なくとも一桁増加します。この手順で収集された寿命データは、この出版物で提供されているソフトウェアを使用してプロットおよび分析できます。

この方法は、寿命に関する洞察を提供するだけでなく、ストレス耐性や健康保険の変更など、他の加齢に関連する表現型にも適用できます。この手順では、RNAi サブライブラリの新しいスタンプを作成します。まず、96ウェルプレートの各ウェルに、200マイクロリットルのLBとアンピシリンを充填し、12チャンネルピペッターを使用します。

96ピンプレートリプリケーターを50%漂白剤に順次浸し、続いて超純水に浸して滅菌します。次に、先端をエタノールに浸し、先端を慎重に炎にかけます。次に、凍結した96ウェルグリセリンストックライブラリープレートの接着ホイルカバーを慎重に取り外し、滅菌したプレートリプリケーターの先端を、まだ凍結しているグリセロールストックのウェルに優しく、しかししっかりと粉砕します。

次に、培養物に接種し、接種したプレートを透過性膜で密封します。ベンチトップで一晩培養物が成長するのを待ちます。翌日、プレートリプリケーターを滅菌し、一晩の培養からシールを慎重に取り除き、レプリケーターピンの先端を浸します。

次に、長方形のLBアンピシリンとテトラサイクリン寒天プレートにピンを接種します。均等な圧力をかけ、小さな円運動を使用して、スポットが密集しすぎないように細菌を移動させます。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、レプリカプレートが10枚必要になるごとに、深ウェル96ウェルプレートの各ウェルに1.5ミリリットルのLBをアンピシリンでロードします。次に、培養した細菌をウェルに接種します。その後、プレートを通気性のあるメンブレンで密封し、振とうしながら20時間培養します。

コントロールウェルは96ウェル全体に散在させるべきであり、96ウェルサブライブラリープレートが24のグループに分割されると、24ウェルの各分割には各コントロールが1つずつある。翌日、120マイクロリットルの培養物を、チップ間隔を調整できる6ウェルマルチチャンネルピペットを使用して、24ウェルプレートにロードします。次に、すべての液体が吸収されるまで、層流フードで覆われていないプレートを乾燥させます。

過度に乾燥させないでください。液体培養物を分注する際には、適切な細菌培養物が24ウェルプレートの適切なウェルに確実に入れられるように、焦点を合わせてください。レプリカセットの実験は、それぞれに同じ細菌RNAiクローンを播種した、独立した24ウェル複製プレートのセットから始まります。

寿命実験では、各プレートウェルに15〜20匹のL1動物を加え、L4段階まで成長させます。L4では、FUdRが反復全体のすべてのウェルに追加されます。同じ日の後半に、セットからレプリケートプレートを取り出し、最初のタイムポイントとしてスコアを付けることができます。

寿命を延ばすために、プレートのウェルに液体を加えて動物の動きを誘発します。動き出さない動物は、ワームピックで優しく突かれます。その後、動物の総数と死亡した動物の数が記録されます。

その後、最初の観測からのプレートは破棄されます。次の観察時点で、セットから別の複製プレートが取得され、同様の方法で採点されます。これは、決定されたスコアリング間隔で繰り返されます。

毎回、レプリケートセットから新しいプレートを使用します。生き残った動物がいなくなるまで、プレートのセットにスコアリングを続けます。まず、従来の寿命アッセイに使用されたのと同じ漂白剤ベースの調製法で、動物の集団を同期させます。

次いで、6ウェル間隔調整可能なピペットおよび試薬リザーバーを用いて、調製した24ウェルプレートの各ウェルに15〜20匹のL1動物を播種する。プレートに播種しながら、L1動物を定期的に溶液に混合して、均一な分布を維持します。さて、動物たちをL4に成長させます。このプロトコルでは、L4 開発のタイミングを知っておく必要があります。

ワームの発生を定期的に監視します。動物がL4に到達したら、各ウェルに24マイクロリットルの50x FUdRを加え、プレートをインキュベーターに戻します。L4動物を使用することは非常に重要です。

雌雄同体がFUdRを追加する前に生殖成熟に達した場合、彼らの子孫は生き残って食物を食べます。逆に、FUdRを早く追加しすぎると、動物が破裂します。目的の時点で、1つのリピートプレートを使用して生存率をスコアリングします。

これを行うには、M9溶液で井戸を浸水させます。生存率を毎日採点する前に、餌がない井戸、汚染されているように見える井戸、または形態学的または発達上の欠陥を持つ動物がいる井戸をセンサーします。各ウェルについて、ウェルごとの動物の総数を記録し、ワームピックで各頭にそっと触れて、動かないワームの状態を確認します。

プレート内の動かない死者をすべて数えた後、プレートを捨てます。この手順では、変換された e を成長させます。大腸菌をLBでアンピシリンと一晩。

翌日、3, 000 Gで15〜20分間遠心分離して細菌を濃縮します。細菌を開始容量の1/10に再懸濁します。次に、200マイクロリットルの10xバクテリアを6センチメートルのプレートに分注します。

試験条件ごとに3枚または4枚のプレートを用意し、汚染の場合に備えて2枚のプレートを追加で含めます。すべての液体が吸収または蒸発するまで、層流バッチでプレートを乾燥させます。乾燥したら、プレートをプラスチックの箱に室温で一晩保存し、二本鎖RNA産生を誘導します。

その後、プレートを摂氏4度で最大2週間保管します。動物については、M9で妊娠した成体動物を集めます。M9で2回洗います。吸引でスピンを繰り返す。次に、C.elegansを4ミリリットルのM9に再懸濁し、2ミリリットルの次亜塩素酸塩溶液を追加します。

次に、すぐにワームを3分間渦巻き、定期的かつ激しく振とうします。次に、解剖顕微鏡で卵の雲を探します。雲が見えない場合は、ワームをさらに10〜20秒間渦巻きます。

次に、前と同じようにM9で卵をすばやく2回洗います。そして、洗った卵を3ミリリットルのM9に再懸濁します。次に、卵を新しい15ミリリットルのチューブに移し、摂氏20度でチューブを穏やかに回転させてインキュベートし、胚を一晩孵化させます。翌日、10マイクロリットルの3滴でマイクロリットルあたりのL1の平均数を計算することにより、調製したL1溶液の密度を決定します。

準備したバクテリア播種プレートに、それぞれ50匹のL1動物を入れます。胚がL4段階に成長するまで、プレートを20°CのCelsuisインキュベーターにセットします。L1からL4への通常の発達には約40時間かかります。

次に、子孫の生成を防ぐために、各プレートに160マイクロリットルの50x FUdRを追加します。次に、寿命は通常、雌雄同体でのみ測定されるため、オスを削除します。完了したら、プレートを20°Cのインキュベーターに再梱包します。

すべてのワームが死ぬまで、毎日彼らの生存率をスコアリングします。これを行うには、動かない各線虫を頭の上のプラチナワイヤーまたはまつげでそっと触れます。非反応性の動物は死んでいるため、プレートから取り除く必要があります。

このルーチン中の異常に注意してください。レプリカセットと従来の方法でC.elegansの寿命をアッセイすると、野生型のN2動物でも同様の結果が得られます。例えば、mml-1またはmxl-2の摂食ベースのRNAiノックダウンは、正常な寿命を有意に短縮しました。

これは、従来の寿命アッセイとレプリカセットアッセイの両方によって測定されました。また、寿命の延長も検出できます。ここで見られるように、mdl-1またはmxl-1のRNAiは、どちらの方法で測定しても、C.エレガンスの寿命を有意に延ばしました。

レプリカセット法を使用すると、100を超える条件で寿命の変化を同時に定量化することができますが、これは従来のアプローチでは合理的ではありません。例えば、ゲノムワイドな摂食ベースのRNAiスクリーニングにより、daf-2インスリン様シグナル伝達の減少による寿命の延長に必要な159個の遺伝子が同定されました。インスリン様シグナル伝達とこれらの遺伝子との関係は、動物の健康状態を測定することによってさらに説明されました。

健康状態は、溶液中に懸濁したときにc.エレガンスがスラッシングすることによって示されました。このビデオを見れば、摂食ベースのRNAiを使用してC.Elegansの寿命を測定する方法についてよく理解できるはずです。

しかし、RNAiは汎用性が高く、さまざまな表現型に適用することができます。レプリカセット法を習得すると、適切に実行されれば、毎日100を超えるRNAiクローンの寿命を評価できます。早期および後期のポイントをすばやく獲得できます。

井戸の中のすべての動物は、生きて動いているか、死んでいるかのどちらかです。採点には、動物が死に始めるときに最も時間がかかります。このことを念頭に置いて、独立した試験の設定をずらします。