Name: レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶレプリカセット法を用いたC. elegansの寿命と健康寿命の定量的測定手法。高スループットで遺伝的条件をスクリーニングし、老化メカニズムの理解を深める。

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本稿で説明するこの作業によって提供された資金: ロチェスター大学事務所の学長、医学部と歯学研究科長のオフィスで健康科学センターの計算技術革新 (HSCCI);エリソン医療財団新しい学者エージング フェローシップ (AG-NS-0681-10) の資金提供者に役割研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備したないです。

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA+%5B10%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA [10].</a> Nature. 395 (6705), 854(1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2000).</li>
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<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).</li>
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<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Petrascheck, M., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Analysis+of+Lifespan+Experiment+Reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility.</a> Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+Genes+Regulating+Longevity+Using+Enhanced+RNAi-sensitive+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from:
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<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
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<li>Ogg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fork+head+transcription+factor+DAF-16+transduces+insulin-like+metabolic+and+longevity+signals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans.</a> Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).</li>
<li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+tied+to+endocrine%2C+metabolic%2C+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PloS one. 9 (1), e85964(2014).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li>
<li>Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+regulate+both+development+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).</li>
<li>Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+TGF-beta+Dauer+pathway+regulates+longevity+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling.</a> Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worming+pathways+to+and+from+DAF-16%2FFOXO%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Worming pathways to and from DAF-16/FOXO.</a> Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).</li>
<li>Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16%3A+An+HNF-3%2Fforkhead+family+member+that+can+function+to+double+the+life-span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans.</a> Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).</li>
<li>Hosono, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+growth+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+by+5-fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine.</a> Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).</li>
<li>Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Yu, S., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+signaling+comes+of+age%3A+Promotion+of+healthy+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).</li>
<li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormScan%3A+A+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormFarm%3A+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

従来およびレプリカ セット メソッドでは、年代順に老化させた動物の同期必要があります。我々 は、妊娠の大人の受精卵のみが治療を生き残るため妊娠大人の次亜塩素酸処理を使用して動物を同期するメソッドを含めます。これらの胚は液体懸濁液で孵化し、幼生期 (L1) で逮捕発達。食糧 (例えば大腸菌発現に dsRNA 興味の遺伝子) に L1 動物, 播種後の動物は開発を再開します。残りのシードされていない L1 動物を凍結および液体窒素または-80 ° C のフリーザーに無期限に保存できる利点がある妊娠大人の次亜塩素酸処理による L1 動物の同期します。このように、将来の研究のための貴重なリソースを作成して再現性の向上、実験のセットアップの時に各菌株のサンプルが保持されます。しかし、妊娠の大人動物の次亜塩素酸治療老化研究22同期の動物を取得する一般的な方法ですが、L1 の逮捕は飢餓応答。したがって、いくつかの研究所は、プレート上で発生する次亜塩素酸治療を全体で断念し、(すなわち卵を産む) いくつかの時間のため卵を産む数妊娠大人孵化できるようにいず...

高齢化の遺伝的基盤の理解に向けて最もトランスフォーマティブ技術の進歩の 1 つだった供給ベース RNAi線虫1の開発RNAi の実験的使用、する前に老化の多くの表現型は遺伝的扱いでした。RNAi の供給ベース、エシェリヒア属大腸菌の一致する内 dsRNA の生産によって達成される、内因性線虫mRNA: IPTG どちらかc. の elegansの cDNA を挿入またはの部分間で双方向の転写を誘導する、プラスミド2内で開いたリーディング ・ フレーム。C. の elegansをそのまま食らうとき細菌エシェリヒア属大腸菌、 dsRNA は内腔から SID 2 膜貫通型蛋白3、腸細胞に運ばれ、SID 14を介して動物の残りの部分を通して配布されます。各セル内外因性 dsRNA によって処理される複雑なダイサー、siRNA に新しいを作成する基本の相補的なペアリングを介して成熟した mRNA と関わりを持つ siRNA mRNA 二重。この二重が RISC の複合体によって認識され、切断され、それにより内在性 mRNA5を分解します。したがって、プラスミッド挿入を変更しただけ、線虫ゲノム内のほぼすべての遺伝子の機能を非アクティブ化することができます 1 つ。ライブラリ-コレクションの変換大腸菌株の約 86% のカバレッジを達成するために組み合わせることのできるいくつかの大規模な供給ベースの RNAi の作成をもたらしたこの発見にc. の elegans遺伝子6,が知られています。7。
我々 参照してくださいときに (WormBase のキュレーション RNAi 表現型の関連付けによって証明される) ように不活化、寿命を変える以上 900 の遺伝子の発見につながっている線虫の包括的なスクリーン供給ベースの RNAi の進歩により、以来gerogenes として。長寿コントロールの gerogenes の大半のための役割はちょうど少数の精液レポートでの RNAi の供給ベースを介して発見された (詳細については図 1Aと補足ファイル 1を参照)。いくつかの場合、これらの gerogenes は、RNAi 治療と寿命の変化の定量化が可能な測定を提供するために失敗する 1 つまたはいくつかの時点での生存率の測定に基づく同定されています。他のケースでこれらの遺伝子は寿命だけでなく、追加の加齢に伴う表現型の変化の定量的評価されている.例えば、我々 は以前通常と増加寿命減少インスリン/IGF-1 伝達を持つ動物のために必要な healthspan の変化を定量化 159 の遺伝子を識別しました。損失老化8の 1 つ以上の兆候として、これらの 103 の遺伝子不活 progeric 表現型の結果します。
いくつかの gerogenes は、100 以上の研究 (daf 16、daf 2、サー 2.1 など) と関連付けられている、以上 400 gerogenes 10 個以下の引用 (図 1 b、および補足のファイル 2) あります。したがって、包括的な供給ベース RNAi 画面が発見し、cursorily 推定 gerogenes の何百もの特徴、どのように寿命コントロールでこれらの遺伝子の機能とそれらの遺伝子産物の遺伝的相互関係まま悪い勉強しました。加齢に伴う表現型に対する完全縦断的分析 gerogenes (例えば間相互作用、asynthetic 相互作用など)の間の遺伝子相互作用を識別するための前提条件です。Gerogenes 間の遺伝的相互関係をより深く洞察を得ても RNAi の供給ベースの利点を活用して高スループットの量的な方法が必要です。
高齢化の最も一般的な代理メジャーは、寿命です。線虫 c. エレガンスの死亡率を測定するための従来のアプローチは、小さい人口サンプル内で時間をかけて個々 の動物の死を追跡します。動物の数が比較的少ない時間以上続いているし、定期的に白金線または生存率 (図 2 a) の指標として運動とまつげが猛烈優しく。このメソッドは簡単な直接測定の平均と最大の寿命を提供するので広く使用されています。しかし、この従来の方法は時間がかかり、比較的低スループット、動物および制御された方法で同時に測定できる条件の数を制限します。最近のシミュレーション研究が見つかりました多くの線虫の寿命の研究を行う条件9間の小さな変化を確実に検出できるように動物の十分に大きい数を分析していません。さらに、この従来の方法は、時系列、順番汚染をもたらすとすることができます破損したりますます壊れやすい、高齢の動物を殺す動物の同じコホートを繰り返し処理含まれます。
線虫の寿命を測定するための代替「Replica Set」手法を開発しました。このため、年齢同期、同質の動物の大規模な人口は小さい人口 (またはレプリカ) の数に分かれています。計画の実験の各時間のポイントをカバーする十分なレプリカ サンプルが生成されます。各観察時間時点でのレプリカのいずれかのリビングデッド、数のスコアは、修正動物、その複製の中で動物が破棄されます。したがって、独立した集団のシリーズ、全体として人口の期待寿命は、定期的にオーバー サンプリング (図 2 b) です。レプリカ セットの使用には動物や潜在的な環境汚染への繰り返された露出無しの繰り返し催促はありません。一時点で観測された生存率はすべて他の観察、処理を最小限に抑え、少なくとも桁違いでスループットが向上するから完全に独立。これは RNAi の何百もの同時に8,10クローンの寿命の変化量的に表わすことができました。
レプリカ セット、線虫の寿命をスコアリングのための伝統的な方法を介して線虫の寿命を実施するための詳細なプロトコルをご紹介します。方法と同様の結果が得られることを示す.我々 は自由に GPL V3 ライセンス (材料の表を参照) の下で提供するいずれかのアプローチを通じて生成された寿命データのグラフィカルな分析を支援するために開発されたソフトウェアがあります。"WormLife"は R11で書かれているし、Mac OS と Linux でテスト済みのデータのプロットのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) が含まれています。最後に、我々 は比較コントラストの各メソッドの制限、線虫の寿命の量的変化を測定するためのアプローチを選択する際の他の考慮事項を強調表示。

<table><tbody><tr><td>IPTG (イソプロピルベータ-D-1-チガラクトピラノシド)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro;L 96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>2mL 96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>通気性プレートシール</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>96ピンプレートリプリケーター</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Kamath et al, Nature 2003も参照。</td></tr><tr><td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Rual et al, Genome Research 2004.このライブラリはDharmaconからも入手できます。</td></tr><tr><td>WormLife- レプリカセット生存分析用ソフトウェア</td><td>Samuelson Lab</td><td>N/A</td><td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife</td></tr><tr><td>L4440 Empty Vector Plasmid</td><td>Addgene</td><td>1654</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.addgene.org/1654/ Wormbase</td><td></td><td></td><td>http://www.wormbase.org/&nbsp;</td></tr><tr><td>オアシス</td><td></td><td></td><td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&nbsp;</td></tr><tr><td>グラフパッドプリズム</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

レプリカ セットのメソッドですので、同じ量をより多くの治療法や条件を画面に単一の調査官、高スループット方法で寿命や線虫寄生線虫の生存率を定量的測定の試み時間データの品質の損失なし。メソッドc. の elegansの使用ほとんどの実験室は、一般的な機器を必要とする、従って採用する簡単です。アプローチは、従来の縦断的方法として時間をかけて 1 つのサンプルではなく、各観測点での人口の独立したサンプルの試金に集中します。ウェル プレートの井戸への液体の追加が伴いますを得点、線虫の移動を刺激して healthspan で定量化の変更が容易になります。レプリカ セットのメソッドの他の主な利点は、寒天表面 (例えばカビや菌類)、空輸の汚染物の減らされた露出、動物と散発的なミス (それはまだ、死んだ動物の呼び出しなど得点に堅牢性の処理が最小限生きている)。適切に分析し、レプリカ セット スタイル実験からのデータを表示する、カスタムのソフトウェア ツールも開発されました。ソフトウェアの現在の機能は、レプリカ セットのレプリカ セットし伝統的な (カプラン-マイヤー) 実験と同様両方統計分析の生存曲線のプロットがあります。ここで提供されるプロトコルは、従来の実験的アプローチ、レプリカ セットのメソッドと対応するデータ解析の概要について説明します。

任意の新しい方法論の開発、新しいメソッドは従来から認められた結果を繰り返すし、フィールド内で基準を満たしていることが不可欠です。我々 は以前に経験的、レプリカ セットと線虫の寿命を試金するための従来の方法と同様の結果20を生成します。野生型線虫(N2) 通常 20 ° C で維持は、我々 は伝統的な (図 4 a、黒線) とレプリカ セット アプローチ (図 4 b黒) の両方で観察 20、25 日間住んでいます。したがって、両方の方法は合理的に野生型寿命を概算します。また、新しいメソッドがテスト条件と大幅な変更を検出するための統計的検出力の間の変更を正確に定量化する解像度を持つことが不可欠です。私たちの以前の研究では、線虫の寿命の決定因子である転写因子の Myc 家族を発見しました。mml 1 mxl 2エンコード...

ここで述べるレプリカ セットのメソッド、定量的測定線虫の寿命/生存へのアプローチ、healthspan 高スループットかつ堅牢な方法でデータの品質を損なうことがなく多くの条件の審査をできるようにこのプロトコルは、戦略の詳細し、レプリカ セットのデータの解析のためのソフトウェア ツールを提供します。

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

その機能が生物の老化に影響を与える何百もの遺伝子が特定されています。しかし、彼らの関係の多くはよく理解されていません。この方法は、老化分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。つまり、gerA遺伝子間の遺伝的相互関係は何ですか?この手法の主な利点は、スループットの増加であり、同時に定量的に測定できる遺伝的プレディションの数が少なくとも一桁増加します。この手順で収集された寿命データは、この出版物で提供されているソフトウェアを使用してプロットおよび分析できます。この方法は、寿命に関する洞察を提供するだけでなく、ストレス耐性や健康保険の変更など、他の加齢に関連する表現型にも適用できます。この手順では、RNAi サブライブラリの新しいスタンプを作成します。まず、96ウェルプレートの各ウェルに、200マイクロリットルのLBとアンピシリンを充填し、12チャンネルピペッターを使用します。96ピンプレートリプリケーターを50%漂白剤に順次浸し、続いて超純水に浸して滅菌します。次に、先端をエタノールに浸し、先端を慎重に炎にかけます。次に、凍結した96ウェルグリセリンストックライブラリープレートの接着ホイルカバーを慎重に取り外し、滅菌したプレートリプリケーターの先端を、まだ凍結しているグリセロールストックのウェルに優しく、しかししっかりと粉砕します。次に、培養物に接種し、接種したプレートを透過性膜で密封します。ベンチトップで一晩培養物が成長するのを待ちます。翌日、プレートリプリケーターを滅菌し、一晩の培養からシールを慎重に取り除き、レプリケーターピンの先端を浸します。次に、長方形のLBアンピシリンとテトラサイクリン寒天プレートにピンを接種します。均等な圧力をかけ、小さな円運動を使用して、スポットが密集しすぎないように細菌を移動させます。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、レプリカプレートが10枚必要になるごとに、深ウェル96ウェルプレートの各ウェルに1.5ミリリットルのLBをアンピシリンでロードします。次に、培養した細菌をウェルに接種します。その後、プレートを通気性のあるメンブレンで密封し、振とうしながら20時間培養します。コントロールウェルは96ウェル全体に散在させるべきであり、96ウェルサブライブラリープレートが24のグループに分割されると、24ウェルの各分割には各コントロールが1つずつある。翌日、120マイクロリットルの培養物を、チップ間隔を調整できる6ウェルマルチチャンネルピペットを使用して、24ウェルプレートにロードします。次に、すべての液体が吸収されるまで、層流フードで覆われていないプレートを乾燥させます。過度に乾燥させないでください。液体培養物を分注する際には、適切な細菌培養物が24ウェルプレートの適切なウェルに確実に入れられるように、焦点を合わせてください。レプリカセットの実験は、それぞれに同じ細菌RNAiクローンを播種した、独立した24ウェル複製プレートのセットから始まります。寿命実験では、各プレートウェルに15〜20匹のL1動物を加え、L4段階まで成長させます。L4では、FUdRが反復全体のすべてのウェルに追加されます。同じ日の後半に、セットからレプリケートプレートを取り出し、最初のタイムポイントとしてスコアを付けることができます。寿命を延ばすために、プレートのウェルに液体を加えて動物の動きを誘発します。動き出さない動物は、ワームピックで優しく突かれます。その後、動物の総数と死亡した動物の数が記録されます。その後、最初の観測からのプレートは破棄されます。次の観察時点で、セットから別の複製プレートが取得され、同様の方法で採点されます。これは、決定されたスコアリング間隔で繰り返されます。毎回、レプリケートセットから新しいプレートを使用します。生き残った動物がいなくなるまで、プレートのセットにスコアリングを続けます。まず、従来の寿命アッセイに使用されたのと同じ漂白剤ベースの調製法で、動物の集団を同期させます。次いで、6ウェル間隔調整可能なピペットおよび試薬リザーバーを用いて、調製した24ウェルプレートの各ウェルに15〜20匹のL1動物を播種する。プレートに播種しながら、L1動物を定期的に溶液に混合して、均一な分布を維持します。さて、動物たちをL4に成長させます。このプロトコルでは、L4 開発のタイミングを知っておく必要があります。ワームの発生を定期的に監視します。動物がL4に到達したら、各ウェルに24マイクロリットルの50x FUdRを加え、プレートをインキュベーターに戻します。L4動物を使用することは非常に重要です。雌雄同体がFUdRを追加する前に生殖成熟に達した場合、彼らの子孫は生き残って食物を食べます。逆に、FUdRを早く追加しすぎると、動物が破裂します。目的の時点で、1つのリピートプレートを使用して生存率をスコアリングします。これを行うには、M9溶液で井戸を浸水させます。生存率を毎日採点する前に、餌がない井戸、汚染されているように見える井戸、または形態学的または発達上の欠陥を持つ動物がいる井戸をセンサーします。各ウェルについて、ウェルごとの動物の総数を記録し、ワームピックで各頭にそっと触れて、動かないワームの状態を確認します。プレート内の動かない死者をすべて数えた後、プレートを捨てます。この手順では、変換された e を成長させます。大腸菌をLBでアンピシリンと一晩。翌日、3, 000 Gで15〜20分間遠心分離して細菌を濃縮します。細菌を開始容量の1/10に再懸濁します。次に、200マイクロリットルの10xバクテリアを6センチメートルのプレートに分注します。試験条件ごとに3枚または4枚のプレートを用意し、汚染の場合に備えて2枚のプレートを追加で含めます。すべての液体が吸収または蒸発するまで、層流バッチでプレートを乾燥させます。乾燥したら、プレートをプラスチックの箱に室温で一晩保存し、二本鎖RNA産生を誘導します。その後、プレートを摂氏4度で最大2週間保管します。動物については、M9で妊娠した成体動物を集めます。M9で2回洗います。吸引でスピンを繰り返す。次に、C.elegansを4ミリリットルのM9に再懸濁し、2ミリリットルの次亜塩素酸塩溶液を追加します。次に、すぐにワームを3分間渦巻き、定期的かつ激しく振とうします。次に、解剖顕微鏡で卵の雲を探します。雲が見えない場合は、ワームをさらに10〜20秒間渦巻きます。次に、前と同じようにM9で卵をすばやく2回洗います。そして、洗った卵を3ミリリットルのM9に再懸濁します。次に、卵を新しい15ミリリットルのチューブに移し、摂氏20度でチューブを穏やかに回転させてインキュベートし、胚を一晩孵化させます。翌日、10マイクロリットルの3滴でマイクロリットルあたりのL1の平均数を計算することにより、調製したL1溶液の密度を決定します。準備したバクテリア播種プレートに、それぞれ50匹のL1動物を入れます。胚がL4段階に成長するまで、プレートを20°CのCelsuisインキュベーターにセットします。L1からL4への通常の発達には約40時間かかります。次に、子孫の生成を防ぐために、各プレートに160マイクロリットルの50x FUdRを追加します。次に、寿命は通常、雌雄同体でのみ測定されるため、オスを削除します。完了したら、プレートを20°Cのインキュベーターに再梱包します。すべてのワームが死ぬまで、毎日彼らの生存率をスコアリングします。これを行うには、動かない各線虫を頭の上のプラチナワイヤーまたはまつげでそっと触れます。非反応性の動物は死んでいるため、プレートから取り除く必要があります。このルーチン中の異常に注意してください。レプリカセットと従来の方法でC.elegansの寿命をアッセイすると、野生型のN2動物でも同様の結果が得られます。例えば、mml-1またはmxl-2の摂食ベースのRNAiノックダウンは、正常な寿命を有意に短縮しました。これは、従来の寿命アッセイとレプリカセットアッセイの両方によって測定されました。また、寿命の延長も検出できます。ここで見られるように、mdl-1またはmxl-1のRNAiは、どちらの方法で測定しても、C.エレガンスの寿命を有意に延ばしました。レプリカセット法を使用すると、100を超える条件で寿命の変化を同時に定量化することができますが、これは従来のアプローチでは合理的ではありません。例えば、ゲノムワイドな摂食ベースのRNAiスクリーニングにより、daf-2インスリン様シグナル伝達の減少による寿命の延長に必要な159個の遺伝子が同定されました。インスリン様シグナル伝達とこれらの遺伝子との関係は、動物の健康状態を測定することによってさらに説明されました。健康状態は、溶液中に懸濁したときにc.エレガンスがスラッシングすることによって示されました。このビデオを見れば、摂食ベースのRNAiを使用してC.Elegansの寿命を測定する方法についてよく理解できるはずです。しかし、RNAiは汎用性が高く、さまざまな表現型に適用することができます。レプリカセット法を習得すると、適切に実行されれば、毎日100を超えるRNAiクローンの寿命を評価できます。早期および後期のポイントをすばやく獲得できます。井戸の中のすべての動物は、生きて動いているか、死んでいるかのどちらかです。採点には、動物が死に始めるときに最も時間がかかります。このことを念頭に置いて、独立した試験の設定をずらします。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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