Name: 海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶ タテジマフジツボの年間培養法と遺伝子発現解析。海洋モデル生物としてのBalanus improvisusの維持管理、幼生生産、RNA抽出の手法を解説。海洋生物学・防汚技術研究に活用できます。

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この研究は、アンダース ブロームベルクにスウェーデン研究評議会 (VR) および EU のサポートされているプロジェクト海岸から 2017-04559 助成金によって支えられました。特に、養殖施設の設置、年間で、支えられている補助金 r. ジョンソンあたりに次の資金調達機関から: SSF (スウェーデン戦略研究財団) プログラム海洋科学と技術と船舶用塗料・ プログラムを通じてミストラ。ケント ・ ベルントソン、culturingfacility のセットアップの初期段階に尽力しました。さらに養殖施設は海洋の進化生物学 (www.cemeb.science.gu.se) の中心部から来ている確立のための資金であるスウェーデン研究協議会 FORMAS と VR からリンネ助成します。

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著者申告するものがあります。

Tjärnö 海洋研究所 (スウェーデン) にフジツボ文化は 20 年以上されていると、多くの異なる分野で研究に使用されています。30 以上の科学論文が発行されている研究を含む防汚13,22, 流体力学23, 化学生態学24年間養殖システムを利用して、気候変動16、進化生物学5、および分子生物学2。
研究室環境 (野生の母集団を代表できない場合があります個人) により適応している特定の個人の選択を避けるためには、毎年フィールドから新しい親魚を収集するためにそれをお勧めします。さらに、通常の年の間にほぼ成人の死亡率の 50-80% があるので毎年、文化を活性化させることをお勧めではまた。しかし、目的は自殖系統実験進化の研究を設定するか、飼育の家族だけは使用されるが。
Tjärnö 海洋研究所パネルB. improvisusを収集する良い時間を当時の海で cyprid 幼虫の十分な供給があるため 6-8 月です。他を手動で削除して起動時にフジツボ決済毎週パネル解決b. improvisus (例えば、ムール貝、アステラス製薬、コケムシ、ヒドロ、nemerteans/隊、他のフジツボ種) より種をチェック、パネル (例えば歯ブラシで)。Tjärnö、周り 3 浅瀬のフジツボの種 (B. improvisus Semibalanus balanoides、タテジマフジツボ crenatus) があります。7 月-8 月に支配的な滑らかなハード面の行うことはB. improvisus です。S. balanoidesその決済期間は早いばねの間に、主に天然物 (例えば石) を好みます。B. crenatusは、夏の間にパネルの低い数字で発生します。
また、培養の cyprids、特定の特徴を持つ特定の linages が確立されている場合に必須になる、または実験進化学大人のフジツボの新しい世代を開始することが可能です。大人の新世代を開始する最も便利な方法は、研究室では、熱可塑性樹脂パネル cyprids を解決することです。新規入植 cyprids でこれらのパネルは、実験的治療またはフィールドの露出のためにも使えます。緊急の場合、1 つは、近隣のサイト (例えばTjärnö の海洋研究所の場合 Idefjorden) B. improvisusは共通から岩に大人も使用できます。これらの既に確立された大人はこのようにトレイに置かれているパネルの大人と同じように扱われを介してフローを介してシステムを供給します。フローセルは、フジツボ25パネルを確立するも使用できます。これらは、フロースルー プランクトン ネットを cyprids 我慢しないでください、幼虫の唯一の解決の表面板と側面が付いている部屋です。
すべてのライフ ステージを含む長期的な機能しているフジツボ文化を設定するために重要ないくつかの手順があります。B. improvisusの文化に使用するメソッドは、おそらく、大部分は、自由遊泳、planktotrophic 幼虫とその他の海産無脊椎動物にも対応します。養殖のいくつかの種は、すでによく手順 (例えばムール貝、カキの種)26、他の海産無脊椎動物のために彼らの一生にわたる長期的な文化の例がありますサイクル。文化フジツボ (B. アンフィトリテ) 最初の成功した試みの一つが Rittschofらによって行われていた15. 長期的な財政および個人的なリソースは、フジツボの養殖施設の設定を検討する前に場所でする必要があります。年のこの種のメンテナンス-フジツボ周り文化は少なくとも 1 人作業半分時間を必要とします。主に微細藻類27の養殖、生産ラインでいくつかの手順の将来の自動化のいくつかの可能性があります。さらに、成功するために質の高い海水の大量にアクセスを持つことが不可欠です。フジツボ、アルテミア、微細藻類の培養は、特定の安全手順を含まない。ただし、いくつかの防汚物質や有害化学物質のテストは、特別な予防策を必要があります。
パネルは、汚染のため週に数回をチェックされました。文化で使用される海水は、コスター フィヨルド Tjärnö 海洋研究所の外に 40 m の深さから汲み上げは、ラボの水システムに入る前に 2 つの砂フィルターを通して渡されました。水のフィルター処理が行われてない場合文化ではるかに多くの汚染があります。定期的にデトリタスやフィールドから海水の供給を介してシステムに入力 (例えば、匐枝建物ヒドロと捕食 nemerteans) その他の無脊椎動物からの文化でパネルをきれいにすることが欠かせません。たとえば、にもかかわらず、幼虫が生成されない文化が十分に供給しそれ以外をされているという事実は、良好な状態にするよう交尾を阻害するために表示される nemerteans の存在の問題かもしれない。当然、Tjärnö 海洋研究所文化における汚染の生物の多くは、スウェーデンの西海岸の特定、他の種類の生物を汚染が流行して他の地域での挑戦の多くであります。スウェーデンの西海岸、珍しくパネルに他のフジツボの生物に汚染を見つけること。時折、 S. balanoidesの確立が発見されているが、これは非常に限界の問題 (せいぜい、1 S の balanoides汚染 10,000 b. improvisusサンプルのため)。種を汚染することの欠如が最も可能性の高い優占 larvaefrom B. improvisusの頃、夏の間に新しい文化を確立する体制に依存していた。さらに、またあったパネルB. improvisusの明確な濃縮この種は滑らかな表面の13の選択なので。
死んでいる大人のフジツボを必ずしも削除する必要は。空のシェルは、パネルに残っている、彼らは避難所アルテミアノープリウスおよび様々 な混入種の両方になります。さらに、死亡個体隣接する分解中に有毒な化合物のリリースでおそらく個人の幸福に影響を与えることが注目されています。成人の死亡率の追加結果はいくつかの個人が (にもかかわらず、フジツボは、そのサイズに関連して動物の世界最長の陰茎を持っている) 交配を許可する他の大人から一人で、あまりにも遠くで残される、28。これらの個人は存続するが、幼虫のための生産的です。しかし、これらの孤独な大人個人ベース プレートを傷つけることがなく優しく削除できます、交尾を有効にする他の人の近くに水平方向に配置します。フジツボもそれぞれ大人 1 人とパネルを配置することで合致することができますが、受精が発生することが、十分に近い。このように、遺伝子のラインは作り出された14をすることができます。
高品質のフィードを作成してほぼ毎日文化を養うために重要です。食べ物がなくてもあっても数日は、幼虫のリリースが減少で起因できます。飼料組成の前のテストは、珪藻成長と給餌フジツボの生存に不可欠であることを示しています。いくつかの珪藻種見えるとして適切なフィード、小規模または孤独な細胞 (直径未満 10 μ m) 給餌の摂取の必要がありますが。S. marinoi c. 単信、 t. pseudonanaの種すべては適切なフィードB. improvisus給餌のためだけでなく、栽培が簡単に証明しています。さらに、飼料の品質は指数関数的に成長している藻類のため一般的に高いです。また、珪藻がB. アンフィトリテ15の生産的な文化を確立するために不可欠であることが報告されています。珪藻の重要性の理論は彼らがユニークな脂肪酸プロファイルを持っている、20:5 の高度不飽和脂肪酸29で特に豊富。それが示されてきた特定の脂肪酸がオイスター幼虫30の開発に成功のために重要です。
年間で、フジツボ文化の有害な病気の発生率がされてないです。カキとムール貝のような多くの商業無脊椎動物漁場に病気はなく一般的で、非常に有害な場合があります。ウイルスの有害な影響は、野生の個体群からも報告されています。フランスでネイティブのオイスターは、1925 年に、ポルトガル オイスターマガキ angulataと取替えられたが、この種は 1970年31周りイリドによって一掃されました。最近では、太平洋のカキ、世界中の文化で ostreid ヘルペス ウイルス 132に関連する表示されるマガキで大規模な死亡イベントがあった。フジツボにウイルスや細菌、病原体の報告は今のところ発表されていません。しかし、 b. improvisusの継続的なゲノム プロジェクト、ウイルスの配列が見つかりました (Alm Rosenbladら、未発表データ) が病気の症状に明らかなリンクがないです。抗生物質の混合物は、細菌感染症のリスクを最小化する文化に以前適用されています。ただし、この手順が放棄され現在、これまでのところ、これが汚染問題を生じない。
(前述) に海水を加熱すると、過熱と文化生産ラインで最も深刻なリスクがあるかもしれない。もちろん、センサーと適切な警報システムが使用される (例えば、責任者に電子メールまたはテキスト メッセージを送信) ありますが、過熱を防ぐためには困難です。過去にこの種の事件は文化で大人の実質的殺害しました。もちろん、壊滅するし、時間とお金の長期的な投資を台無しにするこのできます。特に、これは近交系の遺伝子のラインが確立されている場合は致命的となります。そのようなラインの寿命を確保し、彼らは偶発的な損失から保護、フジツボの凍結保存方法を開発することが望ましいこと。それは太平洋のカキから幼虫のダウン凍結および部分的な成功33で復活できることを報告されています。Cryobanking はまた、幅広い種34の遺伝資源を維持するために貴重なツールをされています。B. アンフィトリテからも給餌は凍結35、生き残るために報告され、凍結ダウン個人の 20% が正常に cyprids36に変成することがわかった。しかし、文化の長期的な持続可能性のための凍結を適用することは今のところ採用されていないが、これは確かに選択した線の維持のため必要これは強力な海洋 modelsystem にB. improvisusをしっかりと確立するための重要なステップになります。
ここでは、プロトコルは、 B. improvisus (すなわち前後、相馬、マントルピース) の大人から様々 な組織の郭清に対して贈られました。ただし、他の組織が抽出もできますそれ強調する必要があります。例えば、軟膜ベース種クロフジツボ スギついての外装と内部マントル間慎重に分離され RNA の抽出および遺伝子表現37の RNA シーケンス解析に使用します。ここで説明した最適化されたアウトラインの抽出プロトコルは、開始材料の最小量からシーケンスの高品質 RNA の十分な量を提供します。まず、均質化管に直接個々 の幼虫のコレクションは、1 つの管から別の転送中に任意の損失を最小化します。さらに、テストのさまざまな方法の中で、RNA の点で最も効率の良いをもたらすことを証明したセラミック ビーズと超音波または杵の均質化と比較して整合性が均質化。遺伝子発現やゲノム解析実験を計画するとき心に留めて、フジツボの高い遺伝的変異の挑戦、少なくともB. improvisusのあること。フジツボは、コード領域 (Alm Rosenbladら、未発表データ) でも、3-5% の範囲、遺伝的多様性。これはもちろん、qPCR 解析のためのプライマーの設計に特定の要求を置きます、領域の識別し一貫性のある表現の結果 betweenbatches を得るためにプライマーのためのテンプレートとして使用する必要があります保存より。標的遺伝子の節約された地域アクアポリンと Na のような + K + Atpase, cyprids を含む個人の何百もの集団から得られた RNA シーケンス データのこれらの遺伝子の順序の変動を研究することによって識別できます。ゲノム解析のため DNA がサンプリングされます。ただし、 B. improvisusから高品質の DNA を取得することができます挑戦する21。
結論としては、確立されたフジツボ文化は、さまざまな種類の実験的研究に尽力する証明されています。特に、すべての年周り幼虫生産は、天然の産卵期間に制限されることがなく実験を実施する私たちをことができます ( B. improvisus、これは、夏の間に)。得られた幼虫は、幅広い決済アッセイ、動作の試金、特定の遺伝子の表現研究ゲノム ・ トランスクリプトーム研究などの実験的研究を実行する使用できます。

フジツボが付着大人海産甲殻類と自由遊泳性、浮遊性の幼生。フジツボの 1,200 の種のほとんど浅い水の多くはしばしば低塩分にさらされています。ほぼ淡水容認することは 1 つの種、タテジマフジツボ (Amphibalanus) 即席に作る(B. improvisus) 湾のフジツボとチャールズ ・ ダーウィンにウルグアイ1リオ ・ デ ・ ラ ・ プラタの河口の小さなストリームからこの種が記載されています。B. improvisus浸透圧調節機構2,3の研究の特に関連するモデルを極端な耐性の時塩分になります。このフジツボは汽水の条件を好むが約 1.6 psu から塩分と水に住んでいることに高い 40 psu4として。バルト海の汽水で生息するフジツボだけです。B. improvisusアメリカ大陸の東海岸に由来すると考えられてが今日は世界の分散のために5を同梱します。それは主要な汚損生物と岩、桟橋、ボートの船体でよく見られる、したがって海洋、塩気のある水6、7の構造の生物付着のメカニズムを理解するための一般的な関心の。
他のほとんどのフジツボと同様、 b. improvisusは受精; と雌雄同体複製は、細長いペニスと体内受精を使用して隣接個体間の交配によって発生します。生殖期間は主に 5 月から 9 月です。B. improvisusは 7 遠洋幼生 (6 給餌 1 つ cyprid ステージ8の順)。ノープリウス幼生は自由遊泳は、非給餌 cyprid 幼虫に脱皮する前に数週間までの水の列のフィードに受精卵が孵化。Cyprid は複数のキューを使用してを解決する適切なサイトを検索して付着少年フジツボ9に変身を経る。種が実験室で培養することができます、海 (実験室文化で 2-3 年) に 1-2 年の寿命。平均では、 B. improvisus (最大 20 mm 程度) が付いている直径で 10 mm に成長し、約 6 mm の高さの最大値に達すると (ただし、それは混雑した条件の下で背が伸びることができます)。種ができるシェル プレートの放射状パターンの石灰質ベースと tergal プレート1,10の形その滑らかな石灰質もシェル (白または灰色がかった) によって識別されます。
フジツボB. improvisus分子生理機構と同様、生態学的相互作用と進化の結果の焦点との浸透圧の研究のためのモデルとして有利な機能があります。防汚メカニズム関係7,11,12,13研究に関連して特に生物学の調査のためのモデルとしても広く使用されます。ただし、自然季節産卵研究 cyprid 幼虫の予測不可能な供給が得られます。したがって、そのライフ サイクル全体を通じてこのフジツボを一年中文化能力です分子および作用機構研究の様々 なタイプを有効にする主要な資産であります。また、海洋/汽水域の世界でのプレゼンスは、フィールドと実験的研究の組み合わせにできます。制御された繁殖は長期培養14について知られている家系の家族を作成することも、数ヶ月の生成時間は長期的な戦略の実験的進化できます。またドラフト ゲノムとトランスクリプトームのいくつか、ありこれらのリソースは、いくつかの遺伝子 (例えば、浸透圧に重要な遺伝子)2,3のクローニングのために使用されています。
このプロトコルの目的は、確立し、大人やこの生物の幼虫について遺伝子発現研究を行うために一年中フジツボB. improvisusの文化を維持する方法について説明することです。Rittschofら15種タテジマフジツボの cyprids の集落への給餌のリリースからフジツボを培養するための方法について説明します。プロトコルは Tjärnö 海洋研究所 (スウェーデン)、 b. improvisusのすべて年間を通して養殖に適応されているし、生産を含むとフジツボの飼育、生産ラインのすべてのステップの詳細な説明が記載されて幼虫と成虫と幼虫のフィードの管理。完全な手順の概要については、図 1を参照してください。養殖システムの使用はいくつかの一般的な実験のセットアップを例示、Na+の機能ゲノミクス研究で示されている/K+ ATPase とアクアポリン、浸透圧調節2、その機能の解明 3。それは特定の臓器における遺伝子発現を調べることが不可欠でありフジツボ解剖の基礎の一部を支給します。質の高い海水の良い供給、フジツボB. improvisus、および他の可能性のある多くの種の培養できるはず世界中の海洋研究室です。

<table><tbody><tr><td>プレキシガラス(ポリメチルメタクリレート)パネルプラスチック</td><td>製品、ブロムマ、スウェーデン</td><td></td>透明<td>ガラス</td></tr><tr><td>1.5Lペットボトル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE水産養殖、ベルギー</td><td></td>我々は<td>、さまざまな企業をテストしました;これは本当に最高のものです</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi(CCAP株1077/5)</td><td>CCAP(藻類と原生動物の培養コレクション);スコットランド&nbsp;</td><td>株 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)</td><td>CCAP (藻類および原生動物の培養コレクション);スコットランド&nbsp;</td><td>strain 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Milliporeカートリッジフィルターシステム</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>公称孔径0.2&microのカートリッジ。m</td><td>ミリポア&nbsp;</td><td>カートリッジCWSS01S03</td><td></td></tr>大容量の<tr><td>ポリカーボネートボトル</td><td>Nalgene</td><td></td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>可能なRNA後の</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp;RNA</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientificを保存するための固定液&nbsp;&nbsp;</td><td>AM1907</td><td>調製したRNAからDNAを除去するDNAseキット</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成キット</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>cDNA合成キット</td></tr><tr><td>SYBRグリーンスーパーミックス</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>QPCR用色素</td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>成体または多くのコイのRNA抽出</td></tr><tr><td>軟組織均質化 CK 14、2mlチューブ</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>均質化のためのセラミックビーズ</td></tr><tr><td>RNeasy マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>少数のコイ科のRNA抽出</td></tr></tbody></table>

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

フジツボが付着大人海産甲殻類と自由遊泳性、浮遊性の幼生。フジツボタテジマフジツボ (Amphibalanus) improvisus低塩分の極端な耐性のため浸透圧調節機構の研究のためのモデルとして特に関連します。防汚研究に関連して特に生物学のモデルとしても広く使用されます。ただし、自然季節産卵研究 cyprid 幼虫の予測不可能な供給が得られます。B. improvisusのすべての年間養殖は開発され、生産ラインでの手順をすべての詳細な説明のためのプロトコルを説明 (すなわちパネル、コレクションとの飼育アダルト文化の確立フジツボ幼虫と成虫と幼虫の飼料の管理)。説明もトラブルシューティングに関するガイダンスを提供し、重要なパラメーター (例えば汚染の除去、高品質飼料の生産、必要な人材、高品質海水の重要性) を説明します。養殖システムから各バッチは最大限に約 12,000 給餌が得られます、毎週ほぼ 50,000 の幼虫まで作り出すことができるので、1 週間で 4 つのバッチを配信できます。B. improvisusの文化に使用する方法は、おそらく、大部分は無料 swimminglarvae とその他の海産無脊椎動物にも対応。プロトコルは、様々 な組織の郭清の遺伝子発現の研究の質の高い RNA の生産と同様、大人から掲載されています。それはまた記述されているどのように培養大人と飼育 cyprids は外部要因に関連して遺伝子発現を調べるための実験的デザインの広い配列で利用できます。遺伝子発現培養ふじつぼ類の使用、Na+の可能な浸透圧調節の役割の研究で示されて/K+ ATPase とアクアポリン。

B. improvisusの大人のフジツボの養殖の説明手順、ノープリウスの 4 つのバッチまで幼虫を生産する週。ほぼ毎晩、ノープリウス幼生を収集するために可能になるより多くの人々 とインフラストラクチャが必要です (、親魚に多くフジツボと文化がリリース幼虫継続的に)。幼虫用追加の制限要因は、特に珪藻Skeletonemaに関する高品質の飼料の可用性に表示されます。最大限に、養殖のシステムからそれぞれのバッチは、約 12,000 の給餌は、1 週あたりの 50,000 の給餌まで培養することができますのでで構成されます。ただし、いくつかの週間可能性があります 10 倍少ない幼虫まで。単一の大人日14、大人 1-2 名各バッチの幼虫を発表していることを意味するあたりまで 7,000 幼虫を作り出すことができます。週間以内決済試金および分子研究に使用できます (1 週あたり約 30,000 cyprids を最大限に降伏) cyprids に収集された給餌の約 70-90% がいきます。
それはバッチ、間 cyprid 機能の変化があることを強調する必要があります、一般的には、バッチ内でより大きなバッチ間のバリエーションがあります。たとえば、決済の試金でセトリング成功 30、異なるバッチ 70% 間で異なります。ほとんどの場合、これは別のサンプリング期間中に幼虫を解放する大人の特定の組の個々 の遺伝的変異によるです。もちろん、結果についてのより一般的な声明を行われる場合に繰り返し実験 (生物的複製) がバッチの数から cyprids を含める必要があることをお勧めします。バッチごとに変化は、適切なコントロールと遺伝子発現研究に正規化する必要があります適用する実験的なデザインの要求を置きます。しかし、いくつかの統計の正規化手順が実装されている後でさえもかなりバッチ間の変動を減らすこと、バッチのいくつかの効果は、通常、まだ明らか (未発表データ)。
指定されたプロトコルに従い、平均すると、500 を取得することが可能だとして 20 cyprids、フジツボ決済 (表 1) のステージに関係なくから高品質の RNA の ng。RNA の品質は通常、(2 つのピークの予想される位置は図 4に示される) 18 と 28 のピーク間の比率として測定されます。フジツボおよび他の多くの節足動物の場合 28 s rRNA (解析手法の一部) として加熱すると分解し、18 歳ピーク20と共に移行します。だからこそ、そこは原則、フジツボの分析のこのタイプの 1 つの単一 rRNA のピークです。このテスト (図 4) セラミック ビーズによる均質化が RNA は、最高の整合性とは、したがって、任意のメソッドから明らかです。RNA は、7000 万の読み込み (読み取り、数コースのシーケンス中に多重のレベルに依存) サンプルごとの平均の量と高品質シーケンス、シーケンス処理用ライブラリを生成する品質で十分です。RNA の量で多数の遺伝子の cDNA 合成と qPCR 発現解析の十分ですも。
図 5結果を示します qPCR 解析からアクアポリンと Na+/K+ ATPase (NAK1) スプライスの変形、環境手がかり2,3の変化に応えて発現変動を調べた。長いのと短いの相対的な表現の比較はスプライス NAK1 ショーの二重は短い NAK (図 5A) に関連して低塩分の長い NAK1 mRNA の増加の亜種。したがって、データは、選択的スプライシング、長い形式により低塩分条件下で優勢なを示しています。アクアポリン、場合差分式 (図 5B) を 2 つの水を運ぶ paralogs AQP1 と AQP2 に表示は明らかです。特に、マントル組織でそれは明らかですが、AQP1 低塩分で大幅にダウン規制 AQP2 を見られない。代わりに、AQP2 は、低塩分でが、相馬、わずかに増加した式を示します。これらの調査結果は、別の機能の役割の調査のための基盤を提供B. improvisusイオン輸送体とフジツボの浸透圧調節におけるアクアポリン。
<img alt="海洋ライフサイクル図:DNA/RNAサンプリング、ノープリイからコイへの培養、成虫の定住プロセス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: プロシージャおよび成人における遺伝子発現研究の RNA の抽出を養殖全体の概要。新しい文化を開始するためパネルはフレームにアタッチ、1-3 m の深さの海に展開します。数週間後、成人/少年とパネルは研究室でトレイのラックに垂直方向に配置されます。各トレイは、大人で約 40 のパネルを保持しています。合計 ≈ パネルあたり約 100 大人とは、4,000 のアダルト個体がトレイごと培養です。大人のフジツボがアルテミアにうんざりし、保つことができる年の周り。ノープリウス幼生は、トレイを介してふるいをフィルタ リングから、週何回か収集されます。収集の給餌は、26 の ° C の水浴中で、微細藻類にうんざりのバケットに転送されます。給餌は、フィルタ リングによって集めた非給食 cyprids に脱皮するまでに飼育されています。新しいパネルを研究室で確立するの解決 cyprids パネルにどちらかを提供し、今年の新しいパネルに-文化の周りや外部の変更の条件で特定の実験のセットアップに使用します。RNA が少年/大人実験の終わりにまたは特定の時点から抽出されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="水生ろ過実験;機器とプロセス段階。堆積物分離セットアップ;研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: 養殖のいくつかの重要な手順のイメージ。(A) このイメージ フィールドから新しい個体群を収集するためのパネルとフレームを示しています。(B) この画像は、トレイに配置されているラックにB. improvisusの大人のフジツボとパネルを示します。パネル約 2 cm 間隔で設置されます。(C) この画像は、パネルと左に飼料タンク、フジツボとトレイを示しています。各トレイからは、ノープリウス幼生のコレクションのためのふるいの配置場所のコンセントです。(D) この画像は、アルテミアの生産は大人のフジツボのフィードを示します。(E) この画像は、バケット 26 ° C に設定水浴の配置における飼育を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="フジツボの解剖学図;鰓蓋板、シェル、ボディの詳細。生物学的研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: 大人のフジツボの初期解剖手順の説明: その殻から体を削除します。(A) 一方の開口部を通して優しく鉗子を挿入して蓋板をつかむ。プレートを削除し、動物を公開して丁寧に引き抜きます。(B) 相馬部分、前後のすぐ下を掴んで動物を引き出します。(C) このパネルは、ドングリ フジツボの全体的な構造を示しています。マントル ・ (卵巣) の可能性がある受精卵体が引っ張られるとき貝キャビティの滞在します。フジツボ解剖学に関する一考察 (より詳細なアカウント ・ アンダーソンを参照してください)9: フジツボの壁板が内側に傾斜し、一緒に、彼らは火山のような円錐形を形成します。開口部、開口部はドアや開口部を閉じるに蓋を形成する 2 つの蓋板で覆われています。ドングリ フジツボ一般; 下地にしっかりと接着されている石灰質基底板があります。フジツボのいくつかの種は、石灰質 (例えば、 S. balanoides) プレートを欠けています。フジツボは、暗色のマントル (甲) から骨格を分泌します。二層マントルの外側の表面は硬直しながらマントルの内部の表面はない石灰化、柔軟なために石灰化します。開口部の内側、前後引っ込んだ位置に存在しています。これらは懸濁液を供給するためフジツボを使用して胸部付属肢です。卵巣は、精巣が、相馬にあるフジツボ、麓近くに位置しています。この図は、Panovaらから採用されています21スプリンガーの許可を得て掲載されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="蛍光時間対強度グラフ、発光ピークのデータ解析、分光研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: キャピラリーゲル電気泳動による rRNA 整合性の定量します。2 つの異なる均質化法により調製した RNA: 超音波処理 (A) と (B) セラミック ビーズ。フー、y 軸の単位は、蛍光ユニットの略です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="塩分濃度、NKA-L1/NAK-S 発現に対する pCO₂ の影響を比較した棒グラフ。組織におけるアクアポリン発現" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: 遺伝子発現の浸透圧調節に重要な遺伝子の 2 つの異なる研究から結果b. improvisus. (A) このパネルが差分式を示します/K+ ATPase NAK1さまざまな塩類および pCO2への応答でレベル3の Na+のスプライスバリアントの qPCR によって測定されました。低塩分治療長いアイソ フォーム (NAK1 L) の式はショートを基準にして増加する (分散分析, P 0.001 &lt;)。(B) このパネルは、さまざまな塩類が2への露出の間にB. improvisusの大人のアクアポリンの発現を示しています。qPCR はアクチンに対するアクアポリンの発現レベルを決定するために使用されました。成虫 3 塩分が異なる (3、20、および 33 PSU) で 14 日間培養。RNA の準備のため、相馬、スィアライ、および大人のマントルが分離しました。両方の図には、エラーバーは標準偏差を示します。* * と * * * (ANOVA) の有意水準を示す 0.01 と 0.001、それぞれ。これらの数字は、リンドらから変更されています。2,3。 両方の数字は PLoS 1 の許可を得て公開されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>集落フェーズ</td>
			<td>RNA (ng) の合計額</td>
		</tr>
<tr>
<td>フリー スイミング</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>探査: 検索窓を閉じる</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>添付 cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>新しく少年変成</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: RNA の収量。このテーブルは、決済プロセス中にさまざまな段階で 20 cyprid 個体のプールからの RNA の準備キットで抽出した RNA 量を示しています。

フジツボタテジマフジツボ (Amphibalanus) improvisusは、浸透圧調節や防汚のモデルです。ただし、季節の自然産卵と、cyprid 幼虫の予測不可能な供給が得られます。ここでは、幼虫の生産を含むb. improvisusのオールラウンド年養殖のためのプロトコル、説明します。遺伝子発現研究培養ふじつぼ類の使用を示しています。

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

この培養施設は、幼虫の生態学、生物付着、進化生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。具体的には、幼虫の定着時の受容体-リガンド相互作用、新しい防汚技術の開発、浸透圧調節に関与する遺伝子の進化と機能に関する研究に活用できます。このモデル生物の主な利点は、フジツボBalanus improvisusが頑丈で、一年中繁殖し、世代時間が比較的短いことです。この方法はフジツボの養殖に関する洞察を提供しますが、他の海洋生物の養殖にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、良好な海水の供給、高品質の飼料の堅牢な生産、培養物の洗浄と給餌への絶え間ない出席など、成功に重要な多くの詳細のために苦労するでしょう。この手順を実演するのは、フジツボを扱う技術者兼研究者のMartin Ogemark氏とAnna-Lisa Wrange氏です。まず、いくつかの透明な熱可塑性パネルを保持できるフレームを設定します。各パネルの上部隅に2つの穴を開け、ケーブルタイを使用してパネルをフレームに取り付けます。成虫のフジツボを採取するには、穏やかな海域でパネルを1〜3メートルの深さで垂直に展開します。フジツボが沈殿して直径5ミリメートルに成長するのを待った後、パネルを実験室に持ち込みます。次に、ポリエチレントレイにミルド溝のあるスタンドにパネルを垂直に置きます。まず、無毒で耐水性のテープを使用して、5つのパネルをテープで固定し、上部が開いている立方体を作成します。キューブを小さなトレイに置き、海水を入れます。次に、キューブの上部に約 200 匹のコイを追加します。一日おきに、フジツボの幼体に100ミリリットルのSkeletonema marinoiを与えます。2〜3週間後、立方体のパネルには、直径が少なくとも5ミリメートルの確立された幼体が含まれているはずです。キューブを分解し、パネルをフロースルー海水の入ったトレイに移動します。アルテミアノープリウスを収穫するには、まず曝気ポンプをオフにしてボトルを暗くし、次にボトルの下部を10分間照らします。孵化したアルテミア・ノープリウスは、光に向かって泳ぎます。孵化していない嚢胞は底に沈み、嚢胞の殻は上に浮かびます。下部のクランプを開き、遊泳アルテミアノープリウスの密集した集団として中間画分を収集します。成虫のフジツボでパネルを掃除するには、パネルに淡水をそっとスプレーし、柔らかい歯ブラシで汚れを取り除きます。フジツボのないトレイと熱い淡水でチューブを清掃します。次に、オーバーフローポートを備えたポリエチレントレイにふるいを置きます。ふるいに一晩で定着するフジツボの幼虫を集めます。次に、バケツに20リットルのろ過された海水と1リットルの珪藻微細藻類混合物を入れて、1ミリリットルあたり50, 000個の珪藻の密度を作成します。以前に採取したフジツボノープリウスを結晶化皿に移し、皿を横から照らします。次に、ピペットを使用して、光に向かって泳ぐノープリウスを収集し、それらを別の皿に移します。ノープリウスを1リットルのろ過された海水が入ったビーカーに移してカウントします。次に、前に準備したバケツに1リットルのノープリウスを追加します。3日後、90マイクロメートルのふるいを使用してフジツボノープリウスを収集し、バケツを清掃し、ろ過された海水で満たし、新しい珪藻飼料とフジツボノープリウスを追加します。さらに2〜3日間のインキュベーション後、160マイクロメートルのふるいの上に320マイクロメートルのふるいを使用して、脱皮していないフジツボノープリウスをコイ科から分離します。微細藻類培養用の4リットルボトルを4本設置した後、ボトルを1平方メートルあたり50〜100マイクロモルの強度で光に当てます。養殖物が十分に密度が高く、給餌に使用できるようになったら収穫します。まず、大きな個体を選択し、解剖の2日前に食事を控えます。次に、フジツボの殻を歯ブラシで洗浄し、水ですすいで、環境に存在する他の種からの汚染を最小限に抑えます。個々のフジツボを解剖のために平らな面に置き、次に一対の鉗子の先端をターガルプレートとスカタルプレートの間に挿入します。1つのプレートをつかみ、そっと引いて取り外します。次に、鉗子を使用して繊毛をつかみ、フジツボをまっすぐ引き出します。最後に、解剖したフジツボを96%エタノールまたはRNA安定化溶液に直接入れて固定します。ここで説明するプロトコルを使用すると、1週間で最大4バッチのフジツボノープリウス幼虫を生産できます。最大限に、培養システムからの各バッチは約12, 000ノープリウスで構成されており、これは週に最大50, 000ノープリウスを培養できることを意味します。1週間以内に、収集されたノープリウスの70〜90%がコイ科に成長し、週に約30,000匹のコイを産出します。沈降段階に関係なく、わずか20匹のコイ科の個体から平均500ナノグラムの高品質RNAが得られました。フジツボでは、28S rRNAは加熱すると分解します。セラミックビーズによる均質化は、RNAに最高の完全性を提供するため、フジツボや節足動物の組織を扱うための好ましい方法となっています。qPCR解析では、NAK1 mRNAの長鎖変異体では、短鎖NAKと比較して塩分濃度が低く、2倍の増加が観察されました。これは、低塩分条件下で長い型が優勢であることを示しました。フジツボの培養に関与するさまざまなステップを習得するには、数週間のトレーニングが必要です。この手順を試みる際には、培養ワークフローのすべてのステップで汚染を最小限に抑えることが特に重要です。開発後、この培養技術は、フジツボの生態学、生理学、分子生物学の理解を深めるのに役立ちました。また、フジツボBalanus improvisusを強力な海洋モデルシステムにするための重要な基礎でもあります。

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このプロトコルの目標は、Lymnaea stagnalisの胚と幼虫のハイスループットなカプセル化解除のための一連の方法をユーザーに提供することです。これは、全体のマウントin...

全体のマウント<em&gt;その場で</em腹足類軟体動物のための&gt;ハイブリダイゼーション法<em&gt;モノアラガイstagnalis</em

ここでは、モデル刺胞動物のアントゾアンであるStarlet Sea Anemone Nematostella vectensisの再生を誘導し、監視する方法を実演します。...

スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導 Nematostella vectensis

このプロトコルの目標はパラフィンに埋め込まれているされていると、スライド ガラス上に断面採取したサンゴ大人上の in situハイブリダイゼーションを行うことです。これはパラフィン包埋組織の RNA アンチセンス...

その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術

このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。...

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

ドリオレッタゲゲンバウリ種を含むドリオリッドは、世界中の生産的な亜大陸棚システムに見られる生態学的意義の小さなゼラチン状の海洋動物プランクトンです。これらの繊細な生物を培養することの難しさは、彼らの調査を制限します。本研究では、ドリオリッド・ドリオレッタ・ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。...

実験研究のための海洋ペラジック・チュニケート・ドリオレッタ・ゲゲンバウリ(ウルジャニン1884)の栽培

この論文では、腹足類 Crepidula fornicata...

スリッパカサガイ、Crepidula fornicataの幼虫の実験室および野外培養

この研究では、嚢胞性肺環境を反映した緑膿菌遺伝子発現を評価するための凝集ポリ微生物バイオフィルムモデルを開発し、RNA抽出プロトコルを最適化するためのフレームワークを概説しています。アプリケーションには、抗菌効果の評価や、嚢胞性線維症に関連する条件下での抗生物質の代替品の研究が含まれます。...

感染関連遺伝子発現を研究するための嚢胞性線維症凝集体バイオフィルムモデル

本研究では、淡水リンゴカタイル( Pomacea canaliculata)の安定した変異系統の生成と維持のためのワークフローを開発しました。プロトコルには、受精卵の採取、CRISPR/Cas9システム成分による顕微注射によるゲノム編集誘導、 胚の卵外...

ゴールデンアップルカタツムリ( Pomacea canaliculata):受精卵から安定した変異系統へ

学ぶ タテジマフジツボの年間培養法と遺伝子発現解析。海洋モデル生物としてのBalanus improvisusの維持管理、幼生生産、RNA抽出の手法を解説。海洋生物学・防汚技術研究に活用できます。

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

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