Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

この方法は、腫瘍形成、細胞遊走追跡、がんおよび健康な細胞シグナル伝達など、がん生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、線維芽細胞などの間質細胞とともに3D環境で腫瘍形成を低コストで高い再現性で研究できることです。材料がバイオプリンティング可能で、かつバイオ機能的であることを確認することが重要であり、そのためにはそのレオロジー特性と細胞適合性を定量的に研究する必要があります。

ハイドロゲルの調製と細胞ハイドロゲルの混合ステップは、気泡形成がプリントモデルの忠実度を妨げるため、習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。バイオセーフティキャビネットで、3グラムのアルギン酸塩と7グラムのゼラチン粉末を250ミリリットルのビーカーに混ぜます。マグネチックスターラーと100ミリリットルのDPBSを追加します。

ビーカーを滅菌パラフィンフィルムとアルミホイルで密封し、汚染を防ぎます。次に、参加者に、筋電図(EMG)パターンに対応するユニークで特異的な極座標プロットを示します。この後、室温で2時間撹拌を続けます。

ゲルが液体状態への相転移を起こすまで、溶液を摂氏37度で加熱します。次に、溶液を滅菌済みの50ミリリットルの円錐形遠心チューブに移し、密封します。チューブを834 gで5分間遠心分離し、気泡を取り除きます。

次に、ヒドロゲル前駆体を10ミリリットルのシリンジに吸引します。シリンジをキャップとパラフィンフィルムで密封します。使用する準備ができるまで摂氏4度で保管してください。

試験を開始する準備ができたら、調製したヒドロゲル前駆体のシリンジを摂氏37度の水浴に1時間置きます。シリンジが温まっている間に、レオメーターの電源を入れて初期化します。1時間後、シリンジをウォーターバスから取り出します。

約0.5ミリリットルの前駆体をレオメータプラットフォームに押し出します。コントロールパネルで、下向きの三角形のボタンをクリックします。測定ツールがトリミング位置に移動するのを待ちます。

へらを使用して、測定ツールの端から逃げた余分な前駆体を切り取り、余分な材料を廃棄します。次に、鉱物油を測定ツールの端にピペットで移します。オイルが境界を完全に密閉するのを待ちます。

コントロールパネルで、[続行]をクリックします。次に、[スタート]ボタンをクリックします。テストが完了したら、測定ツールを放し、上向きの三角形のボタンをクリックします。

測定ツールを取り外します。測定ツールとプラットフォームの両方を70%エタノールで清掃します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、振幅と温度のスイープを完了します。

等温時間スイープを開始するには、[マイ アプリ] をクリックし、[等温時間-温度テスト] のテンプレートをクリックします。ワークフローの「測定」ステップをクリックします。次に、可変振動ひずみをクリックし、セットアップウィンドウをプルアップします。

振動ひずみを0.1%に設定し、振動周波数を1ヘルツに設定します。プルアップウィンドウで、データポイントの数を120に設定します。データ収集の頻度を 1 分あたり 1 ポイントに設定します。

「追加」ボタンをクリックして、温度変数を追加します。変数温度をクリックし、摂氏 25 度に設定します。ステップ「デバイス」を右クリックし、ワークフローで測定ポイントに移動します。

[削除] をクリックします。次に、[デバイス]、[値の設定]ステップをクリックします。[Wait until value is reached] チェックボックスをオフにし、値を 25 °C に設定します。

画面下部の[画像]、[タイトル]、[ボタン]をクリックします。[続行] ボックスのチェックを外します。次に、ステップ「開始」をクリックし、プロジェクトに名前を付けて保存します。

次に、サンプルをレオメータプラットフォームにロードし、前述の一般的なテストプロトコルに従ってテストを開始します。この後、G素数とGダブル素数を時間に対して観察します。G素数とGダブル素数の交点を求め、交点での時間を求めます。

次に、[テーブル] をクリックし、すべてのデータをコピーして、テキスト ファイルに貼り付けます。さまざまなゲル化時間での降伏強度を測定するには、[マイ アプリ] をクリックします。[降伏と流動応力]、[ゲル状] のテンプレートをクリックします。

このプロジェクトに名前を付けます。次に、ワークフローの [開始] ステップをクリックします。トップメニューで、[挿入]をクリックします。

次に、ドロップダウンメニューで[待機]を選択します。セットアップウィンドウをプルアップし、待ち時間を50分に設定します。[スタート]をクリックし、もう一度[挿入]をクリックします。

ドロップダウンメニューから[デバイス]を選択します。セットアップウィンドウをプルアップし、[温度]を選択して、摂氏25度に設定します。[値に達するまで待つ] ボックスのチェックを外します。

ワークフローで、「測定」ステップを選択します。変数Shear Stressを選択し、セットアップウィンドウをプルアップします。初期せん断応力と最終せん断応力をそれぞれ 0 と 10, 000 パスカルに設定します。

次に、[電卓]をクリックし、[ポイント密度]をパスカルあたり0.2ポイントに設定します。左側の [データ ポイント] タブで、1 秒あたり 1 ポイントを設定します。プルアップ ウィンドウの下部で [Event Control] タブを選択し、基準 [せん断速度が 100/秒を超える場合は測定を停止する] を設定します。

サンプルをレオメータプラットフォームにロードし、前述の一般的な試験プロトコルに従って試験を開始します。テストが完了したら、[ダイアグラム]をクリックしてひずみ-応力曲線を観察します。30 分、40 分、50 分の待機時間でこのテストを繰り返します。

次の手順は、無菌状態で実行する必要があります。まず、バイオプリンターに70%エタノールを十分に噴霧し、一晩紫外線にさらして滅菌します。ハイドロゲル前駆体のシリンジを保管場所から取り出し、摂氏37度の水浴で1時間温めます。

以前に培養した細胞のTフラスコをCO2インキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移します。培地を廃棄し、細胞をDPBSで2回すすぎます。温めたトリプシン-EDTA溶液を細胞に加えます。

摂氏37度で6分間インキュベートします。この後、同じ量のFBSを追加してトリプシンを不活性化します。ハイドロゲル前駆体のシリンジをウォーターバスから取り外し、清掃します。

シリンジをバイオセーフティキャビネットに移す前に、70%エタノールで滅菌します。約3ミリリットルのヒドロゲル前駆体を10ミリリットルの印刷カートリッジに押し出します。前駆体とMDA-MB-231-GFP細胞を1ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度で、泡の発生を避けるためにゆっくりとピペッティングして混合します。

カートリッジをエンドキャップとトップキャップで覆い、パラフィンフィルムで密封します。その後、834 g で 1 分間遠心分離し、気泡を除去します。このプロセス全体を他の前駆体についても繰り返します。

この後、3つのカートリッジすべてを70%エタノールで滅菌します。滅菌したカートリッジをバイオプリンターのチャンバーにロードします。プリンターの制御ソフトウェアで、[手動]をクリックします。

次に、プリンターの制御ソフトウェアの[ツールヘッド]タブを展開します。左側のグラフィックインターフェースでカートリッジを 1 つクリックし、カートリッジの温度を摂氏 25 度に設定し、前駆体が印刷可能な状態になるまで 35 分待ちます。他の 2 つのカートリッジについても、この手順を繰り返します。

プリンタの制御ソフトウェアで、[ツールヘッド]タブを展開します。グラフィックインターフェイスでカートリッジを1つクリックし、[短い測定]ボタンをクリックしてノズルチップの位置を測定します。他の 2 つのカートリッジについても、この手順を繰り返します。

次に、透明なポリスチレン製マイクロプレートをプリンターステージに置きます。Gコードファイルを開き、すべてのカートリッジの圧力を200キロパスカルに変更します。制御ソフトウェアに戻り、[Scaffolder Generator]タブをクリックします。

印刷を開始するポイントを選択し、[実行]ボタンをクリックします。このプロセスを繰り返して、3 回の反復を取得します。この後、100ミリモルの塩化カルシウム溶液を1分間加えて、モデルを架橋します。

DPBSで2回すすいでください。次に、スパチュラを使用して、モデルをアガロースコーティングされた6ウェルプレートに慎重に移します。各ウェルに5ミリリットルのDMEMを添加し、37°C、5%の二酸化炭素でインキュベートし、3日ごとに細胞培養培地を交換します。

本研究では、in vivoの腫瘍微小環境を再現し、多細胞腫瘍スフェロイドの形成を促進するために、三次元ハイドロゲルシステムを作製します。A3G7前駆体の温度スイープは、Gダブルプライムが摂氏37度でGプライムよりも大きいことを示しており、これは前駆体の既知の特性を検証しています。温度が下がると、前駆体は、ゼラチン分子が自発的に物理的に絡み合ってトライヘリックス形成を形成するため、物理的なゲル化を受けます。

GプライムとGダブルプライムの両方が上昇すると、温度が下がって摂氏30.6度で収束し、ゾル-ゲル転移を示します。プリントされたプロペラモデルの共焦点顕微鏡は、MDA-MB-231-GFP細胞が培養期間の15日目にスフェロイドを発達させ始め、スフェロイドは30日目までサイズと数が増加し続けることを示しています。IMR-90-mCherry細胞の一部は、凝集を形成することも見られます。

30日間の培養後、MDA-MB-231-GFP細胞が最初に占めていた領域ではIMR-90-mCherry細胞が観察され、IMR-90-mCherryが優勢な領域ではMDA-MB-231-GFP細胞が観察されました。これは、モデルで発生する可能性のある移行イベントを意味します。ディスクモデルの共焦点顕微鏡法により、MDA-MB-231-GFP細胞はプロペラモデルと同様に振る舞い、21日間の培養後にスフェロイドを含んだハイドロゲルが得られることが明らかになりました。

このモデルをプリントするテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2時間で完了します。この手順を試行する際は、ハイドロゲルと細胞をできるだけ新鮮に保つこと、古いハイドロゲルバッチと新しいバッチを混合しないこと、誤解を招く結果を避けるために無菌条件下で作業することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、走査型電子顕微鏡やタイムラプス顕微鏡などの他の方法を実行して、材料の多孔性、細胞移動率、マトリックスリモデリングなどの追加の質問に答えることができます。

このインビトロモデルにより、共培養系における腫瘍の形成と挙動の系統的に制御された研究が可能になるため、この技術の意味合いはがん治療にも及びます。乳がん細胞以外にも、このモデルは、さまざまな初期位置で他の種類の細胞を使用するシステムにも容易に適用できます。このビデオを見れば、ハイドロゲルを適切に調製し、細胞を埋め込み、最適な印刷ウィンドウ内で材料を印刷することにより、3D不均一疾患モデルを作成する方法を十分に理解できるはずです。

生物学的サンプルの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋、白衣、安全ゴーグルなどの個人用保護具を着用するなどの予防措置が必要であることを忘れないでください。