Name: 組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ単一細胞遺伝子発現解析とFACSを組み合わせた手法で、幹細胞やがん細胞の異質性を分子レベルで解明する方法です。細胞集団の特性評価と治療感受性解析に応用可能です。

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この仕事、医学研究、スウェーデン小児がん財団、ラグナル協会財団と、クヌートとアリス バレンベリー財団でスウェーデンの癌協会、スウェーデン研究評議会、スウェーデン会からの助成金によってサポートします。

1. 溶解プレートの準備
<ol><li>390 μ L ヌクレアーゼ フリー水、10% の 17 μ L を混合することによって、余分な 10% の 96 ウェルの十分な換散バッファーを準備 RNA/DNA 無料ベンチを使用して NP 40 2.8 μ 10 mM dNTP 10 μ L 0.1 M DTT、5.3 μ L RNAse 阻害剤 (材料の表を参照してください)。渦とスピン ・ ダウン。</li>
	<li>96 ウェル PCR プレートの各ウェルに換散バッファーの 4 μ L を配布し、接着フィルムでプレートをシールします。スピン ・ ダウン チューブ、プレートの下部に液体を収集します。ソーティング (最大 24 時間) まで氷の上プレートを保ちます。</li>
</ol>2. 細胞選別の細胞の調製
<ol><li>(ここで、CD34 濃縮造血幹・前駆細胞) 細胞実験の適切な数を解凍します。1 x 10 の6セルは、コントロールと単一細胞の約 3 つの 96 ウェル プレートを並べ替えに適しています。</li>
	<li>15 mL の円錐管に解凍のセルを転送し、1 mL FBS すべて 30 を追加 s 8 mL の容量に達するまで。350 x gで 4 ° C で 10 分間遠心することで細胞をスピンし、上清を除去します。</li>
	<li>8 mL のバッファーを染色に細胞を再懸濁します (PBS 2 %fbs) と 4 ° C で 10 分間 350 × gで遠心し、上清を除去。</li>
	<li>200 μ L 染色バッファーと削除セル コントロールの汚れのために細胞を再懸濁します。</li>
	<li>マイナス 1 つコントロール (FMOs) 各 fluorophore の 50 のセルの割合を染色して蛍光を作る染色バッファー μ L。この例では 20,000 セルと 6 の遠心管は、FMOSs として使用されます。セルの数が人口調査に応じて調整されることに注意してください。各管に 1 つを除いてサンプル染色のように同じ濃度で全ての抗体を追加します。</li>
	<li>使用各 fluorophore の 50 μ L バッファーのセルの割合の汚損によって各 fluorophore の単一の汚れを確認します。この例では 20,000 セル 6 遠心管を使用します。各抗体のターゲットがコントロールに使用される細胞によって表現される必要があることに注意してください。個々 のチューブのサンプルの汚れのように同じ濃度で各抗体を追加します。無染色のコントロールとして 50 μ L に 20,000 無染色の細胞をさらにしてください。</li>
	<li>セルのサンプルするには、適切な濃度で抗体を追加します。CD90 PE CD45RA bv421 1/50、1/50 CD49F-PECy7 とリネージュ ミックス 1/10 CD38 APC 1/50、1/100 濃度で CD34 FITC をここでは使用される: CD3 PECy5 1/50、CD2 PECy5 1/50、CD19 PECy5 1/50、CD56 PECy5 1/50、CD123 PECy5 1/50、CD14 PECy5 1/50、CD16 PECy5 1/50 とCD235a PECy5 1/1000。</li>
	<li>暗闇の中で氷の上で 30 分間抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>3 ml のバッファーを汚すセルを洗浄します。4 ° C で 10 分間 350 x gで細胞を遠心し、上清を除去します。</li>
	<li>細胞を再懸濁します、2.9 の手順を繰り返します。</li>
	<li>500 μ L のサンプルと 100 FMOs を再懸濁します μ L 単一細胞懸濁液を得るために 50 μ m フィルターを通して 1/100 7AAD とフィルターのセルを持つバッファーを染色します。</li>
</ol>3. セルの並べ替え
<ol><li>FACS マシンが設定されていることを確認正しくとドロップ遅延の cytometer セットアップ追跡 (CST) 適切なセルが並べ替えられていることを確認するための製造元の指示に従って実行された最近のアップ。最適なイベント率が 800、2000 年イベント/秒の間は、造血細胞の 4 の 85 ミクロン ノズルと最大速度の使用をお勧めします。</li>
	<li>蛍光補正を実行することによりスペクトルの重複の修正、FMO コントロールまたは内部のマイナス コントロールによるとゲートを設定します。</li>
	<li>ターゲット人口の再解析を実行するには、染色バッファーの 100 μ L を新しい微量遠心チューブに少なくとも 100 の標的細胞を選別します。FACS は並べ替えられたサンプルを記録することによって、細胞を分析し、彼らは並べ替え門で終わるかどうかを確認します。</li>
	<li>96 ウェル プレートにも A1 にドロップを中心として並べ替え設定単セル板。それが中央寄せの場合は、すべての井戸で各ウェルの中央のセルを得るが空 96 well プレートのエッジの周りのすべての井戸に 50-100 6 μ m の粒子を並べ替えます。</li>
	<li>可能であれば、体外で成長の単一セルを並べ替えることにより実行可能なセルが並べ替えられていることを確認する追加のコントロールを追加できます。FLT3L、TPO と SCF、造血細胞を 100 μ l 論文 1% ペニシリン ストレプトマイシン、100 ng/mL で U 下 96年ウェル プレートで栽培できます。顕微鏡を用いた細胞コロニーのため 3 日間の培養後各ウェルを分析します。</li>
	<li>プレートから粘着フィルムを削除します。96 ウェルから 92 への興味 (ここで林-cd 34 + CD38-細胞) の並べ替え 1 つのセルは、各単一セルの (CD90、CD49f、ここ CD45RA) 興味の他のマーカーの肺浸潤プロファイルを保存するソフトウェアを並べ替え FACS でインデックス ソートを有効にします。</li>
	<li>PCR 増幅直線性コントロールのそれぞれ 10 と 20 のセルを持つ 2 つの井戸を並べ替えます。井戸 H1 と H2 は通常使用されます。</li>
	<li>いいえテンプレート コントロール、通常 H3 と H4 の井戸として任意のセルのない 2 つの井戸を保ちます。</li>
	<li>透明粘着フィルムでプレートをシールし、300 x gスナップ ドライアイスで凍結する前に 1 分でプレートをスピンします。</li>
	<li>冷凍板-80 ° C で保存します。 注: 安全な停止ポイント。並べ替えや分離細胞は長期保存用-80 ° C で保存できます。</li>
</ol>4. 逆転写と特定のターゲットの増幅
<ol><li>96 遺伝子のすべてのターゲットのプライマー ミックスを準備するには、1.5 mL RNA/DNA 無料ベンチに RNAse フリー チューブでハウスキーピング遺伝子のプライマーおよびスパイクの制御、RNA のプライマーを含む各プライマーの 2 μ L を追加します。未満 96 プライマーを使用している場合は、不足しているプライマーのヌクレアーゼ フリー水の相当量を追加します。プライマーは、目的遺伝子のパネルに合わせて個別に並べられます。</li>
	<li>逆のトランスクリプションとミックス 632.5 μ L 2 x 反作用の組合せ、101.2 μ L を追加することによって特定のターゲット増幅 Taq/SuperscriptIII、151.8 μ L プライマー ミックス、およびコントロール RNA のスパイク 0.7 μ L。DNA 無料ベンチ上のこの手順をプリフォームします。ボルテックスし、スピンダウン機能収集管の底で液体をミックス。サンプルに加えまで氷の上を保ちます。</li>
	<li>2 x 反作用の組合せの 27.5 μ L、Taq の酵素の 1.76 μ L、プライマー ミックスの 6.6 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 2.64 μ L を混合することにより 4 つの井戸を作るない逆のトランスクリプション コントロール ミックス。コントロール RNA をスパイクします。DNA 無料ベンチでこの手順を実行します。渦とダウン サンプルを収集、チューブや追加まで氷の下に液体のスピン。</li>
	<li>雪解けの氷のライセート プレート。直線性といいえテンプレート コントロールを含む 92 の井戸に事前に準備された逆のトランスクリプションおよび特定のターゲット増幅ミックスの 8.75 μ L を追加します。4 つの残りのウェルにない逆転写制御ミックスの 8.75 μ L を追加します。透明粘着フィルムとプレートの下部に収集の液体までスピン プレートをシールします。</li>
	<li>プリアンプ プログラムに応じて PCR マシンでプレートを実行して逆のトランスクリプションおよび特定のターゲットの増幅をプリフォームします。ステップ 1:50 2:95 ° C を 2 分間ステップ 15 3:95 ° C、60 分の ° C s、ステップ 4:60 ° C で 4 分、繰り返し手順 3-4 24 回し、最後にステップ 5:8 ° C を永遠に。</li>
	<li>PCR が完了したら後、は、8 ° C、短期記憶と長期記憶の-20 ° C でプレートを保ちます。 注: 安全な停止ポイント。短期的なストレージの 8 ° c と長期保存のための-20 ° C で、増幅された材料を保つことができます。</li>
</ol>5. 多重マイクロ遺伝子発現解析のためのサンプルとアッセイ プレート準備
<ol><li>注 3 によって積載面の試金を準備 96 well プレートの各ウェルに μ L 測定荷重試薬。各プライマーの 3 μ L を積載面分析で個々 の井戸に追加します。</li>
	<li>粘着フィルム ・ プレートの下部に収集の液体までスピン プレートをシールします。</li>
	<li>96 well プレートのすべてのウェルに無料水ヌクレアーゼの 8 μ L 分注、希釈プレートを準備します。1:5 の最終希釈を作る希釈プレートに増幅されたサンプルの 2 μ L を追加します。</li>
	<li>シールの粘着フィルム、プレート、10 のボルテックス板によるミックス s と最後にプレートの下部に収集の液体までスピンします。</li>
	<li>慎重にサンプル読み込み試薬の 35.2 μ L でのマスターの組合せの 352 μ L を混合することによってサンプル読み込みミックスを準備します。96 well プレートの各ウェルにミックスの読み込みの早かった 3.3 μ L、サンプル板を準備します。</li>
	<li>試料プレートの各ウェルに、希釈したサンプルから 2.7 μ L を追加します。</li>
	<li>粘着フィルム ・ プレートの下部に収集の液体までスピン プレートをシールします。</li>
</ol>6. マイクロ流体チップの読み込み
<ol><li>新しい 96 x 96 マイクロ流体チップを取り出してください。彼らを移動できることを確認するためにキャップのついた注射器で彼らを突き、入り江を準備します。</li>
	<li>注射器から泡を削除します。チップを 45 度傾けるとバルブを押しながら各バルブにシリンジのフル ・ ボリュームを追加します。IFC コント ローラー チップを首相します。</li>
	<li>積載面試金で井戸のそれぞれから 4.25 μ L で各分析の入口をロードします。泡を避けるため。井戸の中に泡が表示される場合、は、ピペット チップを削除します。</li>
	<li>積載面サンプルでは井戸の各から 4.25 μ L で各サンプル入口の読み込みを続行、泡を避けるため、泡が表示される場合は、ピペット チップとそれらを削除します。</li>
	<li>IFC のコント ローラー チップを読み込みます。</li>
	<li>チップにも見えることと、すべての部屋が読み込まれたことを確認します。テープでそれに触れることにより、チップ表面からほこりを削除します。マイクロ多重遺伝子式プラットフォームでチップを実行します。</li>
</ol>7. マルチプレックス マイクロ遺伝子式プラットフォームでチップを実行します。
<ol><li>マイクロ多重遺伝子式プラットフォームにチップをロードした後、サンプルを名前します。</li>
	<li>受動的な染料として ROX を設定します。蛍光として単一のプローブと FAM MGB を設定します。96 x 96 標準 v2 をプロトコルとして使用します。実行を開始します。</li>
	<li>実行すると削除チップは完了です。</li>
</ol>8 チップの予備的分析
<ol><li>リアルタイム PCR 解析ソフトウェアにデータを読み込みます。</li>
	<li>タブ区切りのファイルから細胞、遺伝子のレイアウトを貼り付けることで、遺伝子名とセル名を読み込みます。</li>
	<li>イメージ ビューを開き、染料として ROX を選択します。チェックすべての井戸が ROX 受動的な色素を持っているかどうか。</li>
	<li>すべて増幅プロット見て ok、スパイク (図 3 eに類似) で滑らかな増幅曲線を場合を調査します。</li>
	<li>スパイクのコントロールすべてが正常に読み込まれたことを確認する RNA の発現があるすべての単一セルを確認します。</li>
	<li>すべてのセル ハウスキーピング遺伝子発現がある、従って正しく並べ替えられていることを確認します。</li>
	<li>10 と 20 のセル直線コントロールがある線形増幅を検証する約 1 CT 違いを確認します。</li>
	<li>水資源コントロールのサンプル式があるかどうかはチェックしてください。水資源の式が検出された場合は、以降の実行のゲノム DNA を検出するプローブにプローブを変更してみます。</li>
	<li>さらに分析は、csv ファイルのデータをエクスポートします。</li>
</ol>9 SCExV を使用して単一細胞解析
注: 入門映画は現在20ツールを紹介します。ここでは、プロトコルに導入されたコントロールを使用して分析を行う方法の短い勧告が表示されます。
<ol><li>20SCexV のウェブサイトに接続します。</li>
	<li>エクスポートした CSV ファイルをアップロードします。</li>
	<li>肯定的な制御としてスパイクのコントロール RNA を選んだ。25 上コントロール RNA CT のあるセルを削除します。中央コントロール RNA 発現データを正規化します。</li>
	<li>"分析を -> 実行ここで"をクリックします。セルのオプションを除外で水資源、notemplate、10 と 20 のセル コントロールを削除します。</li>
	<li>クラスター数の期待値で任意のクラスタ リング手法とクラスターのセルです。分析値をエクスポートします。</li>
</ol>10. インデックス ソートの分析
<ol><li>FACS 解析ソフトウェアを開き、インデックスのサンプルをロードします。</li>
	<li>スクリプト エディターを開き、j ・ クインらから利用可能なスクリプトを実行21
</li>
	<li>今では FACS 解析ソフトウェアは、単一のセルの各ゲートをしなければならないで、レイアウト エディターを開き、SCexV ("Sample_complete_Data.xls"という名前のファイルで利用可能) からグループ化による細胞の色します。</li>
</ol>

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<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
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著者が明らかに何もありません。

近年では、1 細胞遺伝子発現解析は様々 な細胞集団23の不均一性を定義する貴重な追加になりました。RNA シーケンス テクノロジーの出現は、しかし、これらのメソッドは、セルのセル配列の深さやドロップ アウトの変化によって複雑な理論的にセルの全体のトランスクリプトームを測定する可能性を提供します。何百ものすべてのセルが重要な遺伝子の発現の敏感でロバストな解析は技術的な騒音低減に同様に、扱われる単一セル qPCR を提供します。成績証明書の限られた数の焦点を絞った分析また高発現遺伝子から干渉されることがなく簡易解析できます。
アプローチのみ調査する細胞で発現する遺伝子のサブセットから高い遺伝子パネルをデザインするときに、適切な遺伝子のセットを選択することが重要です。遺伝子の選択は、いくつかの方法で行うことができます。文学、一括解析と公開されているデータのバイオインフォマティクス解析による前の調査結果。これに足らない;しかし、遺伝子の正しいセット アプローチは非常に強力することができます。遺伝子パネルに設計されている、プライマーが多重化中に...

それぞれ個々 の白血球細胞が幹細胞が最終的に末期特定を運ぶ最終的なエフェクター細胞に分化ますますコミットの中間の前駆細胞の一連の上に頂点を形成、細胞の階層内に存在すると考えられています。生体機能1。幹細胞システムの構成方法に関する知識の多くは前向きの高濃縮幹細胞や前駆細胞様々 な2 異なる造血集団を切り離すことができるため主造血系で発生しています。FACS を並べ替えています。これが分析する機能や分子、主に遺伝子発現プロファイリング3,4を介してこれらの人口の多くはできました。ただし一括集団個体差細胞の遺伝子発現解析は、平均し、5を失った。したがって、異種細胞内細胞の変化を検出する無能を混同するかもしれない重要な生物学的プロセスの私達の理解場合細胞の小さなサブセットは、人口6の推定される生物学的機能の 7。逆に、単一セルの解像度で遺伝子発現シグネチャの調査は、不均一性を表し、セル8のあるサブセットから覆っの影響を回避する可能性を提供しています。
日付 1 細胞遺伝子発現解析のための多くのプロトコルが開発されました。それぞれの方法で、独自の注意事項があります。最も早い方法であった RNA 蛍光その場で交配 (RNA-魚)、一度に転写産物の限られた数を測るが、RNA 局在9,11の調査のことでユニークです。単一または非常に少数の成績証明書も検出する PCR と qPCR 使用初期の方法は、12を開発しました。ただし、これらが最近交換済み qPCR を通して細胞の何百もの細胞 1 個あたりの成績の何百もの式を同時に分析でき、したがって高次元不均一性解析の使用を許可するマイクロ流体法によるあらかじめ決められた遺伝子パネル10,13。最近 RNA シーケンス技術普及して単一細胞解析、これらは理論的にセルの全体のトランスクリプトームを測定することができ、それにより不均一性解析10、に探索的次元を追加14. 多重 qPCR 解析と単一細胞 RNA シーケンスが異なる機能を持っている、従ってメソッドのいずれかを使用するための理論的根拠はターゲット人口のセルの数だけでなく、質問に決まります。高スループットと単一細胞 RNA シーケンスの公平な探索特性と共にセルあたりの低コストは、不明なセルまたは大規模な集団を調査したときに望ましいです。ただし、単一細胞 RNA シーケンスは低豊富で成績証明書が脱落しやすいより頻繁高い豊富な成績証明書のシーケンスに偏っても。これはバイオ情報解析は、しばしば微妙なや技術的ノイズ15に隠された重要なの分子シグナルを明らかにするために高需要を置くかなり複雑なデータにつながることができます。したがって、よ特徴付けられた組織の単一セル qPCR による解析済みプライマー パネルの機能的に重要な遺伝子や分子マーカーの選択することができますの不均一性を決定するための敏感な簡単なアプローチとして、人口。しかし、それは比較するに注意する必要があります単一細胞 RNA シーケンス、セルあたりのコストが単一セル qPCR 法一般的に高くなっています。ここでは、単一セル Rt-qpcr (Teles J.らから変更を組み合わせたアプローチについて述べる16)、FACS インデックスに集団内で分子と肺浸潤の不均質性を特徴付けるために17バイオインフォマティクス解析18を同時に並べ替え。
このアプローチで興味の細胞を染色すると、単一セルは、96 ウェル PCR プレートの換散バッファーに直接 FACS によって並べ替えられます。同時に、細胞表面マーカーの追加セットの表現のレベルは、FACS-並べ替え、インデックス並べ替えと呼ばれますメソッド中に単一セルごとに記録されます。物質分離細胞は増幅されその後、RT qPCR、マイクロ流体プラットフォームを使用して、選択した一連の遺伝子の遺伝子発現分析します。この方法により、個々 のセルのセル表面のマーカー式の並べ替えられた同時と同様シングル セル特性の分子分析です。細胞の分子特定サブセットをインデックス付きの並べ替えられたマーカーの発現に直接マップによって subpopulations は、将来の分離に使用できます特定イムノフェノ タイプにリンクできます。メソッドの説明図 1で一歩一歩。微妙な遺伝子式信号を見えなくことができますそれ以外の場合は無関係の豊富な遺伝子の測定を回避できますので、さらにパネルであらかじめ決められた遺伝子は目標とされた遺伝子の表現のより高い解像度に貢献します。さらに、特定のターゲットの増幅、1 つのステップの逆のトランスクリプションおよび増幅できます低表現された成績証明書、転写因子や非ポリ adenylated Rna のような堅牢な測定。重要なは、qPCR 法19特定の悪性疾患を調査するときに重要である融合蛋白質から mRNA の測定を可能にします。最後に、遺伝子の数は集中を調査した、低ドロップ アウト率と単一細胞 RNA シーケンスより高い次元のメソッドと比較して限られた細胞をこのメソッドを簡単に分析した技術的な差プロトコルに従うことによって実験全体から実行できます、このシンプルで簡単な高感度、高スループットの単一細胞遺伝子発現解析法を作って 3 日以内、分析結果にセルを並べ替えします。

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>クローン:61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>クローン:3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5</td><td></td><td>Biolegend 304608</td><td>クローン:MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>クローン:HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>クローン:RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>クローン: HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>306008</td><td>クローン: 6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>BD Pharma</td><td>559944</td><td>Clone GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>Clone: 561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>Clone: Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>クローン: 5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD bioscience</td><td>560362</td><td>クローン: HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>クローン: eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>96-well u-bottom Plate</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>Stem cell technologies</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorph tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>CST ビーズ</td><td>BD</td><td></td><td></td>642412</tr><tr><td>アキュドロップビーズ</td><td>BD</td><td>345249</td><td>6 &m個の粒子&nbsp;</td></tr><tr><td>粘着フィルム クリア</td><td>ーサーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>粘着フィルム箔</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルPCRプレート</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR 1.5 mL チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 PCR cycler</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10% NP40</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>宝</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>RNAse 阻害剤</td></tr><tr><td>CellsDirect ワンステップ qRT-PCR キット</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Neuclease free water</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>from CellsDirect kit</td></tr><tr><td>2xCells</td><td>Directキットの</td>反応ミックス<td>Invitrogen</td><td>11753-100</td></tr><tr><td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>のCellsDirectキット</td></tr><tr><td>プラチナ&nbsp;Taq&nbsp;DNA ポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA Control</td><td>Invitrogen</td><td>の 4386995</td><td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td></tr><tr><td>20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td></tr><tr><td>96.96 Sample/Loading Kit&mdash;10 IFCs</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x Assay Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>from 96.96 Sample/Loading Kit</td></tr><tr><td>20x GE Sample Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>from 96.96 Sample/Loading Kit</td></tr><tr><td>Control line fluid&nbsp;</td><td></td> 96.96 <td></td><td>サンプル/ローディングキット</td></tr><tr><td>TaqMan 遺伝子発現マスターミックス</td><td>応用バイオシステム</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 ダイナミックアレイ IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar</td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>FluidigmリアルタイムPCR分析</td><td>Fluidigm</td><td>Fluidigm</td><td></td></tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td></tr><tr><td>ACE</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00174179_m1</td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00169233_m1</td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL.52</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs03043652_ft</td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs03024541_ft</td><td></td></tr><tr><td>BMI1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00995536_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNA2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00996788_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01030099_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01084593_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNC</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNE1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01026535_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNF</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10.MME</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00153510_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11a</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11c.ITAX</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00174217_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD123。IL3RA</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00608141_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD133。PROM1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220.INSR</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00961554_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD24。HSA</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs03044178_g1</td><td></td></tr><tr><td>NCOR1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01094540_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD26。DPP4</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00175210_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD274</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01125301_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD276</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00987207_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD32.FCGR2B</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01634996_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD33</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344.FZD4</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00201853_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD352。SLAMF6</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD38</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01120071_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD41.ITGA2B</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01116228_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD49f.ITGA6</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01041011_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD56.NCAM1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00941830_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD97</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00908458_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDK6</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01026371_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1A</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00355782_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1B</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01597588_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1C</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00175938_m1</td><td></td></tr><tr><td>CEBPa</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00269972_s1</td><td></td></tr><tr><td>CSF1r</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00911250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CSF2RA</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td></td><td></td>Hs00531296_g1</tr><tr><td>CSF3RA</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01114427_m1</td><td></td></tr><tr><td>E2A.TCF3</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00413032_m1</td><td></td></tr><tr><td>EBF1</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01092694_m1</td><td></td></tr><tr><td>ENG</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00923996_m1</td><td></td></tr><tr><td>EPOR</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00959427_m1</td><td></td></tr><tr><td>ERG</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01554629_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLI1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00956711_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLT3</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00174690_m1</td><td></td></tr><tr><td>FOXO1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01054576_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>GATA1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00231112_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA2</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td></td><td></td>Hs00231119_m1</tr><tr><td>GATA3</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00231122_m1</td><td></td></tr><tr><td>GFI1</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr><td>HES1</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01118947_g1</td><td></td></tr><tr><td>HLF</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00171406_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMGA2</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00171569_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXA5</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00430330_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXB4</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00256884_m1</td><td></td></tr><tr><td>ID2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs04187239_m1</td><td></td></tr><tr><td>IGF2BP1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00198023_m1</td><td></td></tr><tr><td>IGF2BP2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01118009_m1</td><td></td></tr><tr><td>IKZF1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00175238_m1</td><td></td></tr><tr><td>ITGB7</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01565750_m1</td><td></td></tr><tr><td>KIT</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td></td><td></td>Hs00174029_m1</tr><tr><td>Lin28B</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01013729_m1</td><td></td></tr><tr><td>LMO2</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01017441_m1</td><td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01032443_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPO</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs00924296_m1</td><td></td></tr><tr><td>NFIB</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>Notch1</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs01062011_m1</td><td></td></tr><tr><td>Pten</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>Hs02621230_s1</td><td></td></tr><tr><td>RAG2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01851142_s1</td><td></td></tr><tr><td>RPS18</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile.IgH</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Hs00169795_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

肺浸潤の評価と分子解析長い不均一性を表し、明確な細胞集団を定義に使用されています。FACS は本質的に単一セルの試金、しかし分子解析する前に、標的細胞は、一括で分離されたよく前向き単一セルの解像度を失うこと。単一細胞の遺伝子発現解析は、異種細胞集団の個々 のセルの分子の違いを理解するための手段を提供します。一括細胞分析で異なる細胞型の overrepresentation 結果バイアスと希少な細胞からの信号の咬合の生物学的重要性。FACS インデックス並べ替え結合した単一細胞遺伝子発現解析を活用することにより集団調査できる単一セルの解像度の損失なし中間細胞表面マーカーの発現と細胞もキャプチャされます, 中の評価を有効にします。連続表面マーカー発現の関連性。ここでは、逆のトランスクリプションの単一セルを組み合わせたアプローチについて述べる定量的 PCR (RT qPCR) および FACS インデックスを同時に分子を特徴付ける並べ替えおよび細胞集団内で肺浸潤の不均一性。
単一細胞 RNA 配列方法と対照をなして特定のターゲットの増幅と qPCR を使用少ない落ちこぼれで低豊富な転写産物の堅牢な測定のためにはしない読み取りの細胞間の変動に関連する問題によって混同される中深さ。また、直接インデックス並べ替え単一セル換散には、このメソッドをバッファーにより cDNA を合成して特定のターゲット中古増幅の細胞表面で分子の署名の後派生の相関に関しては同様に 1 つのステップで実行するにはマーカー式。造血の単一細胞を調べるのにも他のセルタイプで正常に使用されている記述方法をしました。
結論としては、記載方法は明確な分子集団のそれに続く分離のためのプロトコルを開発するパネルの可能性は、事前に選択された遺伝子の mRNA 発現の高感度に測定できます。

説明されたプロトコルは、簡単に実行、迅速かつ信頼性の高いです。実験のセットアップの概要については、図 1にされます。特定のターゲットの増幅、遺伝子発現測定および予備的な分析に、単一セルの並べ替えから、プロトコル全体は、3 日間で実行できます。96 プライマーといずれかの慢性骨髄性白血病 (CML) 患者から 96 セルまたは健康な高齢者一致から 96 セルを用いた単一細胞遺伝子発現解析からの予備的な分析データを表す熱マップの形で解析結果の例コントロールは、図 2で示されます。階層的クラスタ リングを使用して、分析された細胞は、その遺伝子発現シグネチャに基づいて 4 つのサブグループに分けることが。熱マップの視覚エフェクトは、解析 (制御井戸など) から除外すべき井戸のコントロールだけでなく、データの概要を取得する便利な方法です。図 2 bは各グループの細胞が次元縮約を使用して互...

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically 分子細胞集団を特徴付けます。

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

この方法は、幹細胞の異質性がどのように見えるか、敏感な癌細胞の治療をどのように分離できるかなど、幹細胞分野やがん分野の重要な質問に答えることができます。この研究の主な利点は、技術的に堅牢な単細胞遺伝子発現解析とバクチノーシスを組み合わせて、標的亜集団のさらなる下流特性化を行う点である。この方法は、癌および幹細胞の不均一性を調べるのに使用することができるが、それはまた、遺伝子のプライミングおよび系統電位に関する洞察を与えることができる。このプロトコルを開始するには、RNA/DNAフリーベンチで、390マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、10%NP-40の17マイクロリットル、2.8マイクロリットル10ミリモルdNTP、10マイクロリットル0.1モルDTT、および5.3マイクロリットル阻害剤を混合することによって、10%余分な96ウェルに十分なリシスバッファーを調製します。渦とチューブをスピンダウン。次に、96ウェルPCRプレートのウェルに4マイクロリットルのライシスバッファーを分配し、粘着フィルムでプレートを密封します。プレートを回転させ、底面の液体を集める。プレートを氷の上に置いておき、セルの並べ替えが最大24時間続くまで保管します。FACSマシンが適切にセットアップされたら、少なくとも100個のターゲットセルを100マイクロセントリフュージチューブに仕分けし、100マイクロリットルの汚れバッファーを持つ新しいマイクロ遠心分離管に選別して、ターゲット集団の再分析を行います。FACS は、並べ替えられたサンプルを記録して並べ替えられたセルを分析し、並べ替えゲートで終了することを確認します。その後、96ウェルプレートのウェルA1にドロップをセンタリングすることによって、単一セルプレートのソートを設定します。中央に配置されたら、空の96ウェルプレートの端の周りのすべての井戸に50〜106マイクロメートルの粒子をソートし、すべての井戸が各ウェルの中央に細胞を得ることを保証します。プレートから粘着フィルムを取り除きます。Lin-CD34とCD38マイナスセルの単一のセルを96個のウェルのうち92個に並べ替えます。FACSソートソフトウェアでインデックスソートを有効にして、単一のセルごとにCD45RA、CD49F、CD90の免疫フェノミクスプロファイルを保存します。PCR増幅における直線性制御のために、それぞれ10個と20個の細胞を持つ2つのウェルをソートします。通常はウェルスH1とH2が使用されます。テンプレートコントロールなしのセルなしで2つの井戸を保ちます, 通常、ウェルH3とH4.プレートを透明な粘着フィルムで密封し、1分間300倍の重力でプレートを回転させます。スナップはドライアイスの上にプレートを凍結します。その後、マイナス80度で保存します。逆転写およ

a-combinatorial-single-cell-approach-to-characterize-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。...

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。...

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

我々は、摂動に応答して異種細胞集団動態を研究するための新規プロトコールを開発した。この原稿では、異種細胞集団の複数の細胞表現型を堅牢な方法で同時に特性決定するための定量的データセットを作成する画像ベースのプラットフォームについて説明します。...

定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。...

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

単一細胞/単一核のトランスクリプトミクスおよびマルチオミクスの成功は、細胞/核の品質に大きく依存します。したがって、組織からの細胞/核の分離とその精製は高度に標準化されなければなりません。このプロトコルは下流の単一核のmultiomeの試金のための頭脳および骨髄からの核の準備を記述する。...

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。...

ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

ここで紹介するプロトコールは、シングルセルマスサイトメトリーによる筋幹細胞および前駆細胞の同定と高次元解析、およびFACSによるそれらの精製を可能にし、それらの機能の詳細な研究を可能にします。このアプローチは、疾患モデルにおける再生動態の研究や、薬理学的介入の有効性の検証に適用することができます。...

高次元シングルセルマスサイトメトリーによる急性骨格筋損傷時のin vivoにおける筋原性前駆細胞の同定と解析

ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。...

造血器官からの間質細胞の単離

学ぶ単一細胞遺伝子発現解析とFACSを組み合わせた手法で、幹細胞やがん細胞の異質性を分子レベルで解明する方法です。細胞集団の特性評価と治療感受性解析に応用可能です。

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

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