哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製
2018年8月2日
イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2 +の家族の浄化の段階的な手順を述べる-Cl-チャンネルを活性化します。
この方法は、哺乳類のイオンチャネルの生物物理学に関連する主要な質問に答えるのに役立ちます(ただし、イオンチャネルのベストロフィンファミリーに限定されません)。この技術の主な利点は、他のタイプのイオンチャネルに適用でき、さまざまなダウンストリームのin vitroアッセイの主要な生成物を生成できることです。精製されたタンパク質を使用したアッセイは、ベストロフィンチャネルが網膜でどのように機能し、BEST1遺伝子の変異がどのように黄斑変性症を引き起こすかについての知識に貢献するため、この技術の意味はベストロフィノパチーの治療にまで及びます。
ウイルス感染の24時間前に、15マイクロリットルの細胞培養物に等量のトリパンブルーを加えHEK293F顕微鏡下の血球計算盤を使用して細胞密度と生存率を確認します。細胞数を行った後、2リットル分の使い捨てフラスコ2個をそれぞれ2つの使い捨てフラスコに500ミリリットルの容量で1ミリリットルあたり0.6倍〜6個分の細胞をプレート化する。フラスコを37%の二酸化炭素を含む摂氏8度の加湿インキュベーターに入れます。
軌道プラットフォーム上で培養物を135rpmで回転させます。感染当日は、前回と同様に培養液の15マイクロリットルアリコートの細胞密度と生存率を確認します。95%を超える高い細胞生存率は、効率的な感染とタンパク質発現に不可欠です。
予想される細胞密度は、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の約1倍であり、予想される細胞の総数は、10〜9の1倍程度である。P3バキュロウイルスを5回の感染の多重度で細胞に加えます。接種するウイルスの量を決定するには、画面に表示される式を使用します。
その後、接種した細胞を24時間インキュベートします。24時間後、酪酸ナトリウムを最終濃度10ミリモルまで各細胞培養物に加え、摂氏37度または摂氏30度に設定したインキュベーターに48時間戻します。48時間後、蛍光顕微鏡でタンパク質を直接表す緑色細胞の割合と明るさを確認します。
細胞を4°Cで1, 000倍gで20分間遠心分離して細胞を回収します。上清を取り除き、細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で最終容量約80ミリリットルまで再懸濁します。各細胞懸濁液を2本の50ミリリットル円錐管に分割し、1, 000倍gおよび摂氏4度で20分間遠心分離します。
タンパク質精製手順を開始するには、まず細胞ペレットを室温の攪拌水浴で解凍します。10〜15分後にペレットが解凍されたら、プロテイナーゼ阻害剤を添加したバッファーAの2倍の量に細胞を再懸濁します。広範囲にピペットで上下させて、均質な細胞懸濁液を得ます。
高圧ホモジナイザーを使用して細胞を溶解します。細胞懸濁液を7〜10メガパスカルのホモジナイザーに3〜4回通して、完全な均質化を達成します。細胞ライセートを氷上に置いて、ラウンドの合間に2〜3分間保管します。
細胞溶解物に界面活性剤を添加します。20°Cで1時間撹拌しながらインキュベートし、膜タンパク質を抽出します。インキュベーション後、細胞溶解物を150,000回gで4°Cの超遠心分離機で1時間遠心分離します。
遠心分離後、明細胞溶解物は下部のペレットと上部の曇った層の間に挟まれます。10ミリリットルのトランスファーピペットを使用して透明なライセートを慎重に収集し、最後の数ミリリットルのライセートを1ミリリットルのピペットに切り替えます。バッファーAで事前に平衡化した5ミリリットルのHisTrapニッケルNTAアフィニティーカラムにライセートを塗布します。次に、25ミリリットルのバッファーBでカラムを洗浄し、続いて40ミリリットルのバッファーCでカラムを洗浄します。ここでプロトコールを一時停止できます。
タンパク質は、カラムに一晩付着している間、安定したままです。洗浄後、カラムを高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに接続し、カラムのタンパク質を13ミリリットルのバッファーDで希釈し、分画します。タンパク質が豊富な画分をUV吸光度の読み取り値に従って収集します。
溶出したタンパク質製品の濃度を微量分光光度計で測定し、280ナノメートルの吸光度を読み取ります。GFP10x hisタグを除去するには、TEVプロテアーゼを1対1の質量比で添加し、摂氏4度で30分間インキュベートします。15ミリリットルの遠心フィルターユニットを使用して、摂氏4度の遠心分離機で10分から始まる可変間隔で4,000倍gで回転することにより、タンパク質を400〜500マイクロリットルの最終容量に濃縮します。
濃縮されたタンパク質を清潔な1.5ミリリットルのチューブに移し、濃縮された製品から沈殿物や気泡を取り除きます。摂氏4度で5〜10分間、12, 000倍gで回転させ、上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。1ミリリットルのシリンジと丸い先端の針を使用して、最終製品をFPLCシステムにロードし、バッファーE.Well-behavedタンパク質で事前に平衡化されたサイズ排除カラムを備えたサイズ排除クロマトグラフィーを行います。
そのピークに対応するタンパク質画分または複数の画分を収集します。以前に使用したのと同じ分子量カットオフの4ミリリットルまたは0.5ミリリットルの遠心フィルターユニットでタンパク質を濃縮します。摂氏4度でgの4,000倍で回転させ、マイクロリットルあたり5〜10マイクログラムの最終濃度にします。
分光光度計を使用して、最終製品の濃度を確認します。ここで見られる一過性トランスフェクトされた接着性HEK293細胞で観察された蛍光強度は、ここに示されている懸濁HEK293F細胞における予測タンパク質発現レベルの優れた指標です。精製が成功したかどうかは、サイズ排除クロマトグラフィーの予想される希釈量での単一のメインピークと、変性したSDSページゲル上の単一のドミナントバンドによって示されます。
この手順を試みる際には、精製中にすべてを氷上に保つこと、および同時に複数の精製を行う場合は、手袋を頻繁に交換し、サンプルを汚染しないように注意することが重要です。この手順に続いて、X線結晶構造解析や脂質二重層アッセイなどの他の方法を実行して、構造機能の関係などの重要な質問に答えることができます。その開発後、この技術は、遺伝性網膜疾患の分野の研究者が分子レベルでベストロフィノパチーの原因を探求する道を開きました。
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概要
この記事では、Ca2+活性化Cl-チャネルである哺乳類ベストロフィンタンパク質の発現と精製の方法について説明します。この精製プロセスにより、これらのイオンチャネルの機能と構造のin vitroでの研究が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物物理学
- イオンチャネル生物学
背景
- ベストロフィンタンパク質は、網膜の健康に関与するイオンチャネルのファミリーです。
- BEST1遺伝子の変異は黄斑変性と関連しています。
- これらのチャネルの理解は、ベストロフィン病の治療戦略に情報を提供します。
- イオンチャネルの精製は、その生物物理的特性の研究に不可欠です。
研究目的
- ベストロフィンタンパク質の精製のための詳細なプロトコルを提供すること。
- イオンチャネル機能の理解を深めるための下流アッセイを促進すること。
- 網膜のベストロフィンチャネルに関する知識に貢献すること。
使用された方法
- タンパク質発現のためのHEK293F細胞の培養。
- 細胞生存率評価のためのトライパンブルーの使用。
- タンパク質生産に最適化された培養条件。
- ベストロフィンタンパク質を分離するための段階的な精製技術。
主な結果
- 哺乳類ベストロフィンタンパク質の発現と精製の成功。
- in vitroアッセイのための主要製品の生成。
- ベストロフィンチャネルの生物物理学に関する洞察。
- 黄斑変性を理解するための潜在的な意味。
結論
- 記述された方法は、ベストロフィンタンパク質の研究を強化します。
- イオンチャネル機能に関する将来の研究の基礎を提供します。
- 結果は網膜疾患の治療アプローチの改善につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust expression and purification of mammalian bestrophin ion channels addresses a critical bottleneck in ion channel drug discovery by enabling high-quality protein for downstream functional and structural studies. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for retinal disease portfolios, where over 200 BEST1 mutations are implicated in degenerative disorders. The workflow enhances predictive confidence for both early discovery and translational research in ion channel biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bestrophin channel function and structure at the molecular level.
- Supports mechanistic de-risking by providing purified protein for in vitro assays.
- Facilitates functional target validation for inherited retinal disease programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated protein for downstream electrophysiological and structural assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity preparations.
- Enables reliable quantitative readouts for compound evaluation in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Provides molecular tools to study disease-relevant mutations in bestrophin channels.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling structure-function analyses.
- Aligns with translational biomarker development for retinal degeneration research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation for ion channel targets.
- Discovery Biology: Supplies purified bestrophin channels for hypothesis-driven biophysical and functional studies.
- Screening: Delivers assay-ready protein for reproducible and quantitative downstream workflows.
- Analytics: Enables quantitative measurement of protein concentration and purity for comparative analyses.
- Translational Research: Facilitates investigation of disease-linked mutations and their functional consequences.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other ion channels, supporting platform scalability across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ion channel research.
- Operational Value: Standardizes protein production and purification for reproducible results.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in retinal disease portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel targets and disease-linked variants.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein purification techniques.
- Demands access to high-speed centrifugation, FPLC systems, and analytical instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and sample integrity.
- Protocol is adaptable to other ion channels but may require optimization for different targets.
- Maintaining cold chain and contamination control is critical for protein quality.
