低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

この方法は、低酸素条件下での転写因子とその転写共調節因子との間の内因性および天然の相互作用など、低酸素領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、低酸素細胞が低酸素条件下で採取され、核画分が共免疫沈降に使用されることです。このプロトコルは、4つの10センチメートル皿で成長したヒト胚性腎臓293A細胞を使用します。

10%FBS、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベコの改変されたイーグルの培地の10ミリリットルに皿ごとに10〜6番目の細胞を3〜5回播種する。37°Cの5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を培養します。播種から24時間後、細胞が80〜90%の密度に達したら、インキュベーターグローブボックスの低酸素サブチャンバーに2つの皿を入れ、1%の酸素と5%の二酸化炭素を摂氏37度で4時間入れます。

他の2つの皿はノルモキシアに保ちます。低酸素処理細胞を回収する前日に、DPBSで満たされた蓋のない100ミリリットルの実験用ガラス試薬ボトルを低酸素サブチャンバーに24時間置いて、DPBSを低酸素状態に事前平衡化します。細胞を回収する約1時間前に、氷の入ったアイスボックスをグローブボックスの処理チャンバーに入れ、1%の酸素と5%の二酸化炭素に平衡化します。

事前に平衡化された低酸素DPBSが入ったボトルを低酸素サブチャンバーから処理チャンバーに移し、氷の上に置きます。低酸素治療の4時間後、細胞を低酸素サブチャンバーから、1%酸素と5%二酸化炭素に事前に平衡化された処理チャンバーに移します。吸引して培地を取り出し、10ミリリットルのピペットで、10ミリリットルの氷冷した平衡化済み低酸素DPBSで細胞を一度すすぎます。

5ミリリットルのピペットを使用して、5ミリリットルの氷冷した事前平衡化DPBSを追加し、細胞スクレーパーで掻き取って細胞を取り除きます。細胞培養プレートを傾け、10ミリリットルのピペットを使用して分離した細胞を採取し、細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞のチューブを氷の上に保ちます。

グローブボックス内の処理チャンバーとバッファーチャンバーの間のドアを開けます。どちらも酸素1%と二酸化炭素5%に事前に平衡化されています。低酸素処理細胞を含む氷上の15ミリリットルの円錐管を処理チャンバーからバッファーチャンバーに移します。バッファーチャンバーのドアを開けて、セルをグローブボックスから完全に取り出します。

低酸素細胞と正常酸素細胞の両方を、摂氏4度で5分間1000gの遠心分離によりペレット化します。この手順には、核抽出キットが使用されます。まず、各細胞ペレットを500マイクロリットルの溶解緩衝液NLに穏やかに再懸濁し、0.1モルDTT中の1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを数回ピペッティングして補充します。

25マイクロリットルの洗剤溶液NPを細胞懸濁液に加え、最高速度で10秒間ボルテックスします。1000×10gを4°Cで5分間遠心分離します。上澄みと核ペレットの両方を保存してください。

テキストプロトコールに記載されているように上清を収集して保存した後、ペレット含有細胞核を500マイクロリットルの溶解緩衝液NLに再懸濁し、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと0.1モルDTTを最高速度で5秒間ボルテックスすることにより補充します。核ペレットを50マイクロリットルの抽出バッファーNX1に再懸濁し、ペレットを数回ピペッティングして1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。氷上で30分間インキュベートします。

5分ごとに、最大速度で10秒間渦を巻きます。12, 000 x gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を収集し、脱塩のために単位あたり最大容量100マイクロリットルのミニ透析装置に移します。

ミニ透析装置にキャップをして、浮選装置に入れます。浮遊選鉱装置を、500ミリリットルの予冷透析緩衝液が入ったビーカーに入れます。透析緩衝液にはPMSFが含まれているため、皮膚に直接触れたり、透析緩衝液を吸入したりしないように注意してください。

摂氏4度で30分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。30分後、ミニ透析装置のコーナーからサンプルを採取し、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。摂氏4度で12,000倍のgで10分間遠心分離します。

各上清の25マイクロリットルを1.5マイクロリットルの遠心分離管に分注し、摂氏マイナス80度で保存します。免疫価測定に使用するプロテインAGセファロースビーズを調製します。50マイクロリットルのビーズを4本の1.5ミリリットル微量遠心チューブのそれぞれにピペットで挿入し、チューブごとに500マイクロリットルのDPBSバッファーを追加します。

遠心分離によりビーズをペレット化します。上清を捨て、ビーズを100マイクロリットルのTBSバッファーに再懸濁します。500マイクロリットルのTBS緩衝液に0.7ミリグラムのマウスIgGを再構成して調製した2マイクロリットルのマウスモノクローナル抗ARNT抗体またはマウス免疫グロブリンGを添加します。

ビーズの入った微量遠心チューブを冷蔵室に持って行きます。チューブローテーターに入れ、10 rpmで2時間インキュベートします。2時間後、遠心分離によりビーズをペレット化し、上清を捨てます。

200マイクログラムの核タンパク質溶解物を800マイクロリットルの免疫沈降緩衝液で以前に調製します。ライセートを抗体結合ビーズと4°Cで一晩インキュベートします。翌日、ビーズを3000gの遠心分離により、摂氏4度で2分間ペレット

上清を捨てます。0.2%NP-40を含む氷冷TBSを各チューブに1ミリリットル加え、スピンダウンします。このように、0.2%NP-40を含む氷冷TBSでビーズを3回洗浄します。

50マイクロリットルのLaemmlliサンプルバッファーでビーズを95°Cで5分間煮沸します。ビーズを1万g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上澄み集めてビーズを捨てます。

低酸素治療後のHIF-1複合体の成分の細胞内局在における発現レベルをHEK293A細胞で調べました。予想通り、HIF-1aの総値は低酸素症によってアップレギュレーションされましたが、全細胞ライセートのARNTレベルは有意に変化しませんでした。さらに、低酸素症はHIF-1aとARNTの両方の核蓄積を誘発しました。

共免疫沈降実験は、正常酸素または低酸素条件に曝露されたHEK293A細胞からの核抽出物を用いて行った。このように、HIF-1aは低酸素HEK293A細胞の核抽出物からARNTと共に共免疫沈降しており、HIF-1aが低酸素条件下でARNTと相互作用することを示しています。その開発後、この技術は、低酸素症の分野の研究者が内因性核タンパク質相互作用とその低酸素状態を調査する道を開きました。