Name: 低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ低酸素条件下での内因性核タンパク質のCo免疫沈降法。HEK293A細胞を用いて転写因子と共調節因子の相互作用を解析し、低酸素応答における細胞内メカニズムの理解に貢献します。

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我々 は低酸素ワークステーション用准教授罪ティオン ・ オングを感謝します。この作品は、次によって支えられた: シンガポールの教育省、南洋工科大学創業助成金 M4230003 (P.O.B.) に内科のビジネススクール、MOE2015-T2-2-087 (ワイ ・ エイ) に萌え 1T1-02/04 スウェーデン研究評議会、家族 - スウェーデンペーションアー財団、ノボ ノルディスク財団、スティヒティング af Jochnick 財団、スウェーデン糖尿病協会、スカンジア保険会社、糖尿病の研究、健康財団、バース ・ フォン ・ Kantzow、カロリンスカ研究所、アリス バレンベリー財団し ERC ERC 2013 AdG 338936-Betalmage、クヌートの糖尿病戦略研究プログラムです。

人間の萌芽期の腎臓 293A を使用して、このプロトコル セクション (HEK293A) セル s ナンヤン工科大学、シンガポールの人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1 HEK293A 細胞における低酸素誘導
<ol><li>4 つの 10 cm 皿とダルベッコ修飾イーグル培地 (DMEM、4.5 G/L グルコース) 2 mM L-グルタミン, 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した 10 mL の皿あたり 10 の6 HEK293A 電池 × 3-5 種子準備ピルビン酸ナトリウム 110 mg/L、100 U/mL ペニシリン、100 mg/mL のストレプトマイシン。37 ° C、5% CO2インキュベーターで培養します。 注: セル播種実施されなければならない生物学的安全キャビネット (BSC)。BSC に配置されるすべての材料の表面は、70% エタノールで拭いてください。</li>
	<li>播種後 24 h セルが 80-90% の confluency に達したときはインキュベーターにグローブ ボックス内低酸素 subchamber に 2 つの料理を入れて (材料の表を参照) 1% O2と 5% CO2 37 ° C で他の 2 つの常 (21 %o で料理してください2、37 ° C で 5% CO2 ) 4 h 平地と低酸素細胞の 1 つのセットを使用して西部のしみによる低酸素血症の治療を評価し、co 免疫沈降実験のための細胞の他のセットを利用します。 注: 酸素レベルを設定することができます 0-5 細胞の種類に応じて変えることができます % と低酸素血症の治療の期間と目的を研究します。</li>
</ol>2. 全細胞と核の抽出
注: このプロトコルで使用されるバッファーについては表 1を参照してください。
<ol><li>
常細胞を収穫します。
	<ol>
<li>吸引により文化メディアを取り出し、10 ml の DPBS (PH 7.0-7.2) セルを洗浄 10 mL のピペットを使用しています。 注: は、ピペットで細胞膜には触れないでください。洗濯中にセルの損失を避けるために細胞培養プレートの壁を DPBS のピペット優しく。</li>
		<li>5 mL のピペット プレートに冷たい DPBS 細胞スクレーパーで氷冷 PBS でプレートの表面から細胞をこすり。</li>
		<li>15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送して氷の上。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
低酸素の条件の下で培養した細胞を収穫します。
	<ol>
<li>事前事前に 24 h (1% O2と 37 ° C で 5% CO2 ) 低酸素血症 subchamber の DPBS でいっぱい発見100 mL 実験ガラス試薬ボトルを置くことによって感受 DPBS を平衡します。</li>
		<li>扱われる低酸素細胞を収穫する前に約 1 時間は、1% O2と 5% CO2に平衡しているグローブ ボックスの処理室に氷が入っているアイス ボックスを配置します。転送処理室に低酸素 subchamber から事前平衡低酸素 DPBS の入ったボトルと氷の上に置きます。</li>
		<li>低酸素症の処置に続く 4 h は 1% O2と 5% CO2にあらかじめ釣合いされている処理室に低酸素 subchamber からセルを転送します。</li>
		<li>吸引により文化メディアを取り出し、10 mL で冷たい事前平衡低酸素 DPBS のピペット 10 mL で一度リンスの細胞。</li>
		<li>5 mL 5 mL の冷たい事前釣合い DPBS ピペットし、細胞スクレーパーで削ってセルを追加します。</li>
		<li>細胞培養プレートを傾けるし、10 mL のピペットを使用して剥離細胞を収集します。DPBS に細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送して氷の上。</li>
		<li>1 %o2 と 5% CO2にあらかじめ平衡的なされている、グローブ ボックスの処理やバッファー部屋間のドアを開きます。バッファー室処理室から扱われる低酸素細胞を含有した氷の 15 mL の円錐管を転送します。バッファーの部屋のドアを開き、セルをグローブ ボックスから完全に削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 1,000 × gで遠心分離によって両方の 2.1 から培養細胞と 2.2 から低酸素細胞をペレットします。</li>
	<li>
全細胞抽出物を準備します。
	<ol>
<li>50 mM Trisaminomethane 塩酸塩 (トリス-HCl) pH 8.0、150 mM 塩化ナトリウム (NaCl) 1 %tergitol 型 NP 40 (NP-40)、0.5% デオキシ コール酸ナトリウムを含む冷たいラジオ免疫検定法 (RIPA) 換散バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを再懸濁しますと0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、プロテアーゼ阻害剤のカクテル × 1 と補われる (材料の表を参照) を上下に数回細胞ペレットをピペッティングによる。</li>
		<li>セル lysates を新しい 1.5 mL 遠心チューブに移すし、時折ボルテックスと 30 分のための氷の上を保ちます。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 13,000 x gでセル lysates を遠心分離します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに上清の上澄み、分注 50 μ L を収集し、-80 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>
核抽出を用いた核エキスの準備キット (材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>優しく上下に数回細胞ペレットをピペッティングで 500 μ L の換散バッファー NL プロテアーゼ抑制剤のカクテルと 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) x 1 を添加した細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>細胞懸濁液および 10 の渦に洗剤 NP の 25 μ L を追加最大速度で s。</li>
		<li>10,000 x gで 4 ° C で 5 分間遠心します。</li>
		<li>上澄み (細胞質抽出物)、1.5 mL 遠心チューブに上清の 50 μ L 分注を集め、-80 ° C で保存</li>
		<li>500 μ L の換散バッファー 5 ボルテックスによってプロテアーゼ抑制剤のカクテルと 0.1 M DTT x 1 を添加した NL で細胞核を含むペレットを再懸濁します最大速度で s。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間、10,000 × gで遠心分離し、核ペレットを保存します。</li>
		<li>50 μ L を上下に数回ペレットをピペッティングによるプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 を添加した抽出バッファー NX1 の内核のペレットを再懸濁します。</li>
		<li>氷の上の 30 分、10 のボルテックス インキュベート s 最大速度で 5 分ごと。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間、12,000 × gで遠心分離</li>
	</ol>
</li>
	<li>
核抽出液の塩分を除きます。
	<ol>
<li>ステップ 2.5.9 転送から単位あたり 100 μ L の最大音量とミニ透析機器に上澄みを収集します。</li>
		<li>ミニ透析機器をキャップし、浮揚装置に配置します。</li>
		<li>中古冷蔵透析バッファー (20 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、20% のグリセロール、100 mM 塩化カリウム (KCl)、0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.2 mM 特異フッ化物 (PMSF) と 0.5 mM DTT) の 500 mL を含むビーカーに浮き具を入れてください。穏やかな攪拌しながら 4 ° C で 30 分間インキュベートします。 注意: PMSF は危険です。皮膚または吸入との直接接触を避けます。</li>
		<li>ミニ透析機器の隅からサンプルを収集し、新しい 1.5 mL 遠心チューブに移します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブにそれぞれの上清の 25 μ L 分注 4 ° C で 10 分間、12,000 × gで遠心し、-80 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 蛋白質の表現および HIF-1 α の細胞内局在性の検出による低酸素症治療の評価
<ol><li>セル全体またはビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キットの製造元の手順18によるとマイクロ プレート アッセイを用いた核/細胞質抽出物のタンパク質濃度を決定します。</li>
	<li>5 %2-メルカプトエタノールを含む 1 x Laemmli サンプル バッファー内セル lysates を希釈し、95 ° C、5 分で沸騰します。 注意: それは火傷を引き起こす可能性がありますので、暖房のブロックの表面に触れないでください。</li>
	<li>
ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によってタンパク質を分離します。
	<ol>
<li>SDS-PAGE プレキャスト勾配ゲル (4-20%) の各ウェルに 3 μ L の分子量マーカーと共にタンパク質 (25 μ g) の同量を読み込みます。</li>
		<li>2.5 mM トリス、グリシン 19.2 mM、0.01% SDS 200 V で 30 分間 PH8.3 を格納するバッファーのゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ニトロセルロース膜にゲルからタンパク質を転送します。
	<ol>
<li>カセットの陰極側膜・陽極側にゲルを転送サンドイッチ (ろ紙ゲル膜フィルター ペーパー) を組み立てます。</li>
		<li>2.5 mM trisaminomethane (Tris)、19.2 mM グリシンおよび 20% のメタノールを含む転送バッファーと転送満タンにカセットを配置します。 注意: メタノールは可燃性および可燃性液体収納キャビネット内に格納する必要があります。</li>
		<li>低温室内で 100 V で 1 時間のための転送を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL 50 mM Tris Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl、シェーカーに室温で 1 時間 0.1 Tween 20 と 5% 無脂肪牛乳を含むバッファーの妨害でしみをブロックします。</li>
	<li>4 ° C で一晩同じブロック バッファーにアンチ HIF-1 α 抗体 (1/500 希釈) しみを孵化させなさい</li>
	<li>洗うたびに 50 ml の TBS t. 5 分間 3 回しみ</li>
	<li>西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) としみを孵化させなさい-部屋の温度で 1 時間 10 mL TBS T 含む 5% 脱脂乾燥したミルクの共役二次抗体 (1/1,000 希釈)。</li>
	<li>洗うたびに 50 ml の TBS t. 5 分間 3 回しみ</li>
	<li>ミックス 500 μ L 各 1.5 mL 遠心管と渦を簡単に強化された chemilumescent (ECL) 試薬 A と B の。</li>
	<li>しみに ECL 基板を適用し、室温で 1 分間インキュベートします。</li>
	<li>
電荷結合素子 (CCD) カメラを用いたイメージング システムを用いた化学発光信号をキャプチャします。
	<ol>
<li>ティッシュ ペーパーで膜の端に触れることによって余分な ECL 基板をドレインし、シート プロテクターで膜を配置します。</li>
		<li>カメラを用いたイメージング システム、CCD のサンプル トレイに膜を配置します。</li>
		<li>画像処理ソフトを起動 (材料の表を参照)、次の設定を使用して画像をキャプチャ: → 新しいプロトコル → 1 チャンネル → プロトコルの設定 → ゲル画像をファイル (アプリケーション: 化学;イメージング エリア: バイオ ・ ラッドの準備ができてゲル。露出: イメージング ソフトウェアは自動的に強烈なバンドの露出時間最適化) → 実行プロトコル 注: 露光時間は、最適な画像を達成するために手動で設定できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫沈降、免疫沈降されたタンパク質の検出
<ol><li>1.5 mL 遠心チューブにバッファーが TBS の 500 μ L に蛋白質 A/G セファローズ 4 b ビーズの 50 μ L を洗って、4 ° C で 2 分間 3,000 × gで遠心分離によってビーズをペレット</li>
	<li>上澄みを廃棄し、TBS バッファーの 100 μ L のビードを再停止しなさい。</li>
	<li>マウス モノクローナル抗 ARNT 抗体 (1.4 mg/mL) のマウス免疫グロブリン G (IgG) (1.4 mg/mL) 500 μ L TBS バッファーで 0.7 mg マウス IgG を再構成することによって作製した 2 μ L を追加します。</li>
	<li>チューブ回転でビーズを含む 1.5 mL 遠心管を置き、冷蔵室で 10 回転で 2 時間インキュベートします。 注: チューブを優しく処理、管の下部にビーズを含む懸濁液を保ちます。</li>
	<li>4 ° C で 2 分間 3,000 × gで遠心分離によってビーズをペレットし、培養上清を捨てます。</li>
	<li>50 mM トリス-HCl (pH 7.4) 180 mM の NaCl、20% グリセロール、0.2% NP 40 と 1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテルで構成される IP バッファーのステップ 2.6.5 で 800 μ L で得られた核蛋白ライセートの 200 μ g を希釈します。4 ° C で一晩 4.5 の手順で得られた抗体結合ビーズ ライセート インキュベートします。</li>
	<li>4 ° C で 2 分間 3,000 × gで遠心分離によってビーズをペレット、培養上清を破棄および 1 mL にビードを 3 回洗浄しなさい 0.2% を含む冷たい TBS NP 40。</li>
	<li>95 ° C、5 分で 50 μ L 塩化物イオン サンプル バッファーのビードを沸騰させます。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 10,000 x gでビーズを遠心、上清を収集し、ビーズを破棄します。 注: 上清は 4 ° C の短期的または-20 ° C で長期的に保存できます。</li>
	<li>手順 3.3 以降で前述したように西部のしみによって沈澱タンパク質複合体から HIF-1 α の存在を検出します。 注: プロテインの定量はこのステップの必要はありません。各サンプルの上澄みの SDS-PAGE プレキャスト勾配ゲル (4-20%) の各ウェルにフル ・ ボリューム (50 μ L) を読み込む</li>
</ol>

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<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
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著者は利益相反を宣言しません。

HIF 1 複合体細胞酸素恒常性のマスター調節因子は、低酸素に異なる細胞適応応答に関与する遺伝子の茄多を調節する.新規 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達機構を理解するために重要です。一般的に Co 免疫沈降実験 PPIs 研究細胞シグナル伝達経路の線引きされます。しかし、蛋白過剰発現はまだ広く使用されて、これは実験の成果物につながる可能性があります。さらに、HIF-1 α は非常に不安定な蛋白質および再酸素化の11の間に急速に劣化になります。さらに、低酸素血症は、HIF 1 コンポーネントほとんどの哺乳類細胞での核内移行をトリガーします。したがって、従来の co を免疫沈降プロトコルは低酸素症の処置に続く生理関連の HIF 1 相互作用の蛋白質を識別するため最適化しなければなりません。ここでは、低酸素症で HIF-1 α と ARNT の間の対話を示すために使用される変更された co を免疫沈降プロトコルについて述べる。
再酸素化に HIF-1 α の劣化を避けるためには、低酸素細胞は低酸素環境に平衡は事...

低酸素は、細胞や体の組織に十分な酸素が供給されてときに発生します。幹細胞の分化、炎症やがん1,2など様々 な生理学的および病理学的プロセスの重要な役割を果たします。低酸素症誘引可能な要因 (HIFs) は、酸素によって調節される α サブユニットと恒常発現 β サブユニットとして知られている ARNT3から成るヘテロとして機能します。HIF α サブユニット (HIF-1 α、HIF 2α、HIF 3 α) と 3 つの HIF β サブユニット (ARNT/HIF-1 β、ARNT2、ARNT3) の 3 つのアイソ フォームは、日付に確認されています。HIF 2α、HIF 3 α、ARNT2 および ARNT3 はより表現パターン4を制限されているに対し、HIF-1 α と ARNT は表現普遍的。HIF 1 タンパク質複合体は、低酸素応答のキーのレギュレータです。低酸素の条件の下で HIF-1 α 化が安定、核に移行し、ARNT5とされています。その後、この複合体は低酸素応答要素 (HREs) として知られている特定のヌクレオチドに結合し、血管新生、赤血球、解糖系の6を含む多様なプロセスに関与する標的遺伝子の発現を調節します。この「標準」の応答に加えて低酸素シグナル伝達経路も知られているクロストークにシグナル伝達経路のノッチと核因子 κ B (NF-κ B) など複数の細胞応答と7,8,9。
小説 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路の理解にとって重要です。ARNT は、酸素濃度に鈍感と恒常発現と対照をなして HIF-1 α タンパク質レベルは細胞の酸素濃度によって堅く調整されます。常 (21% 酸素)、HIF-1 α タンパク質は急速に劣化した10,11。常に HIF-1 α の短い半減期は、HIF 1 α 相互作用するタンパク質の同定のためだけでなく、細胞抽出液からの蛋白質を検出するための特定の技術的な課題を提示します。さらに、HIF 1 複合体のそれらを含むいくつかの転写因子は、低酸素条件12,13,14下核に若し。PPI の研究のための現在の方法のほとんどは、非生理的な発現タンパク質を使用して実行されます。このような蛋白の過剰発現は、リソースの過負荷、化学量論的不均衡、無差別相互作用および経路変調15,16を含む複数のメカニズムを通して異なる携帯電話の不具合が発生する報告されています。PPI の研究面で蛋白過剰発現は偽肯定的、またはも偽陰性、タンパク質の特性と発現タンパク質の機能によって結果につながることができます。したがって、PPI の研究の現在の方法は、低酸素条件下での生理関連 PPIs を明らかにするために変更する必要。我々 は以前、HIF 1 と Ets ファミリー転写因子Hes1プロモーターの低酸素17レスポンスに貢献する低酸素の P19 細胞における GA 結合タンパク質 (GABP) との間の相互作用を実証しました。ここでは、低酸素条件下で内因性の核蛋白質間 PPIs を勉強する co 免疫沈降プロトコルについて述べる。HIF-1 α と ARNT の相互作用は、コンセプトの証明として表示されます。このプロトコルは転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子間の相互作用を示す適して、HIF 1 相互作用するタンパク質の同定に限定されません。

<table><tbody><tr><td><強>材質</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris-HCl緩衝液、pH 7.4&nbsp;</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Sepharose beads</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Natural Mouse IgG protein</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelluloseメンブレン &nbsp;&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロッカー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1706404</td><td>ウェスタンブロッティングアプリケーション用無脂粉ミルク</td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG、HRP 結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgG、HRP 結合抗体&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>SignalFire ECL 試薬</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水</td><td>コーニング</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>メルクミリポア</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 β抗体&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>濃度:1.4 mg / mL</td></tr><tr><td>HIF-1 アルファ抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>濃度:1.0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>濃度:0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome 核タンパク質キット</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>溶解緩衝液 NL および抽出緩衝液 NX1 はキットで提供されます</td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>濃度:0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>グリセロール(&ge;99%)</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>シ<td>グマ</td><td>P9541</td><td></td></tr>リ<tr><td>パバッファー</td><td>シグマ</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>シグマ</td><td>71376NP-40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>シグマ</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」培地(DMEM、4.5 g / Lグルコース)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0861</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A細胞株</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ピアスプロテアーゼ阻害剤錠剤&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>ピアス BCA プロテインアッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP ゲルローディングのヒント&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>機器/装置</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>厚ブロットフィルターペーパー、プレカット、7.5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp;ミニプレキャストゲル用テトラ垂直電気泳動セル、ミニトランスブロット付き&nbsp;モジュールとPowerPacベーシック電源</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;15% Mini-PROTEAN TGX プレキャストプロテインゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>I-Glove</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL Stripette Serological Pipets</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10mL Stripette Serological Pipets</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25mL Stripette Serological Pipets</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL HighクラリティPP円錐形遠心分離管コー</td><td>ニング352095</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スモールセルスクレーパー</td><td>コーニング</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>ギルソン&nbsp;Pipetman L 4ピペットキット&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2、P20、P200、P1000および付属品</td></tr><tr><td>1.5mLポリプロピレン微量遠心チューブ</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 ピペッター</td><td>インテグラ バイオサイエンス</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Justrite 可燃性液体収納キャビネット</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>スチュアート</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター SB3</td><td>スチュアート</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R マイクロ遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>ソーバル ST 16 遠心分離</td><td>機 サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ (100 mm)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>69580</td><td>10K MWCO、0.1</td></tr><tr><td>mL フロートブイ、0.1 mL Slide-A-Lyzer 用 MINI 透析装置</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE デジタルドライバスヒーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;1300 シリーズ A2 クラス II、タイプ A2 バイオセーフティキャビネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab ソフトウェア</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた co 免疫沈降試験

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

低酸素レベル (低酸素) は、さまざまな低酸素誘導因子 1 (HIF 1) マスターの調整装置として複雑な適応応答をトリガーします。HIF 1 ヘテロ二量体酸素によって調節される α サブユニット (HIF-1 α) から成り、血管新生を含む多様なプロセスに関与する遺伝子を調節する β サブユニット (HIF 1 β) として知られている芳香族炭化水素受容体核移行因子 (ARNT) されて、赤芽球および解糖系。HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路を理解する鍵です。HIF-1 α の安定性の規則、ほか低酸素症はまた HIF-1 α ARNT など多くの転写因子の核内移行をトリガーします。特に、このようなタンパク質-タンパク質相互作用 (Ppi) を研究するために使用する現在の方法のほとんどは、タンパク質レベルは人為的に蛋白過剰発現を増加させるシステムに基づいています。多くの蛋白の過剰発現は、時空の成果物から生じる非生理的結果に します。ここで変更された co-免疫沈降を記述プロトコルの内因性の核蛋白質を使用して低酸素血症の治療の後、HIF-1 α と ARNT の相互作用を表示する概念の証拠として。このプロトコルでは低酸素細胞が低酸素の条件の下で収穫された、ダルベッコの (DPBS) Phosphate-Buffered 生理食塩水洗浄バッファーも感受タンパク質分解やタンパク質複合体を軽減するために使用する前にあらかじめ釣合い再酸素化中に解離します。さらに、核の一部分を集中、内因性の核蛋白質の安定化と蛋白過剰発現時にしばしば見られる誤った結果を避けるために抽出した後。このプロトコルは、転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子と内因性とネイティブ相互作用を実証する使用できます。

式低酸素細胞の応答を評価するためにレベルと HIF 1 複雑な次低酸素治療のコンポーネントの内局在を検討しました。4 h の低酸素の条件の下で培養の HEK293A セルまたはコントロールとして常に続けた。全細胞 HIF-1 α と ARNT のタンパク質レベルを調べたまたは西部のしみによって核/細胞質を抽出します。予想される、合計 HIF-1 α のレベル合計のセル lysates の ARNT レベルが大幅に対し、低酸素状態で誘導されるとして変更 (図 1 a)。さらに、低酸素状態における核蓄積は HIF-1 α と HEK293A 細胞 (図 1 b)、ARNT ARNT の細胞質発現テスト セル行19のいくつかの検出されなかったが過去の報告と一致しているのです。
次に、HIF-1...

ここで低酸素の条件の下で内因性の核蛋白質間蛋白質蛋白質の相互作用を研究する co 免疫沈降プロトコルについて述べる。このメソッドは、転写因子と低酸素で転写共役因子との相互作用のデモンストレーションに適しています。

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

この方法は、低酸素条件下での転写因子とその転写共調節因子との間の内因性および天然の相互作用など、低酸素領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、低酸素細胞が低酸素条件下で採取され、核画分が共免疫沈降に使用されることです。このプロトコルは、4つの10センチメートル皿で成長したヒト胚性腎臓293A細胞を使用します。10%FBS、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベコの改変されたイーグルの培地の10ミリリットルに皿ごとに10〜6番目の細胞を3〜5回播種する。37°Cの5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を培養します。播種から24時間後、細胞が80〜90%の密度に達したら、インキュベーターグローブボックスの低酸素サブチャンバーに2つの皿を入れ、1%の酸素と5%の二酸化炭素を摂氏37度で4時間入れます。他の2つの皿はノルモキシアに保ちます。低酸素処理細胞を回収する前日に、DPBSで満たされた蓋のない100ミリリットルの実験用ガラス試薬ボトルを低酸素サブチャンバーに24時間置いて、DPBSを低酸素状態に事前平衡化します。細胞を回収する約1時間前に、氷の入ったアイスボックスをグローブボックスの処理チャンバーに入れ、1%の酸素と5%の二酸化炭素に平衡化します。事前に平衡化された低酸素DPBSが入ったボトルを低酸素サブチャンバーから処理チャンバーに移し、氷の上に置きます。低酸素治療の4時間後、細胞を低酸素サブチャンバーから、1%酸素と5%二酸化炭素に事前に平衡化された処理チャンバーに移します。吸引して培地を取り出し、10ミリリットルのピペットで、10ミリリットルの氷冷した平衡化済み低酸素DPBSで細胞を一度すすぎます。5ミリリットルのピペットを使用して、5ミリリットルの氷冷した事前平衡化DPBSを追加し、細胞スクレーパーで掻き取って細胞を取り除きます。細胞培養プレートを傾け、10ミリリットルのピペットを使用して分離した細胞を採取し、細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞のチューブを氷の上に保ちます。グローブボックス内の処理チャンバーとバッファーチャンバーの間のドアを開けます。どちらも酸素1%と二酸化炭素5%に事前に平衡化されています。低酸素処理細胞を含む氷上の15ミリリットルの円錐管を処理チャンバーからバッファーチャンバーに移します。バッファーチャンバーのドアを開けて、セルをグローブボックスから完全に取り出します。低酸素細胞と正常酸素細胞の両方を、摂氏4度で5分間1000gの遠心分離によりペレット化します。この手順には、核抽出キットが使用されます。まず、各細胞ペレットを500マイクロリットルの溶解緩衝液NLに穏やかに再懸濁し、0.1モルDTT中の1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを数回ピペッティングして補充します。25マイクロリットルの洗剤溶液NPを細胞懸濁液に加え、最高速度で10秒間ボルテックスします。1000×10gを4°Cで5分間遠心分離します。上澄みと核ペレットの両方を保存してください。テキストプロトコールに記載されているように上清を収集して保存した後、ペレット含有細胞核を500マイクロリットルの溶解緩衝液NLに再懸濁し、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと0.1モルDTTを最高速度で5秒間ボルテックスすることにより補充します。核ペレットを50マイクロリットルの抽出バッファーNX1に再懸濁し、ペレットを数回ピペッティングして1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。氷上で30分間インキュベートします。5分ごとに、最大速度で10秒間渦を巻きます。12, 000 x gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を収集し、脱塩のために単位あたり最大容量100マイクロリットルのミニ透析装置に移します。ミニ透析装置にキャップをして、浮選装置に入れます。浮遊選鉱装置を、500ミリリットルの予冷透析緩衝液が入ったビーカーに入れます。透析緩衝液にはPMSFが含まれているため、皮膚に直接触れたり、透析緩衝液を吸入したりしないように注意してください。摂氏4度で30分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。30分後、ミニ透析装置のコーナーからサンプルを採取し、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。摂氏4度で12,000倍のgで10分間遠心分離します。各上清の25マイクロリットルを1.5マイクロリットルの遠心分離管に分注し、摂氏マイナス80度で保存します。免疫価測定に使用するプロテインAGセファロースビーズを調製します。50マイクロリットルのビーズを4本の1.5ミリリットル微量遠心チューブのそれぞれにピペットで挿入し、チューブごとに500マイクロリットルのDPBSバッファーを追加します。遠心分離によりビーズをペレット化します。上清を捨て、ビーズを100マイクロリットルのTBSバッファーに再懸濁します。500マイクロリットルのTBS緩衝液に0.7ミリグラムのマウスIgGを再構成して調製した2マイクロリットルのマウスモノクローナル抗ARNT抗体またはマウス免疫グロブリンGを添加します。ビーズの入った微量遠心チューブを冷蔵室に持って行きます。チューブローテーターに入れ、10 rpmで2時間インキュベートします。2時間後、遠心分離によりビーズをペレット化し、上清を捨てます。200マイクログラムの核タンパク質溶解物を800マイクロリットルの免疫沈降緩衝液で以前に調製します。ライセートを抗体結合ビーズと4°Cで一晩インキュベートします。翌日、ビーズを3000gの遠心分離により、摂氏4度で2分間ペレット化します。上清を捨てます。0.2%NP-40を含む氷冷TBSを各チューブに1ミリリットル加え、スピンダウンします。このように、0.2%NP-40を含む氷冷TBSでビーズを3回洗浄します。50マイクロリットルのLaemmlliサンプルバッファーでビーズを95°Cで5分間煮沸します。ビーズを1万g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上澄み集めてビーズを捨てます。低酸素治療後のHIF-1複合体の成分の細胞内局在における発現レベルをHEK293A細胞で調べました。予想通り、HIF-1aの総値は低酸素症によってアップレギュレーションされましたが、全細胞ライセートのARNTレベルは有意に変化しませんでした。さらに、低酸素症はHIF-1aとARNTの両方の核蓄積を誘発しました。共免疫沈降実験は、正常酸素または低酸素条件に曝露されたHEK293A細胞からの核抽出物を用いて行った。このように、HIF-1aは低酸素HEK293A細胞の核抽出物からARNTと共に共免疫沈降しており、HIF-1aが低酸素条件下でARNTと相互作用することを示しています。その開発後、この技術は、低酸素症の分野の研究者が内因性核タンパク質相互作用とその低酸素状態を調査する道を開きました。

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

この原稿は、特定のオリゴヌクレオチド指向濃縮を介して真核細胞で形成された選択された同族RNPを単離するアプローチを説明しています。DHX9/RNAヘリカーゼAで構成されるレトロウイルス5'非翻訳領域に結合した同族RNPを単離することにより、このアプローチの適用性を実証します。...

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1...

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

ここでは、代謝性の高い近位管上皮細胞における低酸素/再酸素化損傷をモデル化する in vitro...

近位管上皮細胞における低酸素症/再酸素化損傷のモデル化

学ぶ低酸素条件下での内因性核タンパク質のCo免疫沈降法。HEK293A細胞を用いて転写因子と共調節因子の相互作用を解析し、低酸素応答における細胞内メカニズムの理解に貢献します。

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

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