細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

この方法は、細胞シグナル伝達経路の解明など、細胞生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。したがって、この手法の主な利点は、実際には洗練された顕微鏡的なアプローチを必要としないことです。また、非常に高速であるため、細胞内のタンパク質分布をリアルタイムで観察するために使用できます。

末梢関連タンパク質の膜分配の評価と定量化は、顕微鏡下で原形質膜と細胞質蛍光の混合を引き起こす光回折のために複雑です。この手順は、テキストプロトコルに記載されている生物学的材料の準備から開始します。調製した材料をFM 4-64色素で染色し、研究した材料に適した染色プロトコルを適用します。

タバコBY-2細胞の場合、200マイクロリットルの細胞懸濁液を0.2マイクロリットルの10ミリモルFM4-64溶液で染色しますジメチルスルホキシド。1つの細胞につき1つの赤道共焦点切片を捕捉するには、タンパク質タグとして使用される発色団とFM 4-64のシーケンシャル2チャンネルスキャンを設定します。また、光学解像度を高く設定します。

セットアップの例としては、開口数が1.3、画像サイズが1,024×1,024ピクセルの63倍の油浸対物レンズがあります。Fiji ImageJ Distribution と必要なマクロ周辺機器をインストールします。フィジーでは、プラグイン、マクロ、メインメニューでインストールの順に選択し、ImageJマクロ周辺機器を使用してダウンロードしたファイルへのパスを指定します。

R Project ソフトウェアと必要なパッケージをインストールします。R グラフィカル ユーザー インターフェイスを実行し、パッケージを選択してから、メイン メニューでパッケージをインストールし、インストールする最も近いリポジトリとパッケージ ggplot2 を指定します。R Package 周辺機器をダウンロードします。

パッケージを選択してインストールし、ローカルファイルからパッケージをインストールします。細胞質マーカーの共焦点画像を処理します。これを行うには、プラグインを使用して画像をフィジーにインポートし、次にbioformatsを使用して、デフォルト設定のフィジーメニューからbioformatsインポーターをインポートします。

解析設定のインポート オプション マクロを実行します。マクロをアクティブにするには、メニューツールの周辺タンパク質メニューをクリックした後、同じ項目を選択します。フィールドのガウスぼかし半径ピクセルに適切な値を定義します。

これは、画像のスムージングとノイズリダクションに影響します。値を小さくするだけで十分であり、画像情報の損失は発生しません。次に、フィールド プロファイルの線幅ピクセルに値を設定します。

線が太いほど、プロファイル曲線のスムージングが高くなります。デフォルト値の 10 ピクセルを推奨します。画像のタイトルを設定し、サンプル区切り記号とエクスポートされたアイテムの定義に従って解析します。

[OK] をクリックします。次のダイアログウィンドウでタイトルの解析を確認し、[OK]をクリックするか、リセットに戻ります。次に、処理された画像の原形質膜領域を横切って線形選択を行い、蛍光プロファイルを測定します。これを行うには、FijiツールバーからFijiツールの直線を選択します。

画像をクリックし、原形質膜領域を横切る線をドラッグします。線は細胞外空間から始まり、原形質膜に対して垂直でなければなりません。皮質細胞質のより厚く、より均質な層を有する領域を選択する。

線形選択の最適な長さは 5 から 10 ミクロンです。フィジーのツールバーにあるプロファイル取得ツールをクリックして、プロファイル取得マクロを実行します。両方のチャンネルの蛍光プロファイルの自動測定が行われ、データが結果ウィンドウに表示されます。

個々のシグナルのばらつきに応じて、各セルのプロファイルの代表番号を取ります。プロット プロファイル データ マクロを実行して、測定されたプロファイルをグラフィカルに視覚化します。呼び出されたマクロ・ダイアログ・ウィンドウでパラメーターを設定します。

[入力データのフィルタリングを使用する] チェックボックスはオフのままにします。プロットを結果ウィンドウ内の最近のデータから単一のCSVファイルから作成するか、指定したディレクトリ内のすべてのCSVファイルから作成するかを指定するには、適切なラジオボタンをクリックします。プロットに使用するグループ化係数を指定するには、適切なチェック ボックスをオンにします。

すべてのプロファイルを一意のプロットで表示する場合は、係数Iを選択します。すべてのデータを 1 つのプロットにプロットする場合は、チェック ボックスをオフのままにします。[OK] をクリックします。結果を保存するため、または次のダイアログウィンドウで最終的なデータをインポートするためのパスとファイル名を指定します。

ダイアログウィンドウで[OK]をクリックして分析を確認し、実行されたRコードを表示します。プロットされたプロファイルの一部に細胞外または細胞内空間に過剰なシグナルがある場合は、プロファイル フィルタリング設定マクロを実行します。その後、呼び出されたマクロ・ダイアログ・ウィンドウでパラメーターを設定します。

各チャネルについて、ファイル内で適切な強度しきい値を設定し、過剰な細胞外または細胞内シグナルの測定値を削除します。強度のしきい値が適用される領域を、X座標より小さいまたは大きいフィールドで指定し、[OK]をクリックします。[データ入力にフィルタリングを使用する]チェックボックスをオンにして、プロット プロファイル データ マクロを再度実行します。次に、以前に保存したファイルからデータを追加します。

すべての異常なプロファイルが正常に削除されたことを確認し、そうでない場合は、フィルタリングパラメータを改善します。モデル作成マクロを実行して、キャリブレーションデータに基づいて原形質膜と細胞質蛍光分布のモデルを作成します。呼び出されたマクロ・ダイアログ・ウィンドウで、テキスト・プロトコルに詳述されているようにパラメーターを設定した後、「OK」をクリックします。次のダイアログウィンドウで入力ファイルのパスと名前を指定し、実行されたRコードが表示されたダイアログウィンドウでOKをクリックして解析を確認します。

次に、目的のタンパク質を発現する細胞の画像を処理します。画像をインポートし、前と同じように分析を設定します。スムージングと線幅は同じである必要があります。

プロファイルの測定に進みます。プロットしてプロファイルの精度を確認し、必要に応じて前述のようにフィルタリングを設定します。分布計算マクロを実行して、原形質膜と細胞質内のタンパク質分配を計算します。

入力データとモデルソースを指定し、最終的にデータフィルタリングを設定します。「残差変動が大きい結果を削除する」のチェックボックスをオンのままにします。「結果フィルタリングが必要な場合」個々のプロファイル測定の信号分解では説明できない最大許容残留変動のしきい値を指定します。

箱ひげ図の作成に使用できるサンプルのグループ化因子を選択します。[OK] をクリックし、入力パスまたは出力パスを指定し、実行された R コードが表示されたダイアログ ウィンドウで [OK] をクリックして解析を確認します。ここに示されているのは、N-ミリストイル化およびホスホイノシチドへの静電相互作用を介して原形質膜と結合する植物タンパク質を発現するFM 4-64染色細胞の画像です。

これらの相互作用は、ワートマニンによって実験的に乱されました。N-ミリストイル化の重要性は、N-ミリストイル化部位として機能する第2のアミノ酸位のグリシンの突然変異によって検証されました。両方の原形質膜結合能力の除去の効果は、タンパク質のN末端ドメインの切断によってテストされました。

結果として得られる箱ひげ図は、N-ミリストイル化部位の突然変異後および薬物治療後の原形質膜親和性の減少を示しています。それらの相互効果は、N末端ドメインを除去する効果に匹敵します。このビデオを見れば、分析の主要なステップを適切な順序で実行する方法と、それらのパラメータを設定する方法について十分に理解できるはずです。

この分析に続いて、得られたデータを統計的に評価するために、ANOVAのような統計的手法を実行することができます。この方法は植物浮遊細胞用に開発されましたが、滑らかで明確に区別できる原形質膜を持つ他の細胞や組織にも適用できます。