Name: 細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶ細胞膜関連タンパク質の定量解析法。FM 4-64染色と計算的手法を用いて、回折問題を解決しリアルタイムでタンパク質分布を可視化する。高度な顕微鏡を必要とせず、細胞シグナル伝達経路の研究に有用である。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明する方法は、膜が末梢関連タンパク質に蛍光強度5の測定に基づく他のアプローチに比べて分割のより正確な推定を生成します。このメソッドの主要な改善は、光の回折と原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせ、考慮します。ただし、これらのメソッドの結果は、平均細胞質膜位置に蛍光強度の比較に基づく簡単な法の結果との相関 (6図以前) のような信号、この手法の主な利点特に、膜信号が細胞質の信号よりも低い結果の関連性の推定を可能にする (信号分解による原因不明) の残留可変性の決定であります。タンパク質の分配の計算は 1 ポイントだけに基づいていないために、この方法は信号ノイズをより堅牢なも。
分析には、共焦点画像のみ 1 つ 2 つのチャネルが必要です。高速画像取得が重要な要件 ( FRAP アプローチ18長いタイム ・ ウィンドウのタンパク質拡散現象の測定に基づくと対照をなして説明メソッドはよりダイナミックな生体内でのアプロー...

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Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

末梢に関連付けられている膜蛋白質は、細胞シグナル伝達経路の主要なコンポーネントです。過渡膜協会そして解離細胞膜と細胞質の間のシグナル伝達のために重要である彼らの基本的な役割の一つであります。脂質アンカー (N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化) または脂質結合ドメイン ( 、ホスファチジン酸ホスファチジルイノシトール隣酸塩との相互作用によって、細胞膜の末梢関連プラズマ膜タンパク質を取り付けることがなど)。
これらの蛋白質の特性は、プラズマ膜結合検査生体内で、例えば、蛍光タグ付きタンパク質が主要アミノ酸のサイト指示された突然変異誘発によって変更されたとき、または影響を与える様々 な阻害剤と扱われる脂質シグナリング。周辺膜蛋白質の分布主評価されている質的に、特に場合は、蛋白質の再分布が明らかなとき。提案手法は、蛋白質の再配布、部分的にしかと定量的評価が必要な状況に最適です。膜協会は共焦点から推定したときの頻繁に使用されるアプローチ レーザー走査型顕微鏡画像のない細胞膜と細胞質の1、2、蛍光強度の比が簡単なと正確になります。細胞膜での蛍光強度は、特定の蛍光顕微鏡法および光学素子の使用3の光回折特性による原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせを反映しています。その結果、細胞内の信号は、膜領域にも含まれています。このため、膜信号選択4マスクとして FM 4-64 の染色パターンを使用できません。さらに、FM 4-64 常に体系的に最大の汚損によって定義された位置で膜信号の測定は実際膜信号の重ね合わせによる末梢関連プラズマ膜タンパク質を過大評価、膜と細胞質の化合物。末梢関連タンパク質の蛍光タグの観測信号の最大値も共同膜マーカー (すなわちFM 4-64 の styryl の染料)、最大でローカライズされていないが、細胞質にシフトします。別の制限は、FM 4-64 放出ピークは光回折3の波長依存性により GFP など緑の蛍光蛋白質のための放出のピークと比較してより広いという事実に基づく。
ここで説明したメソッド、タグ付きタンパク質の信号はそれぞれの細胞膜と細胞質シグナル仮説的分布を記述する 2 つの経験的な関数によって装着です。この信号の分解は蛍光付けられた蛋白質を表現する共焦点セクションを定期的に、2 チャンネルのソース画像で膜に垂直に細胞表面に適用される線形蛍光プロファイルに適用します。FM 4-64 染料ラベルの付いたセルです。
継ぎ手に使用される最初の関数では、セルの端に細胞質シグナルの回折について説明します。それは興味の細胞膜の末梢に関連付けられている蛋白質として同じ発色団によって付く細胞質のタンパク質マーカーを発現する細胞で測定した蛍光以前に取得したプロファイルから取得されます。プラズマ膜信号の回折を説明する 2 番目の関数は、FM 4-64 の蛍光から派生されます。この信号は、点光源の光の回折の近似モデリングに使用されているガウス関数で近似はまず。第二に、発光 FM 4-64 の有効なこのモデルは数学的に膜で興味の末梢に関連付けられている蛋白質のタグ付けに使用される色素の発光波長に関連するフォームに変換されます。両方の機能は、それぞれ最大の強度、FM 4-64 と細胞質蛋白質信号の最高値の 10% から平均が正規化されます。この信号の分解 (非線型最小正方形管継手法)、膜の比と検査された蛋白質の細胞質画分を推定できる簡単かつ正確に。膜表面濃度と細胞質の体積濃度を比較するため、分割係数の計算の実際の物理的な寸法はマイクロメータの範囲内。それは細胞膜から膜の周辺のように、同じ量のタンパク質がローカライズされて細胞質までの距離を定義します。この値は、パーティション分割を相当係数K2導入以前5。メソッドは非常に簡単で、ルーチンの共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して集録した唯一の共焦点セクションを必要として計算上要求されていません。解析コアは、ポータブルの R パッケージに実装されているし、追加の ImageJ マクロは直感的なダイアログから分析を実行するグラフィカル ユーザー インターフェイスを提供するために書かれました。ソフトウェアおよび方法の詳細な説明 (以前公開された6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/ で見つけることができます。
メソッドは単離細胞、プロトプ ラスト、組織に適した個々 の細胞の細胞膜には明確に区別できる、蛍光タグの構造を表現する末梢関連タンパク質を調べた。発色団 FM 4-64 の染色を使用する必要がありますと互換性があります。FM 4-64 発光赤;したがって、検査されたタンパク質は、青、緑、または黄色の放射 (例えばGFP、CFP、YFP) と蛍光タンパク質によるタグできます。蛋白質の分布の少ない人工より再現可能な観察を可能にするためは、生物材料の安定した変換をお勧めします。検査されたタンパク質が比較的均質な細胞質の分布を持っていることが必要です。小胞体または別の細胞内膜コンパートメントの蛋白質のローカリゼーションは、人工の結果を生成できます。
また、比較のため細胞質マーカーを表現する同じ生物学的材料を使用する必要があります。細胞は、廃止膜結合容量と無料 chomophore (周辺蛋白質、例えば、無料の GFP のタグ付けに使用されると同じ) することによって興味の蛋白質をタグに変換できます。膜結合容量廃止されることが、たとえば、膜結合ドメインのトリミングによってまたは重要なアミノ酸ボッスクカ (例えば N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化等のためのサイト) のサイト指示された突然変異誘発によって。
共焦点顕微鏡の細胞は色素 FM 4-64 のような膜マーカーによって表示しなければなりません。場合 FM 4-64 の染色 (蛍光が干渉している、貧しい染料の浸透などにより) 研究材料に適しては、原形質膜ラベル付けできますが、たとえば、適切な chomophore (タグ付き積分膜タンパク質によるmCherry、RFP、等)。マーカーでは、細胞内膜コンパートメント (膜) のごくわずかのローカリゼーションが不可欠です。
固定サンプルや抗体を操作する場合は、修正可能なアナログ FM 4-64FX または適切なターゲットに対する抗体によって分類する膜が使用できます。この場合、固定法は細胞質から細胞膜タンパク質の選択的損失につながることができますので、非常に慎重に結果を評価するために不可欠です。

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T13320</td><td>原形質膜染料</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 シグマ</td><td>染料 溶剤</td></tr><tr><td>通常の機器(顕微鏡スライド、ピペット、チップ、チューブ)</td><td></td><td></td><td>細胞標識および顕微鏡用機器</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通常のコンピュータ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

このメソッドは、あらゆる蛍光タグ末梢に関連付けられている蛋白質の膜間での蛍光強度のプロファイルを使用してパーティション分割膜による高速アプローチを提供します。測定された蛍光プロファイルは、細胞周囲に対して垂直線に沿って膜と細胞質の蛍光分布モデルによる取り付けられています。このモデルは、FM 4-64-ラベルの付いた原形質膜と細胞質の蛍光タグのマーカーを発現する参照細胞の蛍光強度の値から構成されます。さまざまなセルタイプおよび生物に応用することができます。ただし、非近隣の細胞の細胞膜だけを評価できます。この顕微鏡を用いた高速メソッドは実験、細胞膜関連マーカーの微妙な動的変更が予想されるとを定量化する必要があります、例えば、阻害剤治療、蛋白質の突然変異体バージョンの分析に適して信号伝達の観察。メソッドは、ユーザーフレンドリーなインターフェイスとして機能する ImageJ マクロと結合されたマルチプラット フォーム R パッケージに実装されます。

N-ミリストイルおよびホスファチジルイノシトール リン酸11,と静電相互作用を介して細胞膜に関連付けられている植物固有の末梢に関連付けられている膜タンパク質である DREPP10 12です。 DREPP 植物細胞内カルシウム シグナル伝達機械のコンポーネントとして記述され、骨格13,14ともやり取りします。提示実験で野生型タバコ DREPP2 における非突然変異体バージョン (Gly2 アラで代用) GFP 付けられた6とタバコによる 2 懸濁液細胞15 CaMV 35S プロモーター16の下で表されます。3 日齢 (希釈後 3 日) で測定したこれら...

ここでは、末梢関連タンパク質の蛍光タグ付きのプラズマ膜協会のレベルの定量的分析を実行するためのプロトコルを提案する.メソッドは、膜の計算の分解、細胞膜蛍光マーカーの付いた信号の細胞質成分に基づいています。

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

この方法は、細胞シグナル伝達経路の解明など、細胞生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。したがって、この手法の主な利点は、実際には洗練された顕微鏡的なアプローチを必要としないことです。また、非常に高速であるため、細胞内のタンパク質分布をリアルタイムで観察するために使用できます。末梢関連タンパク質の膜分配の評価と定量化は、顕微鏡下で原形質膜と細胞質蛍光の混合を引き起こす光回折のために複雑です。この手順は、テキストプロトコルに記載されている生物学的材料の準備から開始します。調製した材料をFM 4-64色素で染色し、研究した材料に適した染色プロトコルを適用します。タバコBY-2細胞の場合、200マイクロリットルの細胞懸濁液を0.2マイクロリットルの10ミリモルFM4-64溶液で染色しますジメチルスルホキシド。1つの細胞につき1つの赤道共焦点切片を捕捉するには、タンパク質タグとして使用される発色団とFM 4-64のシーケンシャル2チャンネルスキャンを設定します。また、光学解像度を高く設定します。セットアップの例としては、開口数が1.3、画像サイズが1,024×1,024ピクセルの63倍の油浸対物レンズがあります。Fiji ImageJ Distribution と必要なマクロ周辺機器をインストールします。フィジーでは、プラグイン、マクロ、メインメニューでインストールの順に選択し、ImageJマクロ周辺機器を使用してダウンロードしたファイルへのパスを指定します。R Project ソフトウェアと必要なパッケージをインストールします。R グラフィカル ユーザー インターフェイスを実行し、パッケージを選択してから、メイン メニューでパッケージをインストールし、インストールする最も近いリポジトリとパッケージ ggplot2 を指定します。R Package 周辺機器をダウンロードします。パッケージを選択してインストールし、ローカルファイルからパッケージをインストールします。細胞質マーカーの共焦点画像を処理します。これを行うには、プラグインを使用して画像をフィジーにインポートし、次にbioformatsを使用して、デフォルト設定のフィジーメニューからbioformatsインポーターをインポートします。解析設定のインポート オプション マクロを実行します。マクロをアクティブにするには、メニューツールの周辺タンパク質メニューをクリックした後、同じ項目を選択します。フィールドのガウスぼかし半径ピクセルに適切な値を定義します。これは、画像のスムージングとノイズリダクションに影響します。値を小さくするだけで十分であり、画像情報の損失は発生しません。次に、フィールド プロファイルの線幅ピクセルに値を設定します。線が太いほど、プロファイル曲線のスムージングが高くなります。デフォルト値の 10 ピクセルを推奨します。画像のタイトルを設定し、サンプル区切り記号とエクスポートされたアイテムの定義に従って解析します。[OK] をクリックします。次のダイアログウィンドウでタイトルの解析を確認し、[OK]をクリックするか、リセットに戻ります。次に、処理された画像の原形質膜領域を横切って線形選択を行い、蛍光プロファイルを測定します。これを行うには、FijiツールバーからFijiツールの直線を選択します。画像をクリックし、原形質膜領域を横切る線をドラッグします。線は細胞外空間から始まり、原形質膜に対して垂直でなければなりません。皮質細胞質のより厚く、より均質な層を有する領域を選択する。線形選択の最適な長さは 5 から 10 ミクロンです。フィジーのツールバーにあるプロファイル取得ツールをクリックして、プロファイル取得マクロを実行します。両方のチャンネルの蛍光プロファイルの自動測定が行われ、データが結果ウィンドウに表示されます。個々のシグナルのばらつきに応じて、各セルのプロファイルの代表番号を取ります。プロット プロファイル データ マクロを実行して、測定されたプロファイルをグラフィカルに視覚化します。呼び出されたマクロ・ダイアログ・ウィンドウでパラメーターを設定します。[入力データのフィルタリングを使用する] チェックボックスはオフのままにします。プロットを結果ウィンドウ内の最近のデータから単一のCSVファイルから作成するか、指定したディレクトリ内のすべてのCSVファイルから作成するかを指定するには、適切なラジオボタンをクリックします。プロットに使用するグループ化係数を指定するには、適切なチェック ボックスをオンにします。すべてのプロファイルを一意のプロットで表示する場合は、係数Iを選択します。すべてのデータを 1 つのプロットにプロットする場合は、チェック ボックスをオフのままにします。[OK] をクリックします。結果を保存するため、または次のダイアログウィンドウで最終的なデータをインポートするためのパスとファイル名を指定します。ダイアログウィンドウで[OK]をクリックして分析を確認し、実行されたRコードを表示します。プロットされたプロファイルの一部に細胞外または細胞内空間に過剰なシグナルがある場合は、プロファイル フィルタリング設定マクロを実行します。その後、呼び出されたマクロ・ダイアログ・ウィンドウでパラメーターを設定します。各チャネルについて、ファイル内で適切な強度しきい値を設定し、過剰な細胞外または細胞内シグナルの測定値を削除します。強度のしきい値が適用される領域を、X座標より小さいまたは大きいフィールドで指定し、[OK]をクリックします。[データ入力にフィルタリングを使用する]チェックボックスをオンにして、プロット プロファイル データ マクロを再度実行します。次に、以前に保存したファイルからデータを追加します。すべての異常なプロファイルが正常に削除されたことを確認し、そうでない場合は、フィルタリングパラメータを改善します。モデル作成マクロを実行して、キャリブレーションデータに基づいて原形質膜と細胞質蛍光分布のモデルを作成します。呼び出されたマクロ・ダイアログ・ウィンドウで、テキスト・プロトコルに詳述されているようにパラメーターを設定した後、「OK」をクリックします。次のダイアログウィンドウで入力ファイルのパスと名前を指定し、実行されたRコードが表示されたダイアログウィンドウでOKをクリックして解析を確認します。次に、目的のタンパク質を発現する細胞の画像を処理します。画像をインポートし、前と同じように分析を設定します。スムージングと線幅は同じである必要があります。プロファイルの測定に進みます。プロットしてプロファイルの精度を確認し、必要に応じて前述のようにフィルタリングを設定します。分布計算マクロを実行して、原形質膜と細胞質内のタンパク質分配を計算します。入力データとモデルソースを指定し、最終的にデータフィルタリングを設定します。「残差変動が大きい結果を削除する」のチェックボックスをオンのままにします。「結果フィルタリングが必要な場合」個々のプロファイル測定の信号分解では説明できない最大許容残留変動のしきい値を指定します。箱ひげ図の作成に使用できるサンプルのグループ化因子を選択します。[OK] をクリックし、入力パスまたは出力パスを指定し、実行された R コードが表示されたダイアログ ウィンドウで [OK] をクリックして解析を確認します。ここに示されているのは、N-ミリストイル化およびホスホイノシチドへの静電相互作用を介して原形質膜と結合する植物タンパク質を発現するFM 4-64染色細胞の画像です。これらの相互作用は、ワートマニンによって実験的に乱されました。N-ミリストイル化の重要性は、N-ミリストイル化部位として機能する第2のアミノ酸位のグリシンの突然変異によって検証されました。両方の原形質膜結合能力の除去の効果は、タンパク質のN末端ドメインの切断によってテストされました。結果として得られる箱ひげ図は、N-ミリストイル化部位の突然変異後および薬物治療後の原形質膜親和性の減少を示しています。それらの相互効果は、N末端ドメインを除去する効果に匹敵します。このビデオを見れば、分析の主要なステップを適切な順序で実行する方法と、それらのパラメータを設定する方法について十分に理解できるはずです。この分析に続いて、得られたデータを統計的に評価するために、ANOVAのような統計的手法を実行することができます。この方法は植物浮遊細胞用に開発されましたが、滑らかで明確に区別できる原形質膜を持つ他の細胞や組織にも適用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

生きた細胞の原形質膜における蛍光タンパク質の脂質ラフトのパーティショニングを調べるための手法が説明されています。これは、脂質ラフトの内側または外側に位置するタンパク質の拡散時間に格差を利用しています。買収は、コントロール条件でまたは薬物を添加した後、動的に実行することができます。...

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。...

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

ここでは、生細胞内の内在性膜タンパク質の配向とトポロジーを決定するためのプロトコルを提示します。このシンプルなプロトコールは、目的タンパク質とGFPとの間のキメラの選択的プロテアーゼ感受性に依存しています。...

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。...

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。...

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

本稿は、生細胞の原形質膜における分子拡散を測定するためのスポット変異蛍光相関分光法(svFCS)顕微鏡を構築する方法に関するプロトコルを提示することを目的としている。...

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。...

カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

従来の技術よりも優れた感度と分解能でリポソーム膜透過性を評価するための費用対効果の高い方法を紹介します。この技術は、新しいカプセル化されたリガンド置換反応を使用して、モデル膜のホスホリパーゼA 2...

毒PLA2の膜栄養作用に及ぼすホスファチジルイノシトールリン酸基の影響を調べるためのリポソーム膜透過性アッセイ

学ぶ細胞膜関連タンパク質の定量解析法。FM 4-64染色と計算的手法を用いて、回折問題を解決しリアルタイムでタンパク質分布を可視化する。高度な顕微鏡を必要とせず、細胞シグナル伝達経路の研究に有用である。

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

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