Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

このビデオの全体的な目標は、新規のGABA-A受容体リガンドの発見を可能にするスクリーニングカスケードを説明することです。放射性リガンド結合、Xenopus卵母細胞およびげっ歯類の脳切片における電気生理学的記録を文学的な方法で使用する利点は、化合物のプロファイルを改善できることです。最終的に、強力なサブタイプ、選択的で有効な化合物が特定されます。

このデモンストレーションは、クミコ・カンバラとジェナ・トニャッチーニ、HiQScreenのソニアとダニエル・ベルトラン、ロシュのマリ・クレール・プスリムリンが行います。圧力噴出システムまたは自動注入システムを備えたマイクロマニピュレーターに取り付けられた先端径100マイクロメートルまでのガラスマイクロインジェクションニードルを使用して、プラスミドを含む溶液を10〜50ナノリットル注入します。この手順を開始するには、卵子を摂氏17度に保ち、熱ショックタンパク質の発現を防ぎます。

マイクロプレートは温度制御された保管場所に保管してください。次に、OR2の結合アッセイで陽性と判定された試験化合物を0.1マイクロモルおよび1000マイクロモルで溶解し、電気生理学的記録のために96ウェル平底ポリプロピレンプレートに廃棄します。2電極電圧クランプ記録を行うには、卵子を入れたプレートを自動システム上に置きます。

このスキームでは、アイコンベースのインターフェースを使用して自動記録システムをプログラムし、濃度活性の関係を適切に決定します。カーブフィッティングの場合、図示の濃度活性化曲線を使用して、アゴニスト濃度の対数の関数として電流振幅をプロットします。電気生理学的記録のためには、カルボゲンで泡立ったdACSF溶液中の脳を室温で保持します。

次に、左の海馬の形成を細かいヘラで解剖します。続いて、海馬の中央部から厚さ400マイクロメートルのスライドを組織チョッパーで横断します。ペイントブラシを使用して、スライスを記録チャンバーに移し、室温で45分間維持します。

その後、カルボゲンで35°C、毎分1.5ミリリットルの速度で発泡したrACSFでスライスを灌流します。単一のポピュレーションスパイクを記録するには、顕微鏡に取り付けられたチャンバーに脳スライスを置きます。スライスをrACSFで毎分3ミリリットルの速度で灌流します。

ピペットプーラーを使用して、約2メガオームの抵抗でホウケイ酸ガラスマイクロピペットを引っ張ります。マイクロピペットに2モルの塩化ナトリウムを含む溶液を入れ、ピペットホルダーに入れます。右のマイクロマニピュレータを使用して、海馬スライスのCA1領域のピラミッド層に記録マイクロピペットを配置します。

その後、絶縁バイポーラ白金イリジウム電極を左側のマイクロマニピュレーターのホルダーに入れます。左マイクロマニピュレータを使用して、海馬スライスのCA1領域にあるSchaffer側副路に刺激電極を配置します。刺激発生器を使用して、30秒ごとに電流パルスを刺激電極に供給し、人口スパイクが現れるまで刺激強度を徐々に増加させます。

得られる最大振幅の45%に対応する人口スパイクを呼び起こすように刺激強度を調整します。ペアパルス抑制を実行するには、刺激発生器を使用して30秒ごとに2つの電流パルスを刺激電極に送達します。最大振幅の 45% に対応する人口スパイクを呼び起こすように刺激強度を設定します。

化合物をテストするには、ACSFでテストする化合物を希釈して、DMSOの最終濃度が0.1%を超えないようにします。DMSOを化合物溶液と同じ濃度で制御溶液に加えます。Schaffer の側副刺激によって誘発される 1 つまたはペアのパルス人口スパイクを 30 秒ごとに少なくとも 30 分間記録します。母集団のスパイク形状は、このベースライン期間中安定している必要があります。

次に、試験対象の化合物の固定濃度を含むカルボゲン化rACSFを含むビーカーを準備し、単一またはペアのパルス集団スパイクの記録中に海馬スライスに溶液を灌流します。また、化合物を含まないカルボゲン化rACSFをスライスに灌流することにより、化合物効果からの回復を評価します。ここに示されているのは、ラットの海馬スライスの概略図であり、CA1錐体ニューロンの樹状突起樹状突起に投影されるCA3錐体細胞軸索に由来するシェーファー側副骨です。

マイクロピペットは、個体数の急増を記録するためにピラミッド層に配置され、磁場興奮性シナプス後電位の樹状突起記録のためにラジアタム層に配置されました。刺激電極は、Schafferの担保内に配置されました。この図は、同じ刺激電極を介して20ミリ秒間隔で加えられたペアの刺激によって誘発される人口スパイクを示しています。

第2の刺激に対する母集団の反応は、第1の刺激に対する反応の振幅よりも小さい。非選択的GABA A受容体NAMであるβ CCMの存在下と存在下で、集団の急増が記録されました。ベータCCMは、フィードフォワードのガバ作動性阻害を部分的にブロックすることにより、2番目の集団スパイクの振幅を増強しました。

この手順に続いて、薬物動態学、受容体占有率、in vivo での有効性、安全性薬理学などの他の方法を実行して、同定された化合物の臨床開発の可能性などの追加の質問に答えることができます。