Name: 酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 学ぶマウスにおける酵素抗体法を用いた免疫グロブリンアイソタイプ反応の評価方法。T細胞依存性および非依存性抗体応答を定量的に測定し、B細胞活性化と体液性免疫を比較解析する信頼性の高いプロトコルです。

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本研究は、国立衛生研究所健康補助金 R01 CA158402 (P. 謝) によって支えられた、R21 AI128264 (P. Xie) は、国防総省の付与 W81XWH-13-1-0242 (P. 謝) パイロット賞助成番号 P30CA072720 を通じてのニュージャージーのがん研究所から国立がん研究所 (P. 謝)、ブッシュ医グラント (P. 謝)、ビクター Stollar フェローシップ (A. Lalani) とアン *、ジェームス b. Leathem ・ フェローシップ (s. 朱)。

このプロトコル ラトガース大学の制度上の動物の研究倫理委員会のガイドラインに従います。すべてのマウスは NIH のガイドラインに従って機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物の議定書の下で使用されています。
1. マウスと素朴なマウス血清のコレクションの準備
<ol><li>特定動物病原体フリー施設の予防接種実験のためのすべてのマウスを維持します。</li>
	<li>使用性別をマッチさせた、若い大人 (8-12 週齢) ノックアウトと littermate は、免疫研究のケージと同じ親を共有するマウスを制御します。</li>
	<li>予防接種および血清の収集スケジュールは図 1に示すように計画します。</li>
	<li>予防接種の前に 7 日 (-7 日) に各マウスの素朴な血清を収穫します。下記のとおり手順 4 でレトロな軌道出血や血清の準備の手順に従います。</li>
</ol>2. TNP 多糖類 (TI 抗原) と TNP KLH (TD 抗原) の準備
<ol><li>TNP 多糖類株式や KLH TNP 溶液の 1 mg/mL の滅菌 PBS (pH 7.4) 徹底的に 0.5 mg/mL の抗原粉末を溶解します。分注各抗原は、0.5 mL/チューブ、滅菌 microfuge の管にソリューションをストックし、長期保存用-80 ° c、因数を維持します。複数の冷凍および抗原因数の解凍は避けてください。</li>
	<li>注射当日は、TNP 多糖類の体積を計算 (50 μ g/100 μ L/マウス) や KLH TNP を挿入できるマウスの数に応じて (100 μ g/100 μ L/マウス)。常温 (RT) TNP 多糖類または TNP KLH の因数の適切な数を解凍します。</li>
	<li>TNP KLH 注入の最初最終濃度 10 mg/mL に滅菌 PBS の 3 巻でミョウバン アジュバント (40 mg/mL) を希釈します。ミョウバン アジェバント混合物はよく希釈する前に中断されたかどうかを確認します。</li>
	<li>5 mL ポリプロピレン チューブに 2.3 の手順及び解凍 TNP KLH 溶液 (1 mg/mL) から 10 mg/mL ミョウバン アジュバント スラリーの等量を結合、よく混ぜ、30 分この TNP KLH/カリ明礬ミックス新鮮な注入の前に準備の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
</ol>3. マウスの免疫
<ol><li>安全キャビネットで 1 mL インスリン注射器を持つマウスを免疫する TNP 多糖類または TNP KLH/ミョウバンの投与した腹腔内 (i. p.) を実行します。内臓への注入を防ぐために各マウスの右下の象限にできれば約 30 ° の角度で針を挿入します。</li>
	<li>TI Ag 予防接種 (図 1A) の 0 日目にマウスあたり TNP 多糖類のi. p. 100 μ L を注入します。</li>
	<li>TD Ag 予防接種を 0 日目にマウスあたり TNP KLH/ミョウバン ミックス (ステップ 2.4 で作りたての) のi. p. 200 μ L を注入します。メモリ研究 (図 1B) ブースター接種として 21 日に同じ注射を繰り返します。</li>
	<li>注入後そのケージ各マウスを戻り、特定病原体フリーの状態で注入したマウスの一覧を維持します。</li>
</ol>4. レトロ軌道出血や血清の準備
<ol><li>異なる時点でマウス血清の収穫: TNP 多糖類、予防接種の日-7 と 7 (図 1A); マウス血清を収集TNP KLH/ミョウバン予防接種日-7、7、14、28 (図 1B) マウス血清を収集します。</li>
	<li>レトロ軌道出血のバイオ セーフティ キャビネット25で 1-2 分間 5% イソフルランと各マウスを麻酔します。各マウスの適切な麻酔を確保するためペダルの反射を実行します。</li>
	<li>人差し指と親指を眼球が突出するソケット25のうち、戻ってくる、眼球の周りの皮膚を引っ張るともう片方の手には、麻酔下マウスを保持します。眼球25下眼窩の内側の隅に 45 ° の角度で非ヘパリン パスツール ピペットを細管を挿入します。</li>
	<li>下向きの圧力を適用し、ピペットや静脈に侵入し、150-200 μ L ピペットや管の中の血液を収集する軽くチューブを回転させます。すぐに滅菌 1.5 mL および microfuge の管に血液を転送し、そのケージを回復するマウスを返します。</li>
	<li>血液サンプルが凝固 1-2 h のための RT に座ってみましょう。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 10 分間 13,000 x gで凝固血液サンプル新しい滅菌 1.5 mL および microfuge の管に血の塊の上に明確な血清を転送します。</li>
	<li>残存血栓を除去・ クリアの血清を回収手順 4.6 1 つより多くの時間を繰り返します。</li>
	<li>因数 50 μ L/チューブ、滅菌 1.5 mL microfuge の管に血清-80 ° C で血清を保存し、</li>
	<li>それぞれの目が全体の実験のためにせいぜい 2 回血を流したので、異なる時点で出血のための目を交互に。出血ターミナル、安楽死の前に各マウスから最大 1 ミリリットルの血液を収集します。5% CO2頚部転位続いてマウスを安楽死させます。 注: フローサイトメトリー解析と文化研究の in vitroの脾細胞が収穫できます。また、それぞれのマウスの遺伝子型を確認する脾細胞からゲノム DNA を準備します。</li>
</ol>5. マウス Ig アイソタイプ特異 ELISA
<ol><li>
バッファーと ELISA の前にソリューションを準備します。
	<ol>
<li>500 mL の結合バッファー (PBS、pH 7.4) を準備します。</li>
		<li>洗浄溶液 500 mL を準備 (PBS T (0.05% Tween 20)、pH 7.4)。</li>
		<li>100 mL のブロック バッファーを準備 (1% BSA pbs は、pH 7.4、4 ° C で保存)。</li>
		<li>準備基板バッファーの 1 L (1 M ジエタノールアミン、pH 9.8 (1 l H2O、pH 10 M HCl を使用して調整のジエタノールアミンの 97 mL) と 0.5 mM MgCl2)。光からアルミ箔でボトルを包むことによって基板バッファーを保護します。4 ° C でのストア</li>
		<li>停止液 (3 M NaOH) を 100 mL を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA プレートをコートします。
	<ol>
<li>血清 Ig アイソタイプ ELISA のコート 10 μ g/ml のアイソタイプ特異ポリクローナル ヤギ抗マウス Ig をキャプチャの 96 ウェル免疫プレート (メートル、G1、G2a、G2b、G3、A または E) abs 樹脂の結合バッファー (PBS) 100 μ L/ウェルで。</li>
		<li>TNP 固有の Ig アイソタイプ ELISA のため PBS で TNP(38)BSA の 10 μ G/ml 100 μ L/ウェルの 96 ウェル免疫板をコートします。</li>
		<li>親和性の高い TNP 固有の Ig アイソタイプ ELISA のため PBS で TNP(3)BSA の 10 μ G/ml の 100 μ L/ウェル2696 ウェル免疫板をコートします。4 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コーティング孵化後 2 回で 200 μ L/ウェル PBS T のプレートを洗う洗浄バッファーを破棄し、各洗浄後 (各プレートをペーパー タオルのスタックを逆さまにタップする) プレートを乾燥しみ。</li>
	<li>プレートをブロック: ブロックの 200 μ L/ウェルを追加 (PBS で 1 %bsa) コーティング プレートにバッファーに格納し、室温 1 時間版を孵化させなさい</li>
	<li>
プレートをブロックしている Ig アイソタイプ基準と 150 μ L/ウェルで独立した、未処理の 96 ウェル プレートでのブロック バッファーの血清サンプルの希釈液を準備します。
	<ol>
<li>開始の標準的な集中 (St01) として 250 ng/mL の Ig アイソタイプ基準を準備し、Ig 規格のシリアル希薄を 1:2 の 7 に 10 を作る (St02 St07 または st10 は、図 2A)。</li>
		<li>1: 500 または 1: 100 希釈でサンプル開始希釈として因子および合計の Ig アイソタイプのシリアル希薄または各血清サンプル (図 2A) の TNP 固有の Ig アイソタイプの 1:5 シリアル希釈 1:10 の 3 または 4 を作るマウス血清を準備します。Ige 抗体 ELISA として開始希釈 1:2 の希釈倍率でマウス血清サンプルを準備し、各血清サンプルのシリアル希薄を 1:5 の 3。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ブロック後、3 回で 200 μ L/ウェル PBS T のステップ 5.4 からプレートを洗浄し、しみ各洗浄後にプレートを乾燥します。</li>
	<li>ステップ 5.5 から 5.6 準備したプレートを 100 μ L/ウェル (キャプチャと abs 樹脂の検出に適した) 希釈の Ig アイソタイプ基準と希釈血清を転送します。標準および 4 ° C でサンプルでプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>3 回で PBS T の 200 μ L/ウェル プレートを洗浄し、しみは各洗浄後プレートを乾燥します。</li>
	<li>各プレートに追加適切なアルカリフォスファターゼ (AP) の 10 μ G/ml の 100 μ L/ウェル-共役アイソタイプ特異ヤギ抗マウス Ig (M、G1、G2a、G2b、G3、A または E) Abs ブロック バッファーで希釈しました。</li>
	<li>室温 1-2 h の AP 共役 abs 板を孵化させなさいIge 抗体の検出、37 ° C で 1-2 時間版を孵化させなさい。</li>
	<li>基質液 10 mL に 5 mg ホスファターゼ基板の 2 つの錠剤を溶解することにより基板の解決の 1 mg/mL を準備します。</li>
	<li>5 倍、200 μ L/ウェル PBS T の各プレートを洗浄し、しみは各洗浄後プレートを乾燥します。</li>
	<li>100 μ L/ウェル基板の解決の各プレートに追加します。RT、通常数分をかかるを開発する反応を許可します。</li>
	<li>
405 で各板を読んでその関連ソフトウェアとマイクロ プレート リーダーを用いた nm。
	<ol>
<li>波長」Lm1"を設定する「設定」をクリックして"405 nm"クリックして"[ok]"。</li>
		<li>「テンプレート」「空白」井戸、「基準」の井戸、96 ウェル プレート設定に従って「不明な」井戸を割り当てるをクリックしてします。</li>
		<li>「標準」井戸「シリーズ」「最初のサンプル」として「St01」を設定し、"スタートから"「トップ」を選択して"2"として「複製」を設定をクリックしてします。"サンプル Descriptor"をチェックし、「基準値」を入力:「ユニット「として」ng/mL」を選択、「250」として「開始値」を設定、「一歩」として"2"を設定します。「OK」をクリックしてします。</li>
		<li>最も集中して標準に達するとき ~ 1 の光学濃度 (OD) プレートの読み取りに「読む」をクリックします。</li>
		<li>「ファイル」メニューをクリックし、ファイルを保存する」の保存」をクリックします。</li>
		<li>最も集中の標準に近づく 〜 1.5、2、2.5、OD405 とそれぞれプレートをもう一度読んで「読み」をクリックしてします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 M NaOH の 25 μ L/ウェルの追加によって反作用を停止します。一度に 1 つのプレートの手順 5.12 に 5.15 を完了します。</li>
	<li>
マイクロ プレート リーダーに関連付けられているソフトウェアを使用して elisa 法データを分析します。
	<ol>
<li>ファイルを読み取りの Ig アイソタイプ規格の OD405 値をチェックし、良い線形範囲で詳細なデータ分析のための基準の適切な読み取りを選択します。</li>
		<li>標準曲線をプロットする 4 パラメーターのフィット プログラムを選択します。Co は、> 0.98 良いデータの品質を確保するために必要な標準曲線 (R2) の効率を確認します。</li>
		<li>希釈倍率の増加とともに各サンプルの OD405 値を減少させるかどうかを確認します。「未知数」をクリックしてすべての希釈サンプル井戸の濃度を取得します。</li>
		<li>濃度計算の Ig アイソタイプの標準曲線の線形範囲で OD405 の各サンプルの適切な井戸を選択します。</li>
		<li>計算式を使用して各サンプルの Ig アイソタイプ濃度血清: 血清免疫グロブリン濃度希釈倍率 x 選択したよく濃度を =。</li>
	</ol>
</li>
	<li>グラフをプロットし、適切なソフトウェア9,10,11を使用して統計分析を実行します。作る垂直散布血清の Ig アイソタイプ レベル同じ時点で Ig 応答を比較します。TD メモリ応答研究のブースター接種前後に Ig アイソタイプ応答を調べる経時的応答曲線を作る。誤差範囲を使用すると、各グループのサンプルの標準偏差 (SD) を表示できます。マウスの 2 つの遺伝子間の Ig アイソタイプ応答を比較するには、統計的有意性を決定する 2 尾のデータの対になっていないt検定を使います。別に重要なp値 < 0.05 を設定します。</li>
</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

ここでは、elisa 法を用いたマウスの TD と TI の Ig アイソタイプ応答特性プロトコルについて述べる。このプロトコルの実装を成功させるには、テーブル 1、ELISA アッセイ プレート、予防接種 Ags、マウス Ig アイソタイプ特異的抗体基準などに指定された材料の使用が必要です。処理組織培養皿を用いた elisa 法を避けるために注意が必要があります。標準および血清サンプルの希釈液を別未処理プレート (丸底) で行われ ELISA プレートに追加されます必要があります。このプロトコルを使用して、高い特異性と感度で信頼性の高い結果を一貫して取得しております。
このプロトコルでは重要な手順は、Ag の予防接種、レトロな軌道は出血、および Ig アイソタイプ特異的 ELISA に含まれます。TD Ag 予防接種のため Ag/アジュバントの量を注入する正しい TNP KLH/ミョウバン ミックスを徹底的に再停止する必要があります。血栓はピペットやキャピラリー チューブでレトロな軌道出血中に、すぐに新しいピペットやキャピラリー チューブに変更し...

B リンパ球は、体液性免疫の主プレーヤーと抗体、免疫グロブリン (Ig)1,2とも呼ぶことができる哺乳類で唯一セル型です。B 細胞から分泌される抗体は中和、オプソニン化、補体の活性化、防御免疫3につながるなど多様なメカニズムを介して病原体の侵入に対する恐るべき防衛を提供します。B 細胞による抗体の分泌は通常 2 つの個別の3信号を必要とする特定の B 細胞の完全な活性化後のみ達成されます。信号 1 は B 細胞受容体 (BCR)3特定ナイーブ B 細胞の表面に発現する抗原 (Ag) の直接結合によって中継されます。信号 2 のソースによって B 細胞の活性化を胸腺依存 (TD) または胸腺非依存性 (TI)3,4に分けることができます。TD 抗原応答信号 2 は活性化血続き CD4 T ヘルパー (TH) 細胞、CD154、共刺激受容体 B 細胞1,2,3に発現する CD40 リガンドを表現するによって提供されます。TI 抗原応答 Toll 様受容体のいずれかの婚約から来る信号 2 (タイプ 1 の場合 Tlr TI Ag)、BCRs の広範な架橋または (タイプ 2 の場合 TI Ag) B 細胞3,4。1 型チタン (TI-1) 抗原は、Tlr は、細菌リポ多糖 (LPS)、ウイルス Rna と微生物 CpG DNA4,5などの微生物配位子です。2 型チタン (TI-2) 抗原反復性の高い構造をしているし、長引くと永続的な複数 BCRs4,6架橋した B 細胞にシグナルを配信することができます。TI 2 抗原の典型的な例には、肺炎球菌多糖類および多糖類のハプテン共役6,7があります。TD と TI の抗原は堅牢な抗原特異的 igm 抗体応答を引き出すことができるし、抗原提示細胞 (APCs) 樹状細胞 (Dc)1 などによって提供される助けを借りてアイソタイプ切り替え抗体 (IgG, IgA, IgE) の生産を誘導するも、2,3。さらに、TD と TI の抗原は Apc の助けを借りてメモリ反応を誘導することができるが TD 抗原は、メモリー B 細胞世代3、8を誘導で効率的です。
このプロトコルでは TD と TI Ig 応答がハプテン共役モデル抗原 2,4,6 trinitrophenyl 鍵穴カサガイ ヘモシアニン (TNP KLH) と TNP 多糖類 (ニュートラル、高度分岐腹腔内 (i. p.) 予防接種でマウスで誘発されます。高質量)、それぞれ9,10,11。TD 抗原は抗体12の生産を高めるためにアジュバントで通常使用されます。ここで私達のプロトコル、ミョウバン、予防接種研究12で一般的に使用される補助との TNP KLH を注入します。使用することができますアジュバントの他の例は、(CFA や対仏投資庁) に Freund のアジェバント完全なまたは不完全な monophosphoryl 脂質 A/トレハロース結核 (」Ribi「アジュバント) と CpG オリゴデオキシヌクレオチド、等13, 14. 予防接種後マウス血清中の異なる時点で収穫され、血清中の TNP 特異的抗体は、Ig アイソタイプ特異酵素抗体法 (ELISA)9,10,を用いて定量化が11。
Elisa 法は、医学の診断ツールとして、また生物医学研究15,16の分析的なツールとして広く使用されているプレート ベースのアッセイです。検出し、抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、さまざまな抗原、等を含む検体を定量化するものです。ELISA は、直接的、間接的、サンドイッチと競争力のある ELISA15,16を含むいくつかの異なる形式で実行できます。一般に、一次抗体とインキュベートする 96 ウェル マイクロ プレート通常、固体表面に抗原を固定化が含まれます。インキュベーション後、非連結の抗体は洗い流されました。信号検出器によって検出されたように表示色の変更を生成する発色性基質を切断することができます酵素 (通常西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ) に直接 ELISA の一次抗体を直接活用します。分光光度計15,16。対照的に、酵素の二次抗体を一次抗体をバインドする使用する場合、この間接 ELISA15,16として考慮されます。間接 elisa 法はより敏感な15,16に対し、ELISA は高速です。サンドイッチ elisa 法、プレートは、サンプルでは、興味の抗原を固定化するために使用「キャプチャ」抗体でコーティングされて直接的または間接的な方法15,のもう一つの「検出」抗体によってキャプチャされた抗原を検出できるし、16. 抗原は抗原の 2 つの異なる抗体によって検出されるので、サンドイッチ elisa 法は高い特異性を提供しています。競合 ELISA のサンプルの抗原と一次抗体へのバインディングのプレート連結抗原間競争が確立し、基板からの信号の減少を測定することによってサンプル中の抗原濃度を定量化するし15,16. 競合 elisa 法上記の直接的または間接的な形式を使用して実行することができます、1 つだけエピトープ15,16小さな抗原の検出に便利です。
抗体の測定のための代替技術ほか、ラジオ ・ イムノアッセイ (RIA)、電気化学発光 (ECL) 測定と表面プラズモン共鳴 (SPR) 法17。RIA は、その対策を開発最初の免疫測定法で、高い特異性と感度の標識試薬18,19を使用して抗原 (または抗体) の存在だった。しかし、放射性毒性、処分費用、貯蔵寿命、放射性物質を操作する特別なライセンスの問題のため elisa 法はより良い、普通のより便利な手法を使用して、20,21。ECL は化学発光反応が電極の表面に安定した前駆体から高反応性の種を生成する電気を使用して開始し、検体の量を測定するための高感度定量 (抗原などや抗体)22。ただし、ECL 特別な機器が必要です、したがって、広くされている ELISA23。SPR は配位子の結合を測定する使用ことができます直接試金 (e.g。、抗体) に分子を固定化 (e.g。、抗原) センサー チップ表面の24。SPR は、リアルタイムでの相互作用を検出すると、非常に具体的と ELISA のように標識試薬の使用を必要としません。しかし、SPR はまた特別な機器が必要です、ELISA17よりも感度が低い。代替方法の限界を考えると、ELISA は、この議定書の目的のため最も適した、便利な手法です。ここでは、合計の Ig アイソタイプ レベルの解析および間接 elisa による抗原特異的免疫グロブリンアイソ タイプの分析のプロシージャのサンドイッチ elisa 法の使用について述べる。

<table><tbody><tr><td>VersaMaxチューナブルマイクロプレートリーダー</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>プレートを読み取る機器</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>プレートリーダー用ソフトウェア</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td></td><td></td><td>グラフ化および統計用ソフトウェア</td></tr><tr><td>TNP-AECM-多糖類(FICOLL)</td><td>バイオサーチテクノロジー</td><td>F-1300-10</td><td>A TI Ag 免疫用</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>バイオサーチ技術</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag</td></tr><tr><td>免疫用 TNP(38)-BSA</td><td>バイオサーチ技術</td><td>T-5050-10 (標識比:38)</td><td>TNP特異的ELISA用コーティングAg</td></tr><tr><td>TNP(3)-BSA</td><td>バイオサーチ技術</td><td>T-5050-10 (標識比:3)</td><td>高親和性TNP特異的Ig</td></tr><tr><td>Imject Alum 用コーティングAg</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>予防接種用ミョウバンアジュバント</td></tr><tr><td>ファルコンポリプロピレンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>TNP-KLH/ミョウバン</td></tr><tr><td>BDインスリンシリン</td>ジのインキュベーション用 <td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>マウスの内径注射用</td></tr><tr><td>Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>未処理96ウェルマイクロプレート用、丸底</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>標準およびサンプルの段階希釈用</td></tr><tr><td>ホスファターゼ基質、5 mg錠</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>AP基質</td></tr><tr><td>ジエタノールアミン</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>AP基質バッファーの成分</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>マウスIgMヤ</td></tr><tr><td>ギ抗マウスIgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>マウスIgG1</td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗マウスIgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>マウスIgG2a</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG2b</td>のためのキャプチャAb <td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td>マウス<td>IgG2b</td></tr>ヤ<tr><td>ギ反マウスIgG3</td>のためのキャプチャAb <td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>マウスIgG3</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>マウスIgA用捕獲Ab</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>マウスIgE用捕獲Ab</td></tr><tr><td>AP-ヤギ抗マウスIgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>マウスIgM用検出Ab</td></tr><tr><td>APヤギ抗マウスIgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>マウスIgG1用検出Ab</td></tr><tr><td>AP-ヤギ抗マウスIgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>マウスIgG2aの検出Ab</td></tr><tr><td>AP-ヤギ抗マウスIgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>マウスIgG2bの検出Ab</td></tr><tr><td>AP-ヤギ抗マウスIgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>マウスIgG3</td></tr><tr><td>AP-ヤギ抗マウスIgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>マウスIgA</td></tr><tr>の検出Ab<td>AP-ヤギ抗マウスIgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>マウスIgE</td></tr><tr><td>マウスIgM標準</td>BD<td>バイオサイエンス</td><td>553472</td><td>TNP特異的IgM、クローン用検出Ab&nbsp;G155-228</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>TNP-specific IgG1, Clone&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a standard</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>TNP-specific IgG2a, Clone&nbsp;G155-178</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>TNP特異的IgG2b, Clone&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Mouse IgG3 standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>KLH特異的IgG3, Clone&nbsp;A112-3</td></tr><tr><td>マウスIgA標準</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>Mineral oil-induced IgA, Clone&nbsp;MOPC-320</td></tr><tr><td>マウスIgE標準</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>TNP特異的IgE, Clone&nbsp;C38-2</td></tr></tbody></table>

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

抗体、免疫グロブリン (Ig) から分泌される分化 B リンパ球、plasmablasts/プラズマ細胞、体液性免疫とも呼ばれますは、多様なメカニズムを介して病原体の侵入に対する恐るべき防衛を提供します。予防接種の 1 つの主要な目標は、生命にかかわる伝染を防ぐために防御抗原特異的抗体を誘導するためです。胸腺依存 (TD) と胸腺に依存しない (TI) 抗原の堅牢な抗原特異的 igm 抗体応答を引き出すことができる助けを借りてメモリー B 細胞の世代だけでなく、アイソタイプ切り替え抗体 (IgG, IgA, IgE) の生産を誘発するも両方抗原提示細胞 (APCs) によって提供されます。ここでは、酵素免疫測定法 (ELISA) を用いたマウスにおける TD と TI Ig アイソタイプ反応を特徴付けるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは TD と TI Ig 反応が誘発されるマウスの腹腔内 (i. p.) ハプテン共役モデル抗原 (ミョウバン) の TNP KLH TNP 多糖類 (PBS) で免疫によるそれぞれ。TD メモリ応答を誘導して、ミョウバンの TNP KLH のブースター接種が同じ抗原/アジュバント最初の予防接種後 3 週間で与えられます。マウス血清は、予防接種の前後に、異なる時点で収穫されます。総血清 Ig と TNP 特異的抗体がそれぞれ Ig アイソタイプ特異サンドイッチと間接 elisa 法を用いたを定量化してその後。正しく各の Ig アイソタイプの血清濃度を定量化するために、サンプルは標準曲線の線形の範囲に収まるように適切に希釈する必要があります。このプロトコルを使用して、高い特異性と感度で信頼性の高い結果を一貫して取得しております。Cytometry 流れ、体外培養脾細胞の免疫組織化学的など他の補完的な手法と組み合わせて使用されるとき染色 (IHC)、このプロトコルは、抗体の包括的な理解を得るために研究者与えられた実験の設定に応答します。

我々 は TI と TD の Ig アイソタイプ応答9,10,11免疫システム TRAF3 の重要な調節因子の役割を調査するのにこのプロトコルを使用しています。TRAF3 直接的または間接的数 TNF 受容体スーパーファミリーを含め自然免疫と適応免疫受容体のシグナル伝達を調節する、Toll 様受容体と T 細胞受容体/CD28、とりわけ27,28。我々 は TRAF3 が免疫応答を調節する別の免疫細胞サブセットの個別の役割を果たしていることを仮定します。この仮説をテストするため、我々 はそれぞれ9,10、B 細胞や T 細胞、骨髄細胞、特に削除<...

本稿では elisa 法を用いたマウスの T に依存し、T 独立免疫グロブリン (Ig) アイソタイプを特徴付けるためのプロトコルについて述べる.このメソッドは、単独で使用またはフローと組み合わせてフローサイトメトリーは T に依存し、T 独立した抗原免疫したマウスの B 細胞の Ig アイソタイプ応答の違いを識別するために研究者をできるようになります。

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

この方法は、抗原免疫によって誘導される依存性および非依存性の抗体応答、ならびにB細胞の活性化および胚中心反応に関する免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、マウスのB細胞活性化と体液性免疫を直接比較することで、信頼性と定量的なIgアイソタイプ反応測定を提供することです。TNP多糖類の免疫には、マウス1匹あたり1ミリリットルのインスリン注射器に100マイクロリットルの新たに調製した抗原溶液を装填し、下臓器注射を避けるために各動物の右下象限に針を約30度の角度で挿入します。すべてのマウスを注射したら、動物をケージに戻して、特定の病原体のない施設に収容します。適切な実験時点で、眼窩後出血により免疫した各動物から150〜200マイクロリットルの血液を採取し、サンプルを室温で1〜2時間凝固させます。インキュベーションの終了時に、凝固した血液サンプルを遠心分離し、各血栓の上部から透明な血清を滅菌済みの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。2回目の遠心分離後、残留血栓を除去し、50マイクロリットルの血清を個々の滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、摂氏マイナス80度で保存します。めっきする前に、個々の96ウェルイムノプレートに、総血清Igアイソタイプ用のマウスIgアイソタイプ特異的捕捉抗体、TNP特異的Igアイソタイプ用のTNP-38BSA抗原、または高親和性TNP特異的Igアイソタイプ用のTNP-3BSA抗原をコーティングし、コーティングしたプレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、ウェルあたり200マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを2回洗浄します。洗浄バッファーを廃棄し、プレートをペーパータオルの山で軽くたたいて乾かします。次に、ウェルあたり200マイクロリットルのブロッキングバッファーでプレートをブロックし、室温で1時間のインキュベーションを行います。プレートがブロッキングされている間に、適切な標準液と血清希釈液、およびブロッキングバッファーを、示されているようにウェルあたり150マイクロリットルの別の未処理の96ウェルプレートに調製します。次に、示されているようにELISAプレートを洗浄バッファーで洗浄し、希釈したIgアイソタイプ標準試料と血清サンプルをそれぞれ100マイクロリットルをELISAプレートの適切なウェルに加えます。4°Cで一晩インキュベートした後、示されているようにプレートを洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した適切なアルカリホスファターゼ標識アイソタイプ特異的抗体100マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で1〜2時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、プレートを洗浄し、調製したばかりの基質溶液100マイクロリットルを各ウェルに加えます。室温で次の数分間にわたって進行する反応を監視します。反応が分析に十分な堅牢性を持つようになったら、プレートをマイクロプレートリーダーにセットし、設定をクリックして波長を405ナノメートルに設定します。[OK]をクリックし、[テンプレート]をクリックして、96ウェルプレートの設定に従って、適切なブランクウェル、標準ウェル、および不明なウェルを割り当てます。次に、最も濃縮された標準試料が約1、1.5、2、および2.5の光学密度に達したら、読み取りをクリックしてプレートを読み取り、各分析後に結果のデータファイルを保存します。免疫化がない場合、IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgAの基礎血清レベルの上昇は、性別および年齢が一致したB-TRAF3の同腹仔対照動物と比較して、B細胞特異的TNF受容体関連因子3またはB-TRAF3ノックアウトマウスで観察されます。TNP多糖類またはTNP-KLHによる免疫の7日後、免疫に対する胸腺非依存性Igアイソタイプ応答の分析により、骨髄系細胞特異的TRAF3ノックアウトマウスでは、同腹仔対照と比較して、胸腺非依存性TNP特異的IgG3レベルが有意に高く、胸腺依存性TNP特異的IgG2bレベルが上昇していることが明らかになりました。さらに、TNP-KLH免疫に対する胸腺依存性マウスの一次応答および記憶応答の評価は、T細胞特異的TRAF3ノックアウトマウスにおいて、胸腺依存性IgM一次応答の部分的な減少およびIgG1一次および記憶応答の欠陥が存在することを示しています。この手順を試行する際、ELISAには通常、標準曲線の線形範囲によって定義される検出限界があるため、サンプルの複数回の希釈が必要になる場合があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、フローサイトメトリーやLスポットなどの他の補完的な方法を実行して、特定の実験環境における抗体応答を包括的に理解することができます。

characterization-thymus-dependent-thymus-independent-immunoglobulin

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マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

私たちは、磁気ビーズベースのT細胞濃縮およびペプチド:主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体を通じて、マウス肺の希少抗原特異的T細胞集団を単離および同定するための詳細なプロトコールを提供します。...

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

学ぶマウスにおける酵素抗体法を用いた免疫グロブリンアイソタイプ反応の評価方法。T細胞依存性および非依存性抗体応答を定量的に測定し、B細胞活性化と体液性免疫を比較解析する信頼性の高いプロトコルです。

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリンアイソタイプ反応の評価

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