アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

この方法は、宿主を殺す病原性エフェクターが細菌細胞でいつ発現するか、表面付着したインプラント細胞の病原性状態は何かなど、細菌の病原性分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速で定量的であり、宿主細胞の取り扱いが比較的容易であることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Pseudomonasの表面付着型インプラント亜集団が異なる宿主殺傷表現型を持っていることに気付いたときでした。

テキストプロトコルで概説されているように、大腸菌株BRを一晩で成長させ始めるには。次に、大腸菌の培養物を室温に戻します。木の棒を使用して、アメーバを750リットルの培養物に無菌化します。

すぐに700リットルのアメーバ大腸菌混合物をGYPプレートに加えます。プレートを傾けて、培養物をプレートの表面に均等に広げます。次に、プレートを高湿度を維持するボックスに入れます。

ボックス内のプレートを22°Cで4〜5日間インキュベートします。潜伏期間が終了したら、滅菌ピペットチップを使用して、プレートの半分からアメーバ胞子を採取します。次に、ピペットを上下に動かして、アメーバをピペットチップに1 mLのPS培地に再懸濁します。

接種混合物を、抗生物質抗真菌溶液を添加した25 mLのPS培地を入れた250 mLフラスコに移します。.アメーバを22°Cで100rpmの回転シェーカーで成長させます。緑膿菌を一晩培養した後、6cmのシャーレでPSB培地で培養液を希釈します。

次に、37 Cで100 rpmに設定されたベンチトップローテーターで培養物を振盪します。まず、250 mLフラスコにDBバッファー中の1%寒天50 mLを電子レンジで入れます。15mLの溶融寒天にAMカルシウム15Lを加え、穏やかに混ぜます。12×10cmのガラス板に溶かした寒天を流し込み、室温で10分間固化させます。

次に、金属製の定規と印刷されたグリッドを使用して、固化した寒天パッドを1.5 x 1.5 cmの小さなセクションにカットします。ゲルが使用できる状態になるまで、ゲルが水分を保ったままであることを確認してください。次に、表面に付着した細胞を分離するために、ペトリ皿から液体培地を取り出します。

次に、1 mLの現像バッファーで皿を洗浄し、浮遊性細胞を除去します。表面付着細菌細胞の病原性を測定するには、以前に得られた表面付着細菌細胞から10 Lのアメーバ細胞を添加します。浮遊性細胞を単離するには、培養物の10 Lを新鮮なシャーレに移します。

次に、10 Lのアメーバ細胞を以前に得られたプランクトン性細菌と混合することにより、プランクトン性細胞の病原性を分析します。すぐに小さな寒天パッドを、ペトリ皿の表面にある適切なバクテリアアメーバ混合物の上に置きます。次に、余分な液体を静かにピペッティングして余分な液体を取り除き、皿を20分間乾燥させます。

皿を蓋で覆い、室温でさらに40分間インキュベートします。最後に、蛍光顕微鏡を使用して、少なくとも100個のアメーバ細胞の画像を取得します。このプロトコルでは、プランクトン性および表面付着性緑膿菌細胞の病原性をアッセイした。

表面付着した野生型Pseudomonas aeruginosaは、丸いアメーバ細胞形状とカルセイン蛍光の存在で示されるアメーバを殺しました。浮遊性細胞と比較して、表面付着した野生型Pseudomonas aeruginosaは高い宿主殺傷指数を持っていました。プランクトン細胞は、非晶質アメーバ細胞の形状で示されるアメーバによって消費され、カルセイン蛍光は比較的少なかった。

この手順を試みる際には、カルセインAM細胞とアメーバ細胞の新鮮なストックを使用し、アメーバの光学密度を綿密に追跡することを忘れないでください。この手順に続いて、転写プロファイリングなどの他の方法を実行して、プランクトン性亜集団と表面付着亜集団でどの遺伝子が活性化されるかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、迅速な画像ベースの病原性アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。