Name: アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 学ぶ細菌の病原性測定法。Dictyostelium discoideumアメーバを宿主として用い、蛍光顕微鏡で1時間で宿主殺傷効果を定量的に評価する。Pseudomonas aeruginosaなどの浮遊菌と表面付着菌の異なる病原性状態を迅速に解析できる。

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KP と書き、原稿を改訂します。KP は、実験と解析を実行します。この作品は、名前を付けてに国立衛生研究所 (NIH) キャリア遷移賞 (K22AI112816) によって支えられました。

すべての実験手順は、カリフォルニア大学アーバイン校で行われました。
1. バッファーとソリューション
<ol><li>ホストゲノム スープ (LB) 1 L のガラス瓶を準備するには、1 l 二重蒸留水 (ddH2O) の LB ミラー ミックス 25 g を追加します。ペトリ皿、寒天の追加 20 グラムを追加します。オートクレーブ滅菌します。10 cm 径シャーレに溶融寒天培地を 25 mL を注ぎ、室温で固化することができます。室温で液体のメディアと寒天 4 ° C で保存します。</li>
	<li>D-グルコースの 1 g を混合することによってグルコース酵母ペプトン (激痛) プレート 1 L のガラス瓶を準備、2 g ペプトン、酵母の 0.25 g のエキス、KH2PO4の 4.2 g、ナ2HPO47 H2O の 5.1 g、1 l の ddH2寒天 25 gO をオートクレーブ滅菌します。10 cm 径シャーレに溶融寒天の 25 mL を注ぎ、室温で固化することができます。4 ° C でのストア</li>
	<li>ペプトン 10 g を混合して 1 L のガラス瓶にペプトン S (PS) メディアの準備、7 グラム酵母エキス、D-グルコース、0.12 g の Na2HPO47 H2O、KH2PO41.4 g、40 μ g ビタミン B12の 15 g、80 μ g 葉酸 ddH2o. の 800 の mL での校正日以内 pH メーターが使用されていない場合、pH 4 と 7 の pH の基準を使用して電子 pH メーターと。<ol>
<li>PH メーターを使用して PS の培地の pH を測定します。5 M 島または 5 M H3PO4 6.5 に pH を調整する追加します。1 L に最終的な音量を調整する ddH2o. フィルターを使用して滅菌 0.22 μ m の真空フィルター、4 ° C で保存 注: は、pH 調整など手袋、防護服、眼の保護具保護具を着用して慎重に進めるし、保護に直面します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>開発バッファー総理 × 10 を準備 (DB') KH2PO4Na2HPO4 7 H2O と ddH2O の 13.4 g 3.4 g を 800 mL の容量に追加することで 1 リットルのガラス瓶内のバッファー。日以内 pH メーターが使用されていない場合、pH 4 と 7 の pH の基準を使用して電子 pH メーターを調整します。<ol>
<li>電子 pH メーターを使用してバッファーの pH を測定します。優しく、5 M 島または必要に応じて 5 M H、3PO4を追加して 6.5 に pH を調整します。1 l ddH2O を使用して最終的な音量を調整し、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。常温で保存します。 注: は、pH 調整など手袋、防護服、眼の保護具保護具を着用して慎重に進めるし、保護に直面します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 の 100 mL を混合することによって開発のバッファー (DB) x 1 を作る DB x' バッファーの 1 mL を滅菌 2 M MgCl21 mL の滅菌 1 M CaCl2。室温でオートクレーブ滅菌 ddH2o ・ ストアを使用して 1 L 瓶で 1 L に最終的な音量を調整します。</li>
	<li>滅菌 PS 媒体の 100 mL を混合することによって 1 リットルのガラス瓶の中の PS:DB メディアの準備、100 mL の滅菌 10 DB x' バッファー、および滅菌 ddH2O の 1 mL と 1 l. サプリメントの合計ボリュームに滅菌 2 M MgCl2 1 mL の滅菌 1 M CaCl2. 4 ° C でのストア</li>
	<li>カルセイン AM 原液を準備するには、製造元によって提供されたプラスチック コンテナーのカルセイン AM の 50 μ g に DMSO の 50 μ L を追加します。-20 ° C にてストア</li>
</ol>2. 成長とアメーバの維持
<ol><li>初期生育期間中にアメーバの食料源として大腸菌株 B/r17を成長します。連勝エシェリヒア属大腸菌の凍結ストックからバックアップ/リストア LB 寒天培地プレート-80 ° C で保存し、シングル コロニーを取得する 37 ° C は一晩で孵化させなさい。</li>
	<li>LB 培地 2 mL にエシェリヒア属大腸菌のバックアップ/リカバリの単一コロニーを接種してローラー ドラムまたは 37 ° C でシェーカーで一晩インキュベートします。</li>
	<li>部屋の温度に一晩大腸菌文化をもたらします。木の棒を使用して、-80 ° C で一晩かけて培養の 750 μ L に冷凍在庫からアメーバを接種します。 無菌成長18のことができる注: 使用D. キイロタマホコリカビひずみ AX3。この手順は、無菌の成長を必要はありませんが、以降のステップは彼の要件を持っています。</li>
	<li>すぐにブドウ糖酵母ペプトン (激痛) プレート大腸菌アメーバ-混合物の 700 μ L を追加します。行ったり来たり、サイドにサイド必要に応じてそれを傾けることによってプレートの表面に均等に文化を広めます。拡散機の使用を避けます。</li>
	<li>高湿度を保持するボックスの上向き寒天と石膏板を配置します。2 つの使い捨て可能なプラスチック容器を使用 (183 cm × 183 cm × 91 cm) 互いの上にスタックします。約 25 mL の水で、下のコンテナーを埋める、水貯留層から最上位のコンテナーに移動する水分が許可されるようにコンテナーの床に開けられたいくつかの 0.5 cm 直径穴を持つ最上位のコンテナーを配置します。</li>
	<li>アメーバの胞子が観察された (図 2) プレートの表面近く成長するまで 4-5 日、石膏板、22 ° C でボックスを孵化させなさい。冷蔵インキュベータを使用すると、室温で放置ではなく、プレートを孵化させなさい。 注: 胞子が成長して後、彼ら実行可能なまま数週間プレートに 4 ° C で保存する場合寒天面を上向きにプレートを格納します。インキュベーションの 3-4 日後、アメーバの胞子形成の発症を示すが、細菌の芝生内のクリアのゾーンを観察できます。<ol>
<li>インキュベーション (図 2) の 4-5 日後、小さなアメーバ版面の上の胞子を観察します。 注: はにつれて胞子の質の低下はこの期間を超えても、一週間以上のアメーバがないです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL の滅菌ピペット チップの板の表面に平行をスイープすることにより、アメーバの無菌の成長に備えてアメーバ胞子を収集します。10 cm シャーレの半分から胞子を収集します。 注: は、このモーションエシェリヒア属大腸菌の多数を収集として寒天プレートの表面に先端は触れないでください。</li>
	<li>PS 培地 1 mL に先端を浸すと、上下に軽くピペッティングによるピペットの先端に、アメーバを再懸濁します。</li>
	<li>0.25 倍の濃度で抗生物質抗真菌薬ソリューションと PS 培の 25 mL を含む 250 mL フラスコに接種の混合物を転送します。 注: は、-20 ° C で 250 μ 因数として抗生物質抗真菌薬ソリューションを格納します。融解とこれはその有効性を減らすかもしれない、このソリューションの凍結の繰り返しは避けてください。</li>
	<li>100 rpm で回転シェーカーの 22 ° C で axenically アメーバを成長します。600 で測定光学密度に細胞を成長ステップ 5 で病原性試金のための 0.2 〜 0.5 nm (外径600)。 注: この手順 (手順 2.7) 接種の時から成長の 3-4 日が必要です。細胞より高い密度に成長している場合、外径600 0.05 以下 PS 媒体に戻って文化を希釈し、0.2 〜 0.5 の OD600に戻る。</li>
</ol>3.緑膿菌の成長
<ol><li>LB プレートから膿のシングル コロニーをピックアップ、2 mL の PS:DB 文化に接種し、飽和する 37 ° C で一晩成長します。 注: は、PS:DB メディアに抗生物質抗真菌薬ソリューションを追加しないでください。</li>
	<li>PS:DB を使用して 6 cm 径シャーレに一晩文化 1: 100 または縮尺を希釈します。浮遊性細胞の病原性は試金されるだけ場合、は、代わりに従来の培養管を使用して文化を育てます。37 ° C で 100 rpm に設定ベンチトップ回転子の文化を振る</li>
	<li>再現性を確保するための特定の時間ポイントで文化を収穫します。病原性を評価する前に 1 時間 30 分は、セクション 4 で説明した寒天パッドを準備します。 注: P. 緑膿菌の病原性は表面に成長の約 8 h によって誘導されます。</li>
	<li>表面接続型細胞を分離するには、液体培地をシャーレから削除、浮遊性細胞を除去する DB バッファーの 1 つの mL で十分に洗い流して、すぐに 5.1 の手順に進みます。 注意: 30 以上洗っていない同志として s を混乱させる細胞の表面接続をデタッチし、病原性測定に影響を与える可能性があります。</li>
	<li>浮遊性細胞を分離するには、きれいなシャーレにシャーレから文化の 10 μ L を転送し、5.1 のステップに進んでください。</li>
</ol>4. 顕微鏡 - 寒天パッドの準備
<ol><li>アメーバは膿と混合する準備ができている前に、寒天パッド 1 時間に約 30 分を準備します。</li>
	<li>250 mL フラスコにバッファーが DB の 1% (w/v) 寒天の 50 mL を電子レンジします。寒天の塊までミックスすべての 20 s が消えます。</li>
	<li>15 分間予熱した 55 ° C の水浴にそれを置くことによって溶融寒天をクールします。</li>
	<li>円錐管に溶融寒天培地 15 mL にカルセイン AM 原液の 15 μ L を追加します。ミックスを軽く反転管 4-5 回、次のステップに進んでください。 注: は、ポリプロピレン 15 mL 遠心管でこの手順を実行します。これは余りにすぐに固めるため寒天になります厚いガラス製の容器は使用しないでください。</li>
	<li>12 cm × 10 cm のガラス板の上に溶融寒天混合物を注ぎ、室温で 10 分間を固めるに寒天を許可します。1.5 cm × 1.5 cm に小さいセクションに印刷されたグリッド上にガラス板を置くと金属製の定規を使用してグリッドに沿って切断によって凝固寒天パッドをカットします。</li>
	<li>使用する準備ができるまで、湿気のあるボックスで水和ゲルを維持します。</li>
</ol>5. 顕微鏡イメージング用細菌アメーバ サンプルの調製
<ol><li>細菌細胞の表面接続型の病原性を試金するには、ステップ 3.4 からの細菌の表面接続型にステップ 2.10 からアメーバ細胞の 10 μ L を追加します。 注: この手順では、バクテリアとアメーバの混合について説明します。</li>
	<li>浮遊性細胞毒性アッセイ、ステップ 3.5 から浮遊性細菌の 10 μ L でステップ 2.10 からアメーバ細胞の 10 μ L を混ぜます。 注: は、細菌と混合する前に (0.2 〜 0.5 の600を OD) で axenically 栽培アメーバ細胞を洗浄しないでください。抗生物質・抗真菌薬のソリューションを使用するためアメーバ文化では、大腸菌の成長は観察されなかった.</li>
	<li>すぐにペトリ皿表面の細菌アメーバ混合物の上にステップ 4.5 から 1.5 cm × 1.5 cm カルセイン AM 寒天パッドを配置します。 注: は、クイック滑らかな動きを使用して混合物の上に寒天パッドを配置します。この動きはパッドの下側から外周に向かって細胞をプッシュする傾向があるのでゆっくりと混合物の上にパッドを低くしてはいけない。この手順により、細菌やアメーバに均等に混合、固定化、両方の細胞の種類と同じ平面に限られています。</li>
	<li>優しく周囲の寒天パッド残りの液体をピペットで余分な液体を削除します。室温で 20 分間乾燥にペトリ皿を許可します。</li>
	<li>フタ付きシャーレでカバーし、室温 6.1 の手順に追加 40 分続行で固定化したアメーバ細菌混合物を孵化させなさい。 注: 時間の経過とともにバック グラウンド蛍光が増加するにつれて、時間の同じ量のすべてのサンプルをインキュベートすることが重要です。1 h のインキュベーション時間をお勧めします。1 h 以上孵化、バーストし始めるかもしれないアメーバ細胞、以下再現。</li>
</ol>6. 顕微鏡画像の取得
<ol><li>明視野観察と緑の蛍光画像を取得できる蛍光顕微鏡を用いたイメージ アメーバ。蛍光グリーンの 474/27 緑色蛍光タンパク質 (GFP) フィルターを使用して、nm、525/45 nm 励起と放射、それぞれ。(開口数 ≥0.3) の対物レンズが 10 倍を使用して、アメーバをイメージします。 注: 寒天のカルセイン AM 蛍光グリーン チャンネルで蛍光死んでアメーバが発生します。健康なアメーバは蛍光以外の場合です。</li>
	<li>集録時間位相コントラストの光毒性を制限し、像の強度のダイナミック レンジを最適化する GFP チャンネルを調整します。必要に応じて差動干渉の対照 (DIC) の位相コントラストに置き換えて。 注: は、可能であれば位相差顕微鏡および GFP 蛍光の 100-200 ms のエクスポー ジャーを使用します。実験全体を通じてそのまま露出と計測器の設定をしてください。これはホスト殺害のインデックスを計算するために重要です。</li>
	<li>殺害インデックス計算ホスト良いの統計情報を取得するために、少なくとも 100 のアメーバ細胞のイメージを取得します。</li>
</ol>7. 画像解析とホスト殺害インデックス
<ol><li>ImageJ を用いた画像解析を実行します。</li>
	<li>ファイルをクリックして ImageJ で位相コントラストの画像ファイルを開く |オープンイメージを選択するとします。画像をクリックすると、しきい値を調整 |分析 |しきい値。強度ピーク (図 3A) のみを選択する上限と下限のしきい値を調整します。</li>
	<li>プロセスをクリックして、画像をバイナリに変換 |バイナリ |バイナリを作る。プロセスを選択することで穴を埋める |バイナリ |穴を埋める。 注: は、ソースとして、図 1のイメージを使用して、手順 7.1 7.2 暗い領域 (図 3B) としてアメーバや細菌の表面接続が表示されます、画像が生成されます。</li>
	<li>分析で面積と平均グレー値のボックスを確認 |測定の設定。メイン ツールバーの [楕円] ツールを選択することで、アメーバのおおよそのサイズを測定します。[分析 |測定と代表的なアメーバの領域に注意してください。</li>
	<li>分析をクリックして、アメーバのマスクを作成 |粒子の分析。[サイズ] ボックス、アメーバが含まれますが、細菌を除外する領域を入力します。オプションを表示ドロップ ダウン メニュー バーでマスクを選択します。マネージャーに追加] ボックスがチェックされていることを確認します。</li>
	<li>[Ok]と表示だけアメーバと ROI マネージャー] ダイアログが表示されます (図 3C) イメージをクリックします。</li>
	<li>ファイルを使用して蛍光画像を開く |オープンし適切なファイルを選択します。Shift キーを押し、リスト (図 3D) の各地域をクリックするROI マネージャーですべての地域を選択します。</li>
	<li>ROI マネージャーでメジャーボタンをクリックします。これは、各アメーバの平均強度の値を表示する結果ウィンドウが開きます。</li>
	<li>各アメーバの蛍光値を表計算プログラムにコピーし、蛍光のすべての値の平均を取ることによってインデックスを殺害ホストを計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、膿で病原性を試金する迅速・定量法について説明します。このプロトコルは、他の細菌テスト可能性があります。ただし、成長媒体がアメーバの成長条件と互換性があることを留意することが重要です。特に、我々 は細菌の成長媒体として PS:DB を使用してプロトコルを最適化してきました。その他のメディアを使用している場合、細菌細胞培地が、アメーバと互換性があることを確認するために存在がない成長メディアのみ制御を実行する必要があります。
このメソッドは、病原性の成長の位相依存性を試金するために拡張できます。特に、固定の時点ではなく倍の広い範囲の細菌文化を育てることができます。我々 の経験で成長段階に依存する病原性膿が表示されます特定の時間ポイントで細菌文化を収穫することが重要です。ペトリ皿の成長の 6-8 時間の間膿における病原性が誘導されたことを観察した.
生育環境に関連付けられている多くの変数は、ホストのヘルスと細菌の病原性に影響します。したがって、適切な正と負のコン...

細菌感染は、人間と動物の1,2の死亡率の主要な原因のひとつです。文化やバイオ フィルム中の細菌の毒性を測定する能力は、医療と研究の設定で重要です。ここでは、細菌の病原性を定量化する汎用性の高い、迅速かつ比較的簡単な方法をについて説明します。真核生物キイロタマホコリカビ(アメーバ) は、ホストのモデル有機体として使用されます。D. キイロタマホコリカビは、緑膿菌(P. aeruginosa)3,4,5その他細菌6,7 病原性因子を同定するホストとして使用されています ,8タイプ III 分泌9,10を含む哺乳類の細胞を殺す病原因子が同じ主に影響を受けやすい。D. キイロタマホコリカビを使用して前の病原性アッセイは、時間3,4、5のコース上D. キイロタマホコリカビの細胞と細菌の長期暴露を関与しています。ここでは、プロトコルこのアメーバを使用して病原性を決定する急速な手法を提案します。(図 1) このプロトコルを記述する方法: (1) axenically (細菌の不在) のアメーバを成長、(2) 試金のための細菌の成長, (3) 細菌の準備、顕微鏡、(4) のホスト細胞を落射蛍光顕微鏡を実行および (5) アメーバの分析蛍光。
アメーバ最初凍結する在庫からを縞になる、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の芝生上に成長した、アメーバが胞子を作り出します。これらの胞子が選ばれ、無菌成長用濃縮培地に接種します。細菌の病原性の評価のための細菌と混合する準備ができるまで、栄養豊富な条件で無菌の成長を通じて、アメーバが維持されます。生存率や、アメーバの死は、カルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン (カルセイン AM) で、細胞内エステラーゼによって切断され、蛍光11,12の活性化により、蛍光を測定することによって定量化されます。強調したに対し、ライブ アメーバがほとんど、あるいはまったく蛍光を展示し、死細胞蛍光激しくないです。この結果は、ほとんどあるいは全く健全なアメーバと定款にカルセイン AM 定款と胸の谷間強調したアメーバ13で基板の原因です。この現象は、特に哺乳類セル11,14,,1516カルセイン AM 蛍光から区別されます。
細菌の病原性を評価することは、別に栽培しています。ここでは、膿の日和見病原体の病原性を測定し、浮遊性 (水泳) および表面接続型のサブ集団の病原性を定量化する方法について詳しく説明する方法をについて説明します。このプロトコルは、他の細菌の病原性をテストに適応させること。病原性表面接続型セルでアクティブにされ浮遊性細胞では低いことを示す代表結果セクションで以前13に報告しました。表面接続型の病原性活性化膿は、非病原性の浮遊性細胞が、アメーバによって消費されている間にアメーバを殺します。浮遊性細菌の病原性は試金されるだけ、細菌がプロトコルで説明されているようにペトリ皿を使用するのではなく、普通の培養管で培養することができます。
アメーバや膿文化の成長は、膿の文化、アメーバは定常状態の栄養豊富な条件で育っている間目的の成長フェーズに到達するように調整しなければなりません。この状態は通常、細菌と混合されるとき、少なくとも 1 日前に希釈するアメーバ文化を必要です。アメーバや細菌寒天パッドを使用して固定、1 h の共同培養、低解像度 (10 X 開口数 0.3) 客観的、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をフィルターして撮像カメラを使用してイメージを作成します。分析は、ImageJ の自由に利用できるソフトウェアを使用して実行することができます。 または、画像解析ソフトをカスタマイズします。我々 の分析は、科学的な分析パッケージ13を使用して作成された独自のソフトウェアを使用して行った。ソフトウェア位相コントラストを使用してマスクを作成し、蛍光画像のマスクされた領域から蛍光値を抽出.蛍光値の少なくとも 100 の細胞、数値ホスト殺害のインデックスの結果を平均値します。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot < 1 mL and keep at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>カルセイン-アセトキシメチルエステル (カルセイン-AM)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>C34852</td><td>カルセインアセトキシメチル (AM)</td></tr><tr><td>塩化カルシウム、無水</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-グル</td><td>コース フィッシャーケミカル</td><td>D16500</td><td>デキストロース</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド シグマ-アルドリッチ</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>葉酸</td> シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>特殊ペプトン</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性七水和物</td>フィ<td>ッシャーケミカル</td><td>S373</td><td></td></tr>ビタミン<tr><td>B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryapornラボ</td><td>Strain AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn</td>ラボ<td>株B / r17</td><td></td></tr><tr><td>緑膿菌</td><td>Siryapornラボ</td><td>PA14</td><td>PA14株19</td></tr><tr><td>緑膿菌&デルタ;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14 由来の strain20</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;mフィルター&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>SCGPT01RE</td><td>フィルター滅菌用</td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15 mL</td><td>コーニング</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製収納ボトル</td><td>パイレックス</td><td>13951L</td><td>250 mL、500 mL、1000 mL</td></tr><tr><td>シャーレ、直径 6 cm</td><td>コーニング</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm ポリスチレンプレート</td></tr><tr><td>シャーレ、直径 10 cm</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>FB0875712 100 x 15 mm ポリスチレンプレート</td></tr><tr><td>蓋付きプラスチック容器</td><td>ジップロック</td><td>2.57E+09</td><td>角型3カップ容器</td></tr><tr><td>ガラスプレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1653308</td><td>寒天パッドの準備に。他のガラス板も同様の寸法で使用することができます。</td></tr><tr><td>木の棒</td><td>フィ</td><td>ッシャー23-400-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>MEA53100</td><td>顕微鏡のセットアップ</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1対物レンズ&nbsp; 0.3 NA</td><td>ニコン</td><td>MRH20101</td><td>顕微鏡のセットアップ</td></tr><tr><td>蛍光励起光源</td><td>Lumencor</td><td>Sola 光エンジン</td><td>顕微鏡のセットアップ</td></tr><tr><td>蛍光フィルターセット</td><td>セムロック</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp;</td><td>顕微鏡のセットアップ</td></tr><tr><td>オルカフラッシュ4.0 V2カメラ</td>浜<td>松77054098</td><td></td><td>顕微鏡のセットアップ</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>画像解析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>画像解析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>オービタルシェーカーインキュベーター</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>37°Cでのバクテリアの増殖用;C</td></tr><tr><td>プラットホームのシェーカー</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-687-700</td><td>22 >C</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>アンダーカウンター冷蔵インキュベーター</td><td>フィ</td><td>ッシャー97990E</td><td>22°Cでのアメーバの成長用;C</td></tr><tr><td>Isotempウォーターバス&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー15-462-21Q</td>冷却<td>媒体を55°Cにするため。ハ</td></tr></tbody></table>

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

伝統的な細菌の病原性アッセイは、宿主細胞に数時間にわたって細菌の長期暴露を含みます。この時、細菌はホスト生育環境への暴露と宿主細胞の存在のための生理学の変更を受けることができます。細菌が宿主細胞の存在下で成長する範囲を最小限にする細菌の病原性の状態を迅速に測定するアッセイを開発しました。細菌やアメーバ一緒に、寒天のパッドを使用して単一画像平面に固定化しました。手順は、ホスト細胞の健康の指標としてカルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン エステル (カルセイン AM) と単一細胞の蛍光イメージングを使用します。宿主細胞の蛍光は、落射蛍光顕微鏡による細菌の宿主細胞の露出の 1 時間後に分析されます。画像解析ソフトを使用して、ホスト殺害のインデックスを計算します。このメソッドは、浮遊性と表面に接続された緑膿菌の病原性を測定するために使用されていますバイオ フィルム形成の初期段階でのサブ集団と他の細菌とバイオ フィルムの成長の他のステージに適応があります。このプロトコル病原性を測定する迅速で堅牢な方法を提供し、成長と哺乳類セルラインの維持に関連する複雑さの多くを回避できます。病原性表現型を用いてここでアメーバもマウスのマクロファージを使用して検証されています。特に、このアッセイは、膿が付着 upregulates 病原性を確立する使用されました。

育った野生型膿ひずみ PA1419または ΔlasR 6 cm 径シャーレで同じ PA14 背景に20をひずみし、浮遊性および表面接続型細胞の病原性を検定します。文化は、PS:DB 文化、彩度を 37 ° C でローラー ドラムの培養管で一晩栽培にシングル コロニーから接種、PS:DB、100 rpm で揺れ 6 cm 径シャーレで 8 h の成長と浮遊性表面接続に 1: 100 を希釈膿のサブ集団は、セクション 3 で説明したように分離されました。
表面接続型野生型膿が死亡アメーバ、ラウンド アメーバ細胞の形およびカルセインの蛍光 (図 4A左上のパネル) の観測によって示されました。これは高...

ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

この方法は、宿主を殺す病原性エフェクターが細菌細胞でいつ発現するか、表面付着したインプラント細胞の病原性状態は何かなど、細菌の病原性分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速で定量的であり、宿主細胞の取り扱いが比較的容易であることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Pseudomonasの表面付着型インプラント亜集団が異なる宿主殺傷表現型を持っていることに気付いたときでした。テキストプロトコルで概説されているように、大腸菌株BRを一晩で成長させ始めるには。次に、大腸菌の培養物を室温に戻します。木の棒を使用して、アメーバを750リットルの培養物に無菌化します。すぐに700リットルのアメーバ大腸菌混合物をGYPプレートに加えます。プレートを傾けて、培養物をプレートの表面に均等に広げます。次に、プレートを高湿度を維持するボックスに入れます。ボックス内のプレートを22°Cで4〜5日間インキュベートします。潜伏期間が終了したら、滅菌ピペットチップを使用して、プレートの半分からアメーバ胞子を採取します。次に、ピペットを上下に動かして、アメーバをピペットチップに1 mLのPS培地に再懸濁します。接種混合物を、抗生物質抗真菌溶液を添加した25 mLのPS培地を入れた250 mLフラスコに移します。.アメーバを22°Cで100rpmの回転シェーカーで成長させます。緑膿菌を一晩培養した後、6cmのシャーレでPSB培地で培養液を希釈します。次に、37 Cで100 rpmに設定されたベンチトップローテーターで培養物を振盪します。まず、250 mLフラスコにDBバッファー中の1%寒天50 mLを電子レンジで入れます。15mLの溶融寒天にAMカルシウム15Lを加え、穏やかに混ぜます。12×10cmのガラス板に溶かした寒天を流し込み、室温で10分間固化させます。次に、金属製の定規と印刷されたグリッドを使用して、固化した寒天パッドを1.5 x 1.5 cmの小さなセクションにカットします。ゲルが使用できる状態になるまで、ゲルが水分を保ったままであることを確認してください。次に、表面に付着した細胞を分離するために、ペトリ皿から液体培地を取り出します。次に、1 mLの現像バッファーで皿を洗浄し、浮遊性細胞を除去します。表面付着細菌細胞の病原性を測定するには、以前に得られた表面付着細菌細胞から10 Lのアメーバ細胞を添加します。浮遊性細胞を単離するには、培養物の10 Lを新鮮なシャーレに移します。次に、10 Lのアメーバ細胞を以前に得られたプランクトン性細菌と混合することにより、プランクトン性細胞の病原性を分析します。すぐに小さな寒天パッドを、ペトリ皿の表面にある適切なバクテリアアメーバ混合物の上に置きます。次に、余分な液体を静かにピペッティングして余分な液体を取り除き、皿を20分間乾燥させます。皿を蓋で覆い、室温でさらに40分間インキュベートします。最後に、蛍光顕微鏡を使用して、少なくとも100個のアメーバ細胞の画像を取得します。このプロトコルでは、プランクトン性および表面付着性緑膿菌細胞の病原性をアッセイした。表面付着した野生型Pseudomonas aeruginosaは、丸いアメーバ細胞形状とカルセイン蛍光の存在で示されるアメーバを殺しました。浮遊性細胞と比較して、表面付着した野生型Pseudomonas aeruginosaは高い宿主殺傷指数を持っていました。プランクトン細胞は、非晶質アメーバ細胞の形状で示されるアメーバによって消費され、カルセイン蛍光は比較的少なかった。この手順を試みる際には、カルセインAM細胞とアメーバ細胞の新鮮なストックを使用し、アメーバの光学密度を綿密に追跡することを忘れないでください。この手順に続いて、転写プロファイリングなどの他の方法を実行して、プランクトン性亜集団と表面付着亜集団でどの遺伝子が活性化されるかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、迅速な画像ベースの病原性アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

a-rapid-image-based-bacterial-virulence-assay-using-amoeba

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Chen, Y. ほか。 カエノラブディティス・エレガンスモデルにおけるエアロモナス感染の病原性と病因の評価。 J. Vis. Exp. (2018年)。このビデオでは、栄養が限られた液体環境でのミミズの生存率を測定し、細菌の病原性を評価するために用いられる C. elegans のAeromonasを用いた液体毒性アッセイを実演しています。このアッセイは 、C.

C. elegans液体毒性アッセイを用いた細菌病原性の評価

出典: ペリンバム、K.、シリャポーン、A.アメーバを用いた迅速画像ベースの細菌病原性アッセイ。 J. Vis. Exp.

表面誘発細菌病原性をスクリーニングするための迅速画像ベースのアッセイ

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

我々は競争によって媒介される細菌を監視するための定性分析を記述...

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

我々は内膜破裂を追跡するための方法を説明することは細胞内細菌によって誘発...

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

アメーバ共培養は、選択的アメーバおよびマクロファージなどの食細胞に耐え細胞内病原体を成長させるために接着性アメーバを用いた細胞培養系である。したがって、新たな感染性病原体を発見するための重要なツールを表しています。アメーバ濃縮は、新たアメーバ種とそれらの特異的な細胞内細菌の発見を可能にする。...

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

ここでは、巨大ウイルスの新しいアスファルウイルス関連系統であるファウストウイルスの新しい遺伝子型の特性評価のためのウイルス分離における最新の進歩について説明します。このプロトコルは、ウイルス、特にアメーバに感染する巨大ウイルスのハイスループット単離に適用できます。...

用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

この手順では、 Acanthamoeba spp .運動。...

アカントアメーバ属の定量化運動

大 腸菌 細胞侵入の定量および可視化のためのアミカシン保護アッセイ

学ぶ細菌の病原性測定法。Dictyostelium discoideumアメーバを宿主として用い、蛍光顕微鏡で1時間で宿主殺傷効果を定量的に評価する。Pseudomonas aeruginosaなどの浮遊菌と表面付着菌の異なる病原性状態を迅速に解析できる。

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

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