ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS) のためのショウジョウバエ幼虫サンプル準備-メタボロミクスをベース

この方法は、腫瘍代謝産物L2-ヒドロキシグルタル酸が健康な細胞でどのように合成されるかなど、代謝分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、ユーザーが100種類以上の代謝物を高感度で再現性のある方法で直接測定できることです。一般に、このメソッドを初めて使用する人は、プロトコルが効率的なサンプル処理を必要とし、水蒸気に非常に敏感であるため、苦労します。

プロトコールを開始するには、事前に調製した幼虫を含む1.5ミリリットルのチューブに、氷冷した0.9%塩化ナトリウム1ミリリットルを加えます。蓋を閉め、チューブを垂直にひっくり返して幼虫をよく洗い、チューブを氷の上に30秒間置きます。幼虫はチューブの底に沈みますが、酵母は懸濁液のままになります。

すべての幼虫が緩いペレットを形成したら、1ミリリットルのピペットを使用して塩化ナトリウム溶液を取り出します。サンプルを2, 000 gで摂氏4度で1分間遠心分離します。200マイクロリットルのピペットを使用してすべての残留溶液を除去し、サンプルを液体窒素で直ちに凍結します。

エタノールプルーフマーカーを使用して、2ミリリットルのスクリューキャップビーズチューブの側面にラベルを付けます。次に、0.01ミリグラムを正確に測定できる分析天びんを使用して、標識されたビーズチューブの質量を風袋化します。長い鉗子を使用して、液体窒素デュワーから1.5ミリリットルのサンプルチューブを取り出します。

ニトリル手袋を着用し、凍結したチューブをつかんで反転させ、チューブの蓋をベンチトップに強く叩きつけて、凍結したペレットを取り除きます。すぐにペレットを風袋引き済みの2ミリリットルのスクリューキャップビーズチューブに注ぎます。サンプルは、内因性代謝経路が再活性化されないように迅速に処理する必要があります。

幼虫ペレットとビーズチューブの合計質量を迅速に測定します。すぐにサンプルチューブを液体窒素に入れます。サンプルチューブをマイナス20°Cのベンチトップクーラーに入れます。

ハク酸1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む0.8ミリリットルの予冷済み90%メタノールを加えます。サンプルをマイナスの20°Cのベンチトップクーラーに戻します。コハク酸D4酸1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む0.8ミリリットルの予冷済み90%メタノールを空のビーズチューブに追加して、ネガティブコントロールを設定します。

次に、摂氏4度の温度制御室に設置されたビーズミルホモジナイザーを使用して、サンプルを毎秒6.45メートルで30秒間均質化します。均質化されたサンプルをマイナス20°Cのベンチトップクーラーに戻し、クーラーをマイナス20°Cの冷凍庫に少なくとも1時間移します。インキュベート後、チューブを20, 000gで摂氏4度で5分間遠心分離し、得られた沈殿物を除去します。

上清の600マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、沈殿物を乱さないでください。すべてのサンプルチューブを開き、真空遠心分離機に入れます。すべての溶媒が除去されるまで、サンプルを室温で乾燥させます。

乾燥したサンプルをマイナス80°Cで保存した場合は、未開封のサンプルチューブを真空遠心分離機に入れ、30分間乾燥させます。無水ピリジン中に40ミリグラム/ミリグラムの塩酸メトキシルアミン塩酸塩、またはMOXの溶液を調製します。MOXとピリジンをデシケーターに保管します。

次に、ヒートガンを使用して、1ミリリットルのガラス製シリンジを約5秒間乾燥させます。シリンジの針を無水ピリジンのボトルに挿入します。1ミリリットルのピリジンを取り出し、40ミリグラムのMOXが入ったマイクロチューブに加えます。

プロトコルのこの部分は、水に非常に敏感です。すべての試薬は、使用前にデシケーターに保管する必要があります。さらに、ユーザーは、サンプルが大気中の水蒸気への曝露が最小限であることを確認する必要があります。

次に、無水ピリジンのボトルをアルゴンで洗い流します。ボトルを密封し、デシケーターに戻します。MOXをピリジンに溶解するには、チューブを35°Cのサーマルミキサーで600rpmで10分間インキュベートします。

次に、乾燥サンプルに無水ピリジン溶液中の40マイクロリットル/ミリグラムMOXを40マイクロリットル加えます。サンプルを10秒間ボルテックスし、短時間遠心分離します。次に、サンプルをサーマルミキサーでインキュベートします。

粒子物質を除去するために、サンプルを20、000gまたは最大速度で5分間遠心分離します。25マイクロリットルの上清を、250マイクロリットルの不活性化ガラスマイクロボリュームインサートを備えたオートサンプラーバイアルに移します。1%TMCSを含む40マイクロリットルのMSTFAを追加します。

オートサンプラーバイアルにキャップをかぶり、クリンパーツールでバイアルを密封します。サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートし、250rpmで振とうします。最後に、注入直前にロボットオートサンプラーを使用して、事前に調製した脂肪酸メチルエステル標準試料(FAMES)溶液を3マイクロリットルのオートサンプラーバイアルに加えます。

乳酸デヒドロゲナーゼ変異幼虫のガスクロマトグラフィー質量分析は、対照幼虫と比較して、乳酸、ピルビン酸、およびL2-ヒドロキシグルタル酸に有意な変化を示します。このプロトコールで生成されたGC-MSスペクトルは、多くの目に見える特徴と、通常、幼虫サンプルで最大のピークを表すトレハロースの顕著なピークを示しています。主成分分析(PCA)は、ノックアウトグループと野生型グループが互いに分離し、どちらのグループにも外れ値がないことを明確に示しています。

この手順を試行する際は、ホモジナイズ前にサンプルを凍結し、手順全体を通してすべての試薬を乾燥状態に保つことを忘れないでください。