Name: その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶパラフィン埋め込み大人サンゴのその場でハイブリダイゼーション法。RNA発現を可視化し、組織特異的遺伝子発現パターンを解析します。無脊椎動物研究への応用も可能です。

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この作品賞によって資金が供給されたないです。バローズ Wellcome 基金ポスドク濃縮プログラムから国立科学財団海洋科学員と賞の no.1012629 を介して OCE 1323652。

1. パラフィンの除去
注意: は、ヒューム フードの下で次の手順を実行します。
<ol><li>100% キシレン 10 分ガラス Coplin jar のボンネットの下に薄切切パラフィン埋め込まれたスライドを dewax します。キシレン溶けるプラスチック プラスチックの Coplin jar ファイルは使用しないでください。Coplin jar ファイルは使用する前にオートクレーブで滅菌します。</li>
	<li>次のように 4 つの滅菌ガラス Coplin jar を準備: エタノール 60%、70% エタノール 80% エタノール 100% エタノール。RNase フリー水とエタノールで希釈します。<ol>
<li>100% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーして 10 分間浸します。10 分後ガラス Coplin jar を空にして新しい 100% エタノールに置換します。10 分のために再度スライドを浸します。</li>
		<li>1 分 80% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。</li>
		<li>1 分の 70% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。</li>
		<li>1 分 60% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA プローブの交配の準備のためのスライドの前処理
<ol><li>指定がなければ、常温で次の洗浄を実行します。低速で軌道シェーカーで常温洗浄を実行します。最大 5 つのスライドのための部屋とスライドの洗浄用滅菌スライド メーラーを使用します。</li>
	<li>スライドをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 18 ml 滅菌スライド メーラーに転送します。室温で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>1 × PBS を注ぐし、すぐにプロティナーゼ K 組織の浸透をプローブを有効にするとスライド上組織を扱います。プロテイナーゼ K 溶液約 18 mL を加えるスライド メーラー (溶液濃度を操作するためのテーブル 1を参照)。37 ° c 15 分間インキュベートします。手ふれしません。<ol>
<li>スライドをインキュベートすると、prehybridization (Prehybe バッファー) を準備します。10 分間、沸騰水浴中 Prehybe バッファーを配置し、5 分の氷浴で冷却します。Prehybe バッファーのレシピ、表 1を参照してください。</li>
		<li>プロティナーゼ K ソリューションを注ぐことによってプロティナーゼ K 反応の消化を停止し、すぐにスライド メーラーに 0.2% グリシン PBS 溶液 18 mL を追加します。室温で 5 分間座ってスライド メーラーをしましょう。</li>
		<li>0.2% グリシン PBS 溶液を注ぐ、2 x 生理食塩水クエン酸ナトリウム (SSC) 液 18 mL を各スライドのメーラーに追加します。2 スライドを洗う 100 150 rpm で振とうしながら室温で 10 分間 x SSC。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RNA プローブの交配の準備でスライドの prehybridization
<ol><li>2 スライドを水洗い、x SSC、新しい滅菌スライド メーラーを取得、約 18 mL の Prehybe バッファーを入れてスライド メーラー。交配温ハイブリダイゼーション オーブンにスライド メーラーを配置します。 注: 通常 50-60 ° c. の範囲が使用されているプローブの交配温度が異なります</li>
	<li>2 × SSC と場所を注ぐ 2 x SSC 洗浄が完了すると、1 h のハイブリダイゼーション オーブンで Prehybe バッファー内スライド メーラー内のスライド。</li>
</ol>4. RNA プローブの交配
<ol><li>スライドは、ハイブリダイゼーション オーブンで Prehybe バッファーとインキュベートは、交配のプローブ ソリューションを準備します。<ol>
<li>各プローブの交配バッファー (0.5 μ L プローブの交配バッファーの 24.5 μ L) で希釈します。 注: 交配バッファーのためのレシピは、表 1にあります。トレーラー ・ ノウルズらのプローブの準備と濃度の例を見つけることができます。11。</li>
		<li>12 分、86-90 ° C 熱ブロックに希薄化後のプローブを配置し、氷の上の 1 分のクールな。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ハイブリダイゼーション オーブンからスライド メーラーを削除し、個別に滅菌ピンセットを使用してスライドのメーラーからスライドを削除します。ペーパー タオルの上に平らのスライドを置き、慎重に組織サンプルの周囲に余分な Prehybe バッファーを拭き取る。サンプルに触れないように気をつけて、ティッシュ サンプルの乾燥を防ぐためにすぐに仕事。</li>
	<li>PAP ペンで組織を取り囲みます。ピペット希釈プローブ溶液の 25 μ L を適用し、プラスチック coverslip のサンプルをカバーします。<ol>
<li>4 x SSC + チャンバーの底に 50% ホルムアミド ソリューションとスライドの水分室にサンプルを配置します。</li>
		<li>プローブは、すべてのスライドに追加されている、一度交配温度 50-60 ° C で 24 時間少なくともハイブリダイゼーション オーブンにスライドの水分室を配置します。インキュベーション時間プローブの濃度によって異なりますが、24 時間以上にする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>希薄化後のプローブで一晩インキュベートした後に、ハイブリダイゼーション オーブンからスライドの水分室を削除します。<ol>
<li>それぞれの組織がずれないように注意しながら、スライドから coverslips を削除します。1000 μ L ピペットで 2 x SSC ソリューションの 1000 μ L を追加し、スライドを優しく洗い流してください。</li>
		<li>2 x SSC 溶液室温で 5 分間の 18 ml 滅菌スライド メーラーにスライドを配置します。ソリューションを注ぐし、新鮮な 2 の 18 mL 交換 x SSC。穏やかな揺れで部屋の温度で 5 分間インキュベーションを繰り返します。</li>
		<li>2 x SSC ソリューションを注ぐ。室温で 18 mL 1 x SSC ソリューションと 5 分間洗浄を追加します。1 の x SSC ソリューションを注ぐし、新鮮な 1 の 18 mL 交換 x SSC。穏やかな揺れで部屋の温度で 5 分間インキュベーションを繰り返します。</li>
		<li>1 を注ぐ x SSC。振ることがなく 42 ° C で 18 mL 0.5 x SSC と 10 分の洗浄を追加します。SSC と置換 x 0.5 を注ぐそれ新鮮な 0.5 ml の 18 x SSC。振ることがなく 42 ° C で 10 分間のために再度洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA プローブの可視化
注: プローブを視覚化、BM 紫は開発プロセス中に使用されます。ただし、この手順の前に、いくつかの洗浄は汚損のためにサンプルを準備する必要。
<ol><li>1 分 MgCl2 MgCl2、ap 通信バッファーを注ぐし、1 x ベーリンガーインゲルハイム マンハイムでマレイン酸バッファーで希釈バッファーの妨害の 18 mL を追加せず、18 ml のバッファー アルカリフォスファターゼ (ap 通信バッファー) のスライドを洗ってください。穏やかな揺れでスライド メーラーに室温で少なくとも 1 時間インキュベートします。 注: ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファーとマレイン酸バッファー使用された既成し、掘る洗浄やブロック バッファー設定で購入 (利用可能な商業的)。<ol>
<li>また、4 ° C で一晩培養が行えます。もはやブロック期間は非特異的結合の外観を軽減します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ml 希釈掘るアンチ ジゴキシゲニン AP Fab 断片の (抗 DIG 抗体 = 抗 DIG 抗体 + 20 mL 1 ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファー x 2 μ L)。これは、1 プラスチック製のスライド メーラーでの使用に十分です。このソリューションの詳細は、1 つ以上のスライド メーラーを使用する場合に準備されなければなりません。</li>
	<li>新しい滅菌スライド メーラーに抗 DIG 抗体を追加し、スライドを抗 DIG 抗体溶液をスライド メーラーに転送します。穏やかな揺れで 3 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、抗 DIG 抗体を注ぐし、穏やかな揺れで 5 分 MgCl2 AP バッファーの 18 ml スライド メーラーでスライドを洗います。</li>
	<li>MgCl2、 ap 通信バッファーを注ぐ、18 mL の AP バッファーを追加します。穏やかな揺れで 5 分間洗浄します。5 分インキュベーション後 AP バッファーを離れて注ぎ、18 ml の新鮮な AP バッファーの交換および穏やかな揺れで 5 分間洗浄します。</li>
	<li>暗闇の中、ap 通信バッファーを注ぐし、スライド メーラーに BM purple の 18 mL を追加します。暗闇の中で室温でスライドを孵化させなさい、開発されているプローブに基づく可視化すべて ½ h. 反応時間が異なります紫発色のチェックします。 注: BM 紫可視化ではなく開発ソリューション可能 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) とニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) を使用します。手順については表 1を参照してください。</li>
	<li>スライドを 18 ml の暗闇の中、室温で 5 分間トリス EDTA (TE) バッファーの新しい滅菌スライド メーラーに転送することによって発色を停止します。</li>
	<li>TE バッファーを離れて注ぎ、スライド メーラーと暗闇の中、1 分間洗浄する 18 mL の RNase フリーの水を追加します。</li>
	<li>水からスライドを削除して、組織の境界に乾燥させる.グリセロール媒体をマウントを追加し、coverslips を置きます。写真は撮影する準備ができているまで、4 ° C でスライドを保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+Change%2C+Human+Impacts%2C+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933(2003).</li>
<li>Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959378014001782">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742(2007).</li>
<li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).</li>
<li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59(2007).</li>
<li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora%3A+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).</li>
<li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+situ+hybridization+protocols%22">In situ hybridization protocols</a>. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).</li>
<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. , Oxford University Press. (1987).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li>
<li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900(2013).</li>
<li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15(2014).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li>
<li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+%28Leucoraja+erinacea%29%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24(2017).</li>
<li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3(2014).</li>
<li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubozoan+jellyfish%3A+an+Evo%2FDevo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルで説明する方法は、医学と進化的発達研究8,9,10,12,17で前作から変更されています。このプロトコルは、保持されているし、パラフィンに埋め込まれた大人のサンゴに DIG 標識 RNA アンチセンス プローブの in situハイブリダイゼーションのニュアンスに焦点を当てください。このメソッドは、パラフィン包埋もサンゴを超えて生物のサンプルを簡単に転送できます。最後に、このメソッドを実行できる日中のサンゴ (例えば幼虫) または細胞培養内の異なるライフ ステージがサンプルのこれらのタイプは、必ずしもパラフィン埋め込まれた5,6ではないために、正確な...

サンゴが重要な生態系のビルダーと海洋と人間の健康1,2,3における生物多様性のために重要です。彼らの気候変動とその他の人為的ストレスの脅威の下で、多くのサンゴ種が絶滅危惧と見なされます。したがって、ストレス下でのサンゴを診断する細胞・分子ツールの重要な必要性があります。また、そこは少しについて理解される大人のサンゴの組織とほとんど理解したがってこれらの遺伝子の機能の内にある遺伝子。この問題を解決するには、我々 はその場で交配 (っぽい)、一般的に使用するプロトコル人間の医学と進化発生生物学、大人のサンゴのパラフィン埋め込まれた組織サンプルでの使用のために適応しています。この手法は、最も強力な熱ストレスへの暴露などのストレスの多いイベントを受けている大人のサンゴで使用した場合です。ただし、この手法は組織やサンゴのライフ ステージの広い範囲で使用することができ、だけ熱重点を置かれたサンゴ4,6,7に制限されていません。また、cDNA シーケンス情報がある限り、この方法を組織または任意の後生動物の細胞に使用できます。
このメソッドの目的と保存にし、パラフィンに埋め込まれたスライド上に断面大人のサンゴの組織内 RNA プローブを視覚化することです。このメソッドは、大人のサンゴの組織内にある核酸を可視化できる強力な診断ツールです。最初このメソッドは、医療診断のため開発された、発生生物学、進化発生生物学8,9,10等の分野で人気のツールとなっています。ISH はまた非モデル システム、ゲノムで特に重要なメソッドとトランスクリプトーム シーケンス データがありますが、空間の遺伝子発現パターンが知られています。それは興味の遺伝子を表現する細胞や組織と詳細ターゲットを絞った治療アプローチ8,9,10につながることができますを示すことができるための非モデル系診断仕事のためこの手法は強力です 11,12。最後に、この手法は定性的および定量的遺伝子発現データ11と組み合わせればより強力です。
ジゴキシゲニン (DIG) を設計しているすでに研究者の関心のこのペーパーで説明するアプローチになります-標識 RNA プローブ (センスとアンチセンス プローブ) とは今その場でサンプルをプローブの交配を実行する準備ができています。このメソッドを実行するには、対象の各プローブ パラフィンティッシュ サンゴの 2 つの連続切片を必要となります。1 つのセクションは、意味プローブとアンチセンス プローブ使用されます。センス プローブは、非特異的結合を示すコントロールになります。染色センス プローブで観察される場合、は、アンチセンス プローブは興味の RNA に固有ではありません。プローブは、任意の遺伝子の表現を設計できます。このプロトコルでは熱ストレス下のサンゴの中に表現される検出された以前のいくつかの例が使用される: FBJ マウス骨肉腫ウイルス遺伝子相同物 B (Fos B)、活性化タンパク質 (AP1) と腫瘍壊死因子受容体 41 (TNFR 41)11。DIG 標識 RNA プローブを用いた ISH は取り扱いが多くのより安全な10 のため放射性プローブの使用より優先されます。さらに、この手法は、機密性が高いと組織と熱ストレス アダルト サンゴ13,14,15,16を超えて胚の広い範囲で実行することができます。

<table><tbody><tr><td>デンハルトの溶液</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld アルカリホスファターゼ緩衝液</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>スライドメーラー</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld アルカリホスファターゼ緩衝液</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - リン酸緩衝生理食塩水 (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水、10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>UltraPure Salmon</td><td></td></tr><tr><td>Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>スライド ホワイト アペックス 優れた接着剤</td><td>ライカ バイオシステムズ</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 溶液、pH 7.4</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K、分子グレード、2 mL</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>スーパー パップ ペン リキッド ブロッカー</td><td>プロメガ</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG 抗ジゴキシゲニン-APFab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Σ-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>豚腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>キシレン、AR (ACS)、組織学的使用</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE</td><td>バッファーVWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>VWR</td><td>97005-252、97005-254</td><td></td></tr>オー<tr><td>ビタルシェー</td><td>カーVWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

サンゴは海の全体的な健康だけでなく、人間の健康に欠かせない重要な海洋無脊椎動物です。海水の温度上昇や海洋酸性化など人間活動の影響、ためサンゴが、ますます脅威にさらされています。これらの課題に取り組む、細胞および分子生物学の進歩は、サンゴの健康を診断するために重要であると証明しています。人間の薬でよく使用される技術のいくつかを変更すると、サンゴを付けて治療する研究者の能力が大幅に向上。これに対処するため人間の医学と進化発生生物学で主に使用されるその場で交配のためのプロトコルは、ストレスの下で大人のサンゴで使用に適応されています。
このメソッドの目的は、パラフィンに埋め込まれているされており、スライド ガラス上に断面を有する成人のサンゴ組織における RNA プローブの空間表現を視覚化することです。このメソッドは、サンプルの退避とパラフィンの除去、サンプル、前ハイブリダイゼーション インキュベーション、RNA プローブの可視化と RNA のプローブの交配の透過性を確保するためのサンプルの前処理について説明します。これは、場所特定の遺伝子の表現し、プロトコルは他の非モデル生物のために容易に適応することができますを発見する非モデル生物を用いた強力な方法です。ただし、メソッドは限られた表現強度可視化ステップとプローブの濃度の間に使用されている時間の量によって異なるため、それが主に質的です。さらに、忍耐が必要、このプロトコルは、最大 5 日 (および多くの場合より長い) によって使用されているプローブを取ることができます。最後に、非特異染色が一般的でが、この制限を克服することができます。

このプロトコルを完了すると、細胞や関心の RNA プローブを表現している組織の同定が得られます。このプロトコルの代表的な結果は、AP-1、FosB、および TNFR41 です。これらの結果は、以前トレーラー ノウルズら刊11RNA のショー空間表現は、熱ストレスにさらされた大人のサンゴにプローブします。染色の種類の 2 つの例は図 1に示した。図 1 aは、びまん性組織染色の例です。汚れが特定のセルでだけでなく、組織全体であります。ここでは、対策をした意味 AP 1 の式は表皮と口腔 gastrodermis11 (図 1 a) で発見されます。染色には、ディフューズ ライト、および 1 つの特定のセル型に分離ですが。このタイプの染色では、結果のいくつかは、非特定の染色のためかもしれ...

このプロトコルの目標はパラフィンに埋め込まれているされていると、スライド ガラス上に断面採取したサンゴ大人上の in situハイブリダイゼーションを行うことです。これはパラフィン包埋組織の RNA アンチセンス プローブの空間表現を視覚化するために使用する質的研究法です。

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

この方法は、どの種類の組織や細胞が特定の種類の遺伝子を発現するかなど、サンゴ細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、RNA発現に関する視覚情報が得られることです。この方法は、成体サンゴの空間的遺伝子発現に関する洞察を提供するだけでなく、サンゴの他の生活段階や他の無脊椎動物システムでも使用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、追跡すべき手順と解決策が非常に多いため、苦労するでしょう。そのため、プロトコルのどの段階にいるかに注意を払い、洗濯を行う際には時間をしっかりと把握する必要があります。私の研究室の技術者であるKevin Rodriguezがこの手順を実演します。まず、100%キシレンを含む薄い切片パラフィン包埋スライドをガラスのCoplinジャーに10分間ボンネットの下で脱ろうします。次に、4つの滅菌ガラスCoplinジャーにそれぞれ100%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、60%エタノールを入れます。まず、スライドを100%エタノールを含むCoplinジャーに移し、10分間浸します。次に、スライドを100%エタノールを含む別のCoplinジャーに移します。このプロセスを各Coplinジャーでエタノール濃度の降順で繰り返します。まず、スライドを18 mLのPBSを入れた滅菌スライドメーラーに移します。次に、スライドを室温で5分間洗います。次に、1容量のPBSを注ぎ、約10 mLのプロテイナーゼK溶液をメーラーに加えます。次に、メーラーを摂氏37度で15分間インキュベートします。スライドがインキュベートしている間に、prehybバッファーを沸騰水浴に10分間入れます。次に、バッファーを氷浴で5分間冷まします。プロテイナーゼK反応による消化を止めるには、プロテイナーゼKを取り出し、メーラーに0.2%グリシンPBS溶液18mLを加えます。次に、メーラーを室温で5分間放置します。この後、グリシンPBS溶液を取り除き、18mLの2x生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)と交換します。スライドをSSCで室温で10分間、100〜150RPMで振とうしながら洗浄します。スライドがハイブリダイゼーションオーブンでインキュベートしている間に、ハイブリダイゼーションバッファーでプローブを希釈します。次に、希釈したプローブを摂氏86〜90度のヒートブロックに12分間置き、氷の上で1分間冷却します。次に、スライドメーラーをハイブリダイゼーションオーブンから取り外し、滅菌ピンセットで各スライドを取り外します。スライドをペーパータオルの上に置き、組織サンプルの周りの余分な緩衝液を慎重に取り除きます。PAPペンを使用して、各組織サンプルの周りに円を描きます。次に、ピペットを使用して25マイクロリットルの希釈プローブ溶液を塗布し、各サン

in-situ-hybridization-techniques-for-paraffin-embedded-adult-coral

Research

JoVE Journal

Environment

環境

マウス組織からのデータ収集を最大にするために異なる技術の組み合わせが提示される。...

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、...

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる...

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

イメージング技術の統合スイートは、カリブ海サンゴMontastraeaのannularis及びM.におけるポリープの形態および組織構造を決定するために適用されているfaveolata。蛍光、シリアルブロック面、及び二光子共焦点レーザー走査顕微鏡は、葉状構造、ポリープの壁、推定色素胞および藻密度および分布を同定した。...

マルチモーダル光学顕微鏡法カリビアン·リーフビルサンゴにポリープの組織形態と構造を明らかに

このプロトコルは、シプンキュラス・ヌダス・コエロミック流体中の標的遺伝子のmRNA発現レベルおよび空間パターンを検出するための、その場合のハイブリダイゼーションアプローチに有効であることを説明する。...

シチュヌチュ・ニュードゥス・コロミック流体のハイブリダイゼーションで

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ...

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

ここでは、クラゲ クラドネーマにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコールについて述べる。幹細胞マーカーとのホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーションは幹細胞様細胞の検出を可能にし、5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識は増殖細胞の同定を可能にします。一緒に、活発に増殖している幹細胞様細胞を検出することができる。...

ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光In situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識

ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。...

ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス

このプロトコルは、遺伝的多様性を確保し、サンゴ礁の回復努力を支援することを目的として、絶滅の危機に瀕しているサンゴ種からの精子の処理と凍結保存の効率と能力を改善するための半自動化された経路を説明しています。...

バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー

学ぶパラフィン埋め込み大人サンゴのその場でハイブリダイゼーション法。RNA発現を可視化し、組織特異的遺伝子発現パターンを解析します。無脊椎動物研究への応用も可能です。

その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術

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