Name: 新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ 感染葉からのウイルス粒子粗抽出DNAとRNA解析法で、新規植物ウイルスのゲノム同定を行う手法です。差遠心分離とフェノール・クロロホルム抽出を用いて高品質なDNAを得られ、環境ウイルス学における新規DNAウイルス発見に貢献します。

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科学の進歩と技術応用研究プログラム フェーズ II AR 132-053-2; オクラホマ センターによって資金が供給された研究・農業園芸作物のオクラホマ部研究助成プログラム。HongJin 黄博士と NSF (EOS 0132534)、(2P20RR016478-04、1P20RR16478 02 5P20RR15564 03) NIH からの補助金によって支えられた大須バイオインフォマティクスの中核施設に感謝します

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著者が明らかに何もありません。

近年、植物ウイルスなどウイルス様粒子 (VLP) またはウイルス特定 RNA または DNA2,3,44、豊かな自然環境生物多様性を勉強するさまざまな方法を採用されています。 45,46 。これらのメソッドは、NGS とバイオ情報解析が続いています。本研究の目的は、耕された植物の一般的な疾患の病原を見つけることだった。病気は、エンベロープを持たない被膜粒子、565 の bp のフラグメントだけがクローンとして作られた47をされている未知のウイルスの結果であると報じられました。この情報は、仮に属Badnavirus Caulimoviridae家族内にウイルスを割り当てる前の研究者のために十分だった。カンナ カンナ ユリ斑病がこの研究で説明するメタゲノム アプローチを使用して、単一の badnavirus の結果であったという仮説を立てた事前レポートしながら我々 は病気が 2 つ仮 badnavirus 種24によって引き起こされたことを決定しました。したがって、病気の原因物質を発見するメタゲノム アプローチを使用しての強さは我々 は今の状況を識別できる、1 つ以上の原因があるかもしれません。
我々 のアプローチは、DNA および RNA の配列データを組み合わせることは徹底され、2 つのアプローチを使用して結果が一貫性のある結果が得られた、2 つの関連のウイルスの存在を確認した例も示します。我々 は caulimoviruses の分離の変更手順を採用し、ウイルス核酸が濃縮されたウイルスのカプシド内で保護されていたことサンプルを制作します。サービス研究所 DNA シーケンシングを行う契約しました。De novoシーケンスの本質的な概念はその DNA ポリメラーゼに DNA 合成の連続サイクル中にヌクレオチド DNA のテンプレートの繊維にラベルの付いた蛍光灯が組み込まれています。コンティグ組み立て続く ngs コンティグ ウイルスとして識別されたいくつかのコンティグを生産バイオ情報ワークフローに提出されました。2 つのウイルスのゲノム10,24,48,49,50の更なる確証はリボ枯渇 RNA 製剤から得られた RNA シーケンス データのバイオインフォマティクス解析から得た。興味深い結果が DNA および RNA シーケンスによって、シーケンスの人口を回復を学ぶことだった 1 つは、非ウイルスやウイルスの核酸のような分布を提供しました。DNA および RNA シーケンスのシーケンスの < 0.5% はウイルスの起源だった。内ウイルスCaulimoviridae家族に属していたシーケンス 78 82% の人口。DNA および RNA シーケンスから組み立てられたウイルス コンティグを比較すると、両方のデータセットに 2 つの組み立てられたゲノムが発生したことを確認した.
新しいウイルスのゲノムを識別する唯一の DNA の配列を使用しての関心事は、オープンの環状 DNA である badnavirus ゲノムです。我々 はゲノムの不連続性を重複シーケンスがコンティグからゲノムのアセンブリのための障害を示すかもしれないと推測。結果を配列する DNA の最初の検査では、2 つの類似ウイルス ゲノムを明らかにしました。我々 はこれらのゲノムがどちらかは検討されていない種の遺伝的多様性を表す仮説や共同感染同じ表される 2 種植物24。したがって、NGS DNA および RNA シーケンスによって得られるデータセットの集合的なバイオ情報解析には、2 つの完全な長さのゲノムの存在の確認が有効になります。
メタゲノム研究、カリフラワー モザイク ウイルス(CaMV;、caulimovirus)3から DNA を回復する手順に基づく植物ホモジュネートから VLP と核酸を抽出する方法を開発したもう一つの報告があります。このアプローチには、RNA の小説と非栽培植物 DNA ウイルス シーケンスが識別されます。耕された植物の病気の原因物質を発見する本研究で使用される caulimovirus の隔離プロシージャから派生した手順は、派生して自然感染植物24から VLP を抽出するための手順とは異なりです。両方の変更方法の成功は、caulimovirus 分離フレームワーク プロシージャ一般的かもしれない植物ウイルスのメタゲノム研究のための貴重な出発点を示唆しています。

新たな病害はドライブ正しい因果エージェントを特定する新しいツールを開発する研究者です。新規または定期的なウイルス病の最初の報告は、モザイク、リーフ、静脈をクリア、小人症、萎れ、病変、壊死、奇形など一般的に発生する症状や他の症状に基づいています。病気の因果のエージェントが他の汚染病原体と区別するため、新しいウイルスを報告のための標準は適切なホストに伝達し、元ホスト種の健康な植物に接種によって病気を再現します。この方法では制限が多く属植物ウイルスが昆虫または適切なホストしたり、元の宿主への伝送のための他のベクトルに依存しています。この場合、適切なベクターを検索することができます長期化するベクトルの所コロニーを確立する難しさがあります、さらに努力が実験的伝送のプロトコルを考案する必要。成功伝送研究のための条件を達成できない場合、作業を下回る標準新しいウイルス病を報告するため。非常に低価で彼らの自然なホストで発生するウイルス、研究者が研究を遂行するための十分な感染株を維持するために伝播のための代替ホストを指定する必要があります。少数の植物だけに感染するウイルス種のこの株式文化1を成長のための障害することができます。
近年、科学者は、高スループットにより、NGS とメタゲノム アプローチ知られている病気に関係のない場合がありますが、分類学上の種と属に割り当てることが環境に存在するウイルスの配列を明らかにするに多く採用します。2,3,4. 検出および異なる環境で遺伝物質の分類にそのようなアプローチ ウイルス多様性自然の中や特定の生態系にその存在を記述する方法を提供しますが必ずしもを定義するフレームワークを確認していません。明らかな病気の発病。
Badnavirus属は、pararetroviruses のCaulimoviridae家族に属しています。これらのウイルスは、約 7 に 9 kb の円形の二重鎖 DNA のゲノムを持つ図形の被膜です。すべての pararetroviruses は、RNA 中間を介して複製されます。Pararetroviruses はエピソームとして存在し、植物の染色体 DNA5,6の独立した複製。これらのウイルスの集団遺伝的複雑なウイルス集団の野外研究を示します。さらに、植物ゲノムの範囲にわたって高スループット シーケンスによって得られる情報には、非嫡出統合イベントによって植物のゲノムに挿入される badnavirus ゲノム フラグメントの多数の例が発見されています。これらの内因性の badnavirus シーケンスが必ずしも感染症7,8,9,10,11に関連付けられてあります。その後、病の因果剤として新しい badnaviruses を識別するために NGS の使用 episomal ゲノムの個体の多様性だけでなく、内因性シーケンス12,13の発生複雑です。
新規 pararetrovirus ゲノムの検出のない 1 つの最適なパイプライン、病の因果剤としてこれらのウイルスを識別するために 2 つの一般的なアプローチがあります。1 つの方法感染葉から小さな RNA シーケンスを豊かにし、ウイルス genome(s)14,15,16,17を再構成するこれらの系列を組み立てることです。別のアプローチは、ローリング サークル増幅 (RCA) 円形の DNA ウイルスのゲノムの18を増幅します。RCA の成功は、葉と選択した組織にウイルス力価の年齢によって異なります。RCA の製品は制限の消化力を受ける、直接19,20,21を塩基配列のプラスミドにクローニングします。
カンナ黄色モザイク ウイルス(CaYMV) は、badnavirus をゲノムの 565 の bp フラグメントだけがずっと以前に感染したカンナ22から分離したカンナ、黄斑疾患の病因として記載されています。ゲットウにともなって(開花ジンジャーの CaYMV 識別の現代的な研究CaYMV-Ap)23。本研究の目的は、感染したカンナ ユリから完全な badnavirus のゲノム配列を回復するだった。我々 は工場の汚染物質からウイルスを浄化し、その後この準備からウイルス DNA を隔離するためのプロトコルを記述し、NGS 用 DNA ライブラリを準備します。このアプローチは、中間分子増幅の手順の必要性を排除できます。我々 はまた、RNA シーケンス NGS の感染植物から mRNA を分離各核酸準備を使用して実施された RNA シーケンスが含まれています。組み立てられたコンティグ核酸 (BLASTn) バイオ テクノロジーと情報 (NCBI) の基本的なローカル配列検索ツールのナショナル センターを使用して両方のデータセットのBadnavirus分類群に関連する発見されました。2 つの badnavirus 種24のゲノムを同定しました。

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>ウイルス精製用粉砕バッファー</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>ウイルス精製用粉砕緩衝液</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td>ウイルス精製尿素<td>用粉砕緩衝液</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>ホモジネート抽出&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>X-100</td><td>ホモジネート抽出&nbsp;</td></tr><tr><td>チーズクロス</td><td>VWRラドナー、PA</td><td>21910-107</td><td>フィルターホモジネート&nbsp;</td></tr><tr><td>トリス&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP152-5</td><td>ペレット再懸濁液&DNA再懸濁バッファー&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>ペレット再懸濁緩衝液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>酵素反応を停止</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA 再懸濁緩衝液</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>ビリオンタンパク質を溶解</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>抽出物から細胞DNAを分解</td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>ウイルス DNA沈殿</td></tr><tr><td>実験室用ブレンダー</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>グラインドリーフサンプル</td></tr><tr><td>フロアモデル超遠心分離機&nbsp; &Ti70ローター</td>ベ<td>ックマンコールター、アービングTX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>細胞抽出物の分離</td></tr><tr><td>フロアモデル遠心分離機とJA-14ローター</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>369001</td><td>細胞抽出物の分離</td></tr><tr><td>マグネティックスタープレート</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>一晩で尿素をサンプルに混合</td></tr><tr><td>ゴム警察官</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>ウイルスペレットを溶解</td></tr><tr><td>&nbsp;2100 bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>DNAおよびRNAの品質および量の高感度検出</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>2100 BioanalyzerでDNA品質を移動、染色、測定するために使用されるマイクロ流体チップ</td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>中間手順でのDNA/RNA品質の分析</td></tr><tr><td>プラントトータルRNA分離キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>RNaseフリー水</td>用RNAを分離&nbsp;<td>VWR</td><td>10128-514</td> NGS RNA濃縮器スピンカラム<td>のためのDNAおよびRNAの再懸濁</td></tr><tr><td>Zymo</td><td>Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA除去キット</td>のためのRNAの準備 <td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>RNAのためのRNAの準備</td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>&nbsp;RNA&nbsp;濃縮システム</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>RNA-seq Agarose用RNA調製</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16500100</td><td>手順の中間ステップでのDNA/RNA品質のゲル分析</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>サーモフィッシャー 15585011</td><td></td><td>アガロースゲル染色</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 コンピテントセル</td><td>プロメガ、マディソン、ウィスコンシン</td><td>A3610</td><td>クローンゲノムフラグメント</td></tr><tr><td>pFU Taq ポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td>M7741</td><td>PCR ウイルスゲノム</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>プロメガ</td><td>U1511</td><td>PCR ウイルスゲノム増幅</td></tr><tr><td>PCR オリゴヌクレオチド</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>カスタムオーダー</td><td>PCR ウイルスゲノム増幅</td></tr><tr><td>Miniprep DNA精製キット</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>シーケンシング前のプラスミドDNA精製</td></tr><tr><td>PCRクリーンアップキット</td><td>Promega</td><td>A9281</td> pDRAW32ソフトウェアACAClone<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>をクローニングするためのPCR製品の準備環状DNAとモチーフのコンピュータ解析</td></tr><tr><td>MEGA6.0ソフトウェア</td><td>MEGA</td><td></td><td>分子進化遺伝学解析</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade;リボグリーン&貿易;RNAアッセイキット</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>RNA量の蛍光測定</td></tr><tr><td>GS Junior&trade; パイロシーケンシングシステム</td><td>ロシュ</td><td>5526337001</td><td>シーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>GS ジュニアチタンEmPCRキット(Lib-A)</td><td>ロシュ</td><td>5996520001</td><td>エマルジョンPCR用試薬</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR ビーズ回収試薬</td><td>ロシュ</td><td>5996490001</td><td>エマルジョンPCR</td></tr><tr><td>用試薬GS Junior EmPCR試薬(Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>エマルジョンPCR用試薬</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCRオイル &ブレイキングキット</td><td>ロシュ</td><td>5996511001</td><td>エマルジョンPCR用試薬</td></tr><tr><td>GS Jr チタンシークニックキット*</td><td>ロシュ</td><td>5996554001</td><td>シーケンシング試薬、酵素、バッファー、パッキングビーズを含む</td></tr><tr><td>GS Jr. チタンピコタイタープレートキット</td><td>ロシュ</td><td>5996619001</td><td>シーケンシングプレートと関連試薬およびガスケット</td></tr><tr><td>IKA Turrax ミキサー</td><td></td><td>3646000</td><td>Turraxと併用する特殊ミキサーチューブ</td></tr><tr><td>IKA Turrax チューブ(専用ミキサー)</td><td></td><td>20003213</td><td>エマルジョン作成用内部ローター付き専用ミキシングチューブ</td></tr><tr><td>GSネブライザーキット</td><td>ロシュ</td><td>5160570001</td><td>ライブラリー調製時に使用する核酸サイズ分画装置</td></tr><tr><td>GSジュニアemPCRビーズカウンター</td><td>ロシュ</td><td>05 996 635 001</td><td>ライブラリービーズカウンター</td></tr><tr><td>GSジュニアビーズデポジションデバイス</td><td>ロシュ</td><td>05 996 473 001</td><td>遠心分離中のピコタイタープレート用ホルダー</td></tr><tr><td>カウンターウェイト&ビーズ蒸着装置用アダプター</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>ピコタイタープレート遠心分離装置と蒸着装置のバランスをとるために使用</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>装置を制御し、データを収集および分析するためのソフトウェアスイート</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(上記項目05 996 643 001に含まれる)</td></tr> <tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(上記05 996 643 001に含有)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(上記05 996 643 001に含有)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(上記05 996 643 001に含有)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(上記05 996 643 001に含有)</td></tr></tbody></table>

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの rna の解析とウイルス粒子粗抽出 dna の結合解析

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

このメタゲノム アプローチは、環状 DNA ゲノムを持つ植物ウイルスとそのトラン スクリプトを識別するために使用されます。機械的に別のホストに再接種することはできませんまたはそのホストで低価で発生する植物 DNA ウイルス頻繁伝染性材料の大きい価を達成するために伝達が困難です。感染した葉は、最適な pH とイオン組成ほとんど被膜パラ レトロ ウイルスを浄化するためお勧めします穏やかなバッファーの地です。尿素は、ウイルス粒子をトラップ封入体を分割する、細胞成分を溶解するために使用されます。さらに差動遠心分離は植物の汚染物質からのウイルス粒子の分離を提供します。プロテイナーゼ K 処理、カプシドを削除します。その後、ウイルス DNA は集中、次世代シーケンサー (NGS) の使用します。NGS データは生成された dataset にウイルスの配列のサブセットを識別する NCBI BLASTn を投稿されたコンティグをアセンブルに使用されます。並列パイプラインの RNA は標準の列に基づく RNA 抽出法を用いて感染葉から分離されます。その後、リボソーム枯渇は mRNA およびウイルスの転写産物のサブセットを豊かにする行われます。RNA シーケンス (seq RNA) から派生した組み立てシーケンスは、このデータセットにウイルスの配列のサブセットを識別する NCBI BLASTn を堤出されました。我々 の研究では、2 つのデータセットの 2 つの関連のフルレングス badnavirus ゲノムを識別されます。植物ウイルスのゲノム配列を再構成する小さな rna の総人口を抽出する別の一般的なアプローチのこのメソッドお勧めします。この後者のメタゲノム パイプライン回復ウイルス関連シーケンス レトロ-議事録の作成要素は、植物ゲノムに挿入されます。これは、さらに積極的に感染性病原体を識別する生化学的または分子アッセイと結合されます。この研究に記載されているアプローチは、可能性が高いアクティブなウイルスに感染しているウイルスを複製する代表的なシーケンスを回復します。

この変更されたウイルスの精製法は、ウイルス Dna NGS とバイオインフォマティクスによる 2 つのウイルス種を識別するのに役立ちますの濃縮を提供されます。磨砕液は 2.5 時間 40,000 × g で遠心分離後、管の下部に緑のペレットと長さに沿って白いペレットがあった。緑餌は 1 つの遠心管に再停止され、白いペレットは 2 つの遠心管に再停止されます。PCR は標準、CaYMV PCR 診断のプライマーを使用して遂行し、可溶化された白いペレット, 緑のペレット (図 1A) ない物が検出されました。124-133 nm の長さ (図 1B) を測定被膜粒子観察し、粗野な準備のサンプル透過型電子顕微鏡により調べた。ほとんどの badnaviruses の予測されたモーダル長さ以内です。DNA は白と緑のペレットから抽出され、別々 に再停止されます。図 1C、緑から抽出した DNA の 5 μ L を読み込むと白いペレット サンプル (緑の割合のための DNA の 1.6 μ g)、白、分数の DNA の 3.1 μ g 0.8% の agarose ゲルの電気泳動と次の臭化エチジウム DNA を分析染色。緑の分数には、白い小数生産低分子量 DNA (図 1C) と同様、高分子量 DNA の 2 つのバンドに対し低分子量 DNA が含まれています。100 V で 40 分間図 1Cに示したゲルを実行し、車線 3 のスミアは明確なバンドを生成するゲルの電圧の下がるべきであることを示唆しています。これらのデータは、白いペレットがウイルス粒子の濃縮だったことを提案します。白のサンプルから抽出した DNA (0.6 μ g/mL) 濃度は低いが、NGS は、10 の最小値を必要とするための十分な続行する DNA の ng。断片化された Dna は、NGS のライブラリを準備する使用されました。
並行して、RNA が RNA シーケンス高スループットは感染したカンナ植物 (図 1D) から抽出されました。標準的なワークフローは、ライブラリの準備、NGS、コンティグを作成して (図 1E) のウイルスのゲノム配列を識別するため行った。出発物質として DNA と RNA を使用してからの出力結果を比較しました。
原油ウイルス準備から分離された DNA を用いた ngs 188,626 生 DNA 読み取りを取得しました。13,269 コンティグに組み立てられた読み取りと BLASTn は塩基配列の NCBI データセットを検索する使用された (Viridplantae TaxID を使用して: 33090 とウイルス TaxID: 制限の生物として 10239) (図 1E)。NCBI BLASTn 結果では、 de novo組み立てコンティグの 93% が細胞系列、22% は不明であったその 0.3% がウイルス コンティグ (図 2A) を明らかにしました。コンティグ細胞系列はミトコンドリアとして識別されたように、分類や葉緑体 DNA の大部分。ウイルス コンティグのデータセット内ウイルス コンティグの 32% (Badnavirus シーケンスではなかった)、 Caulimoviridaeのメンバーに関連していた、これらの 58% に関連していたBadnavirus.ウイルス コンティグの 29% が非常によく似 (e < 1 10-30x) CaYMV 分離 V17 ORF3 遺伝子 (EF189148.1) に、サトウキビ被膜ウイルス分離バタヴィア D、完全なゲノム (FJ439817.1)、バナナ連勝 CA ウイルスゲノム (を完了KJ013511)。この集団内で 2 つの完全な長さのゲノムに似ている長いコンティグがあった。
< 500 跪く Contig アセンブリの長さを読む平均高スループット RNA シーケンス生成 153,488 洗浄個別シーケンス リード 8,243 コンティグまで低下。これらが提出され NCBI BLASTn (Viridplantae TaxID を使用して: 33090 とウイルス TaxID: 制限の生物として 10239) 植物細胞系列、23% のカテゴリに、コンティグの 76% を配置出力は不明であったし、0.1% はウイルス コンティグ (として分類されました。図 2B). ウイルス コンティグの 0.1% の人口の人口を綿密に検討決定これらの 68% がCaulimoviridae (図 2B) に割り当てられました。この集団内で 3 つの大きなコンティグの類似性が高い識別された (10-30X e < 1) CaYMV 分離 V17 ORF3 遺伝子 (EF189148.1)、サトウキビ被膜ウイルス分離バタヴィア D、完全なゲノム (FJ439817.1) およびバナナ連勝CA のウイルス完全なゲノム (KJ013511)。私たち 3 コンティグを調べると、手動でフルレングスのウイルスゲノムを生成するこれらの 2 つに参加。
我々 は、2 つのフルレングスのウイルスのゲノムの存在を確認する相互足場として DNA および RNA シーケンスによって生成されるウイルスのゲノムの長さコンティグを比較しました。1 つのフルレングスのウイルス ゲノム 6,966 の bp だったカンナ関連黄斑ウイルス1 (CaYMAV-1) (図 3A) を仮称します。2 番目のゲノムは 7,385 bp とゲットウにともなって(CaYMV-Ap01) (図 3A) に感染する CaYMV のバリアント。
最後に、各ウイルスのクローン 〜 1,000 bp の断片に設計されたプライマーを用いて差分 9 品種を表す 227 カンナ植物の人口の両方のゲノムを検出します。多くの場合個々 の植物は両方のウイルスに感染しました。12 植物の CaYMAV 1 の CaYMV Ap01 RT-PCR 検出の例を提供しています。これらの 3 つが CaYMV Ap01 は陽性であり (図 3B) 両方のウイルス陽性であった 9。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> 図 1: ウイルス核酸製剤と NGS ワークフロー 。(A) アガロースゲル (1.0%) CaYMV ゲノムの 565 bp PCR のフラグメントの電気泳動。緑餌サンプル (3 車線) ではなく白いペレット (レーン 1、2) から調製したサンプルで 2 つの PCR 産物が検出されました。肯定的な制御 (+) は、感染した植物が標準的な常磁性セルロース粒子を含む自動化された方法を使用して分離された DNA 増幅 PCR の製品を表します。レーン L にはサンプル車線で線形 DNA バンドのサイズを測定するための標準として使用される DNA の梯子が含まれます。閲覧によって感染したカンナの葉の粗分別回収白いペレットの透過電子顕微鏡によるウイルス粒子の (B) の例です。(C) Agarose (0.8%) グリーン (1 車線) から回復 DNA の電気泳動のゲルし、ホワイト (2 車線) ペレット パネル A の PCR によってその陽性レーン 2 の横に赤と黄色のドットは、白の割合で発生する 2 つの高分子量 DNA バンドを識別します。(1%) の (D) には、列に基づく RNA 精製によって回復の総 RNA の電気泳動がアガロースゲルします。レーン L にはサンプル車線で線形バンドのサイズを測定するための標準として使用される DNA の梯子が含まれます。レーン 1-6 には、リボ枯渇と核酸分離、ライブラリの準備、シーケンス、contig アセンブリ、およびウイルスのゲノムの RNA シーケンス (E) スケマティック パイプ ラインのための 1 つのサンプルを集めた感染カンナ葉から分離された RNA が含まれています。発見。<a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> 図 2: アイスランドクローナ グラフ コンティグの分類カテゴリを視覚化します。(A) 粗ウイルス準備から組み立てのコンティグの分類の生息左図のグラフ。右のグラフは、 Caulimoviridae家族、 Badnavirus属および 3 つの密接に関連種に関連付けられているウイルス コンティグの割合を示しています。(B) 左側のパネルは、その分類学的分布に基づく RNA シーケンスから派生したコンティグの豊かさを示しています。右側はCaulimoviridae家族、 Badnavirus属および 3 つの密接に関連種に関連付けられているウイルス コンティグの人口内のコンティグの豊かさを描いたグラフです。<a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> 図 3.CaYMAV 1、CaYMV Ap01 ゲノムのキャラクタリゼーション。カンナ黄色斑紋ウイルス 1 に関連付ける(CaYMAV) とカンナ黄色斑紋ウイルス由来のゲノムに類似の図式化 (A)ゲットウにともなって (CaYMV Ap01).塩基配列の位置 1-10 はゲノムのスタートとして識別され、tRNAに会ったアンチコドン サイトほとんど badnavirus ゲノムの典型的なが含まれています。オープンリーディング フレーム (ORF) 1 と 2 の翻訳の停止と開始位置は、隣接しています。これらの蛋白質がある未知の関数。ORF3 は亜鉛指 (ZnF)、プロテアーゼ (プロ)、逆転写酵素 (RT) と RNAse H ドメインを含む蛋白です。3' 多信号シーケンスは、両方のウイルスのゲノムの保存されています。(B) RT - pcr はウイルスに感染した葉と CaYMAV と CaYMV Ap01 を検出するプライマーから単離した RNA を用いて行った。12 植物の同じ人口で 3 つに感染した CaYMV Ap01 のみ、残りの CaYMAV と CaYMV Ap01 感染していたに対し。肯定的な制御を示します (+) (-) がネガティブ コントロールを示し。この図は、Wijayasekaraらから再現/変更24権限を持つ。<a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

二本鎖 DNA のゲノムを持つ植物ウイルスを識別するために新しいアプローチをご紹介します。我々 は感染葉から DNA や RNA を抽出し、次世代シーケンシングを行う標準的な方法を使用します。Bioinformatic ツールは、コンティグにシーケンスを組み立てる、ウイルスのゲノムを表すコンティグを識別し、分類グループにゲノムを割り当てます。

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

この手法は、新興感染症など、環境ウイルス学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞成分から変異体を精製し、それらの変異体を用いてシーケンシング用のDNAを抽出できることです。私がこのアイデアを最初に思いついたのは、温室内の植物が1種類以上の未知のBadnavirusesに感染していることが判明したときでした。この手法に不慣れな方は、3つの点で苦労すると思われます。第一に、質の高い収量を得るためには、ホモジナイズが極めて重要な工程となります。第二に、分画遠心分離では複数のペレットが生成されることがあり、それらのペレットをどのように識別し、分離させるかを知る必要があります。第三に、バイオアナライザーの結果の解釈も困難な場合があります。本手順のすべての工程において、白衣と手袋を着用してください。まず、-20 °Cで凍結保存しておいた罹病植物の葉を80～100 g切り出します。次に、200 mLの研磨バッファーと0.5%亜硫酸ナトリウムを用いて、Waringブレンダーで葉を粉砕します。得られたホモジネートを1 Lのビーカーに移します。適切な個人用保護具を着用したまま、ホモジネートに18 gramsの尿素と25 millilitersの10%非イオン性界面活性剤を加え、ビーカーをホイルで覆います。マグネチックスターラーを用いて一晩撹拌します。翌日、ホモジネートを250 milliliter遠心機用ボトルに移し、固定角ローターを用いて4000 times g、4 degrees Celsiusで10 minutes間遠心分離します。上清を回収し、4層のチーズクロスでろ過します。回収した液体ホモジネートの容量を測定し、その後、ホモジネートを38.5 milliliterポリプロピレン製遠心チューブに分注します。ホモジネートを40,000 times g、4 degrees Celsiusで2.5 hours間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブの底に緑色のペレットが、またチューブの側面に沿って白色のペレットが存在することを確認します。両方のペレットを保持したまま上清を捨て、サンプルを氷上に置きます。白色ペレットと緑色ペレットを分離することは、本手順において最も困難な工程の一つであり、忍耐と熟練した技術を要します。化学薬品用フード内で、ゴム製のポリシーマンを使用してペレットを分離します。ペレットを掻き出し、異なるローターボトルに転送します。白いペレットが入ったローターボトルを氷上に置きます。各ボトルに1 mLの水を加え、ピペッティングします。1〜2時間かけて、5分ごとに混合物をピペッティングし、ペレットを再懸濁させます。白いペレットの再懸濁が完了した後、懸濁液を4 °Cで一晩保存します。翌日、懸濁液を4°C、6000 ×gで10分間遠心分離し、残りのデブリを除去します。濃縮した懸濁液を新しいチューブに移し、4°C、136,000 ×gで2時間遠心分離してビリオンをペレット化します。上清を除去し、ペレットを1 mLの緩衝液で再懸濁します。まず、ビリオンを溶解させることから開始します。ペレット懸濁液に2 µg/µLのプロテイナーゼK溶液を40 µL加え、37 °Cで15分間インキュベートします。各サンプルに等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、20秒間手で振盪します。室温にて16,000 ×gで5分間遠心分離します。上層の水相を除去し、新しいチューブに移します。この抽出操作を2回以上繰り返します。エタノール沈殿を用いてDNAを濃縮します。0.3 Mの酢酸ナトリウム（pH 5.2）と2.5倍量の95%エタノールを使用してください。サンプルを-20 °Cで30〜60分間静置します。その後、13,000 ×gで10〜20分間遠心分離し、DNAをペレット化します。ラボベンチにて、DNAペレットを1 mLの0.1 mM TEバッファーに再懸濁します。遠心分離を用いて、市販のゲルろ過カラムで懸濁液をろ過します。本文に記載されている通り、エチジウムブロミド染色を用いた1%アガロースゲル電気泳動によりサンプルを解析し、調製物の状態を確認してDNAの品質を評価します。透過型電子顕微鏡で観察したところ、感染したカンナの葉を粗分画して回収した白色ペレット中にウイルス粒子が認められました。緑色および白色ペレットから回収したDNAのアガロースゲル電気泳動により、赤色と黄色の点で示される白色分画中に2本の高分子量DNAバンドが確認されました。感染葉から単離したRNAの完全性は、アガロースゲル電気泳動によっても検証されました。このチャートは、粗ウイルス調製物からアセンブルされたコンティグの量および分類学的分布を示しています。そして、このチャートは、Caulimoviridae科、Badnavirus属に関連するウイルスコンティグの割合、および密接に関連する3つの種に関連するコンティグの割合を示しています。続く2つのチャートは、分類学的分布に基づいたRNAシーケンシング由来のコンティグの存在量を示しています。右側のチャートは、Caulimoviridae科Badnavirus属および3つの近縁種に関連するウイルスコンティグ集団におけるコンティグの存在量を表しています。DNAシーケンシングとRNAシーケンシングによって生成されたウイルスゲノム長コンティグを相互のスキャフォールドとして比較することで、2つのフルレングスウイルスゲノムの存在が確認されました。最後に、ウイルス感染葉から単離したRNAを用いたRT-PCR解析により、両方のウイルスゲノムが検出されました。この手法に習熟すれば2日で完了できますが、初心者の場合は3日かかることがあります。初めてこの手順を行う際は、各上清中のホモジネート量を記録しておくことが重要です。これにより、手順の最後に、最終的なDNA収量を初期の出発材料と比較することができます。この手法の発見により、植物ウイルス学の分野において、研究者が環境中の新規DNAウイルスを同定するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、植物試料のホモジナイズ、バリアントの濃縮、および次世代シーケンシングに使用可能な高収量のDNAを得る方法について十分に理解できるはずです。尿素およびフェノール・クロロホルムを用いた操作は極めて危険であるため、これらの化学物質を取り扱う際は、常にゴーグル、手袋、白衣、およびマスクを着用するなどの予防策を講じてください。安全に超遠心分離を行うには、チューブのバランスを適切に取ることが重要です。そのため、チューブの重量を測定し、重量差を0.01g以内にした上で、ローター内で向かい合わせに配置する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶ 感染葉からのウイルス粒子粗抽出DNAとRNA解析法で、新規植物ウイルスのゲノム同定を行う手法です。差遠心分離とフェノール・クロロホルム抽出を用いて高品質なDNAを得られ、環境ウイルス学における新規DNAウイルス発見に貢献します。

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

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