新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

この手法は、新興感染症など、環境ウイルス学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞成分から変異体を精製し、それらの変異体を用いてシーケンシング用のDNAを抽出できることです。私がこのアイデアを最初に思いついたのは、温室内の植物が1種類以上の未知のBadnavirusesに感染していることが判明したときでした。この手法に不慣れな方は、3つの点で苦労すると思われます。第一に、質の高い収量を得るためには、ホモジナイズが極めて重要な工程となります。第二に、分画遠心分離では複数のペレットが生成されることがあり、それらのペレットをどのように識別し、分離させるかを知る必要があります。第三に、バイオアナライザーの結果の解釈も困難な場合があります。

本手順のすべての工程において、白衣と手袋を着用してください。まず、-20 °Cで凍結保存しておいた罹病植物の葉を80～100 g切り出します。次に、200 mLの研磨バッファーと0.5%亜硫酸ナトリウムを用いて、Waringブレンダーで葉を粉砕します。得られたホモジネートを1 Lのビーカーに移します。

適切な個人用保護具を着用したまま、ホモジネートに18 gramsの尿素と25 millilitersの10%非イオン性界面活性剤を加え、ビーカーをホイルで覆います。マグネチックスターラーを用いて一晩撹拌します。翌日、ホモジネートを250 milliliter遠心機用ボトルに移し、固定角ローターを用いて4000 times g、4 degrees Celsiusで10 minutes間遠心分離します。上清を回収し、4層のチーズクロスでろ過します。回収した液体ホモジネートの容量を測定し、その後、ホモジネートを38.5 milliliterポリプロピレン製遠心チューブに分注します。ホモジネートを40,000 times g、4 degrees Celsiusで2.5 hours間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブの底に緑色のペレットが、またチューブの側面に沿って白色のペレットが存在することを確認します。両方のペレットを保持したまま上清を捨て、サンプルを氷上に置きます。

白色ペレットと緑色ペレットを分離することは、本手順において最も困難な工程の一つであり、忍耐と熟練した技術を要します。

化学薬品用フード内で、ゴム製のポリシーマンを使用してペレットを分離します。ペレットを掻き出し、異なるローターボトルに転送します。白いペレットが入ったローターボトルを氷上に置きます。各ボトルに1 mLの水を加え、ピペッティングします。1〜2時間かけて、5分ごとに混合物をピペッティングし、ペレットを再懸濁させます。白いペレットの再懸濁が完了した後、懸濁液を4 °Cで一晩保存します。

翌日、懸濁液を4°C、6000 ×gで10分間遠心分離し、残りのデブリを除去します。濃縮した懸濁液を新しいチューブに移し、4°C、136,000 ×gで2時間遠心分離してビリオンをペレット化します。上清を除去し、ペレットを1 mLの緩衝液で再懸濁します。

まず、ビリオンを溶解させることから開始します。ペレット懸濁液に2 µg/µLのプロテイナーゼK溶液を40 µL加え、37 °Cで15分間インキュベートします。各サンプルに等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、20秒間手で振盪します。

室温にて16,000 ×gで5分間遠心分離します。上層の水相を除去し、新しいチューブに移します。この抽出操作を2回以上繰り返します。

エタノール沈殿を用いてDNAを濃縮します。0.3 Mの酢酸ナトリウム（pH 5.2）と2.5倍量の95%エタノールを使用してください。サンプルを-20 °Cで30〜60分間静置します。その後、13,000 ×gで10〜20分間遠心分離し、DNAをペレット化します。

ラボベンチにて、DNAペレットを1 mLの0.1 mM TEバッファーに再懸濁します。遠心分離を用いて、市販のゲルろ過カラムで懸濁液をろ過します。本文に記載されている通り、エチジウムブロミド染色を用いた1%アガロースゲル電気泳動によりサンプルを解析し、調製物の状態を確認してDNAの品質を評価します。

透過型電子顕微鏡で観察したところ、感染したカンナの葉を粗分画して回収した白色ペレット中にウイルス粒子が認められました。緑色および白色ペレットから回収したDNAのアガロースゲル電気泳動により、赤色と黄色の点で示される白色分画中に2本の高分子量DNAバンドが確認されました。

感染葉から単離したRNAの完全性は、アガロースゲル電気泳動によっても検証されました。このチャートは、粗ウイルス調製物からアセンブルされたコンティグの量および分類学的分布を示しています。そして、このチャートは、Caulimoviridae科、Badnavirus属に関連するウイルスコンティグの割合、および密接に関連する3つの種に関連するコンティグの割合を示しています。

続く2つのチャートは、分類学的分布に基づいたRNAシーケンシング由来のコンティグの存在量を示しています。右側のチャートは、Caulimoviridae科Badnavirus属および3つの近縁種に関連するウイルスコンティグ集団におけるコンティグの存在量を表しています。DNAシーケンシングとRNAシーケンシングによって生成されたウイルスゲノム長コンティグを相互のスキャフォールドとして比較することで、2つのフルレングスウイルスゲノムの存在が確認されました。

最後に、ウイルス感染葉から単離したRNAを用いたRT-PCR解析により、両方のウイルスゲノムが検出されました。

この手法に習熟すれば2日で完了できますが、初心者の場合は3日かかることがあります。初めてこの手順を行う際は、各上清中のホモジネート量を記録しておくことが重要です。これにより、手順の最後に、最終的なDNA収量を初期の出発材料と比較することができます。

この手法の発見により、植物ウイルス学の分野において、研究者が環境中の新規DNAウイルスを同定するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、植物試料のホモジナイズ、バリアントの濃縮、および次世代シーケンシングに使用可能な高収量のDNAを得る方法について十分に理解できるはずです。尿素およびフェノール・クロロホルムを用いた操作は極めて危険であるため、これらの化学物質を取り扱う際は、常にゴーグル、手袋、白衣、およびマスクを着用するなどの予防策を講じてください。安全に超遠心分離を行うには、チューブのバランスを適切に取ることが重要です。そのため、チューブの重量を測定し、重量差を0.01g以内にした上で、ローター内で向かい合わせに配置する必要があります。